第六章 菌種復(fù)壯衰退及保藏

6.4菌種的衰退、復(fù)壯和保藏性狀穩(wěn)定的菌種是微生物學(xué)工作最重要的基本要求，否則生產(chǎn)或科研都無法正常進行。一、菌種的衰退與復(fù)壯

（一）衰退

1.定義

衰退（degeneration）是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而是某物種原有一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。菌種的衰退是發(fā)生在微生物細胞群中的一個由量變到質(zhì)變的逐步演化過程。菌種原有的典型性狀變得不典型時就稱菌種退化，這種變異也稱負變（minusmutation）。影響微生物菌種穩(wěn)定性的因素：a）變異；b）污染；c）死亡；例如，微生物菌落形態(tài)或個體形態(tài)的變化；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子量減少；色素產(chǎn)生情況的變化；研究菌種遺傳標記的丟失，生產(chǎn)菌種生產(chǎn)性狀的劣化等。2.衰退的原因造成菌種退化的主要原因是基因突變。誤區(qū)生產(chǎn)工藝條件控制不當雜菌污染造成生產(chǎn)性能下降飾變3.衰退的防止（1）選育生產(chǎn)性能穩(wěn)定的菌株作為生產(chǎn)菌株經(jīng)誘變等處理后的菌種要連續(xù)傳代、分離純化，防止分離回復(fù)。（2）控制傳代次數(shù)盡量避免不必要的移種和傳代，并將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的幾率。（3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個適合原種的生長條件，就可在一定程度上防止菌種衰退；例如，給予營養(yǎng)缺陷型適當?shù)臓I養(yǎng)必需成分，可降低回復(fù)突變頻率。（4）利用不同類型的細胞進行接種傳代放線菌和霉菌一般用單核的孢子接種的，菌絲細胞常含有幾個細胞核，甚至是由異核體組成的，用于接種就易出現(xiàn)離異（dissociation）或衰退。例如，構(gòu)巢曲霉如用分生孢子接種易退化；如用子囊孢子接種則不易退化。（5）采用有效的菌種保藏方法菌種保藏的溫度、所用的培養(yǎng)基等可影響自發(fā)突變。（二）菌種的復(fù)壯（rejuvenation）

1.定義狹義的復(fù)壯：是指菌種已發(fā)生衰退后，通過純種分離和測定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。是一種消極的措施廣義的復(fù)壯：在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識地采取純種分離和生產(chǎn)性狀的測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正變個體。是一項積極的措施通過純種分離把退化菌種的細胞群中仍保持原有典型性狀的單細胞分離出來，擴大培養(yǎng)，就可恢復(fù)正常。（1）純種分離法（purecultureisolation）1.復(fù)壯的方法純種分離的方法“菌落純”水平（purecultureincolonylever）“菌株純”水平（purecultureinstrainlever）粗放精細（2）通過宿主體復(fù)壯針對病原菌從典型的病灶部分分離到恢復(fù)原始獨立的復(fù)壯菌株衰退的病原菌接種相應(yīng)的昆蟲或動、植物宿主體內(nèi)活的“選擇性培養(yǎng)基”多次選擇（3）淘汰已衰退的個體

S.microflavus“5406”農(nóng)用抗生菌的分生孢子，采用－10～－30℃的低溫處理5～7天，退化的個體死亡，留下的10％～20％個體是未退化的。二、菌種的保藏菌種（culture，stockculture）是一種極其重要和珍貴的生物資源。菌種保藏（preservation，conservation，maintenance）是一項十分重要的基礎(chǔ)性工作。在一定時間內(nèi)使菌種不死、不變、不亂基本要求：用于長期保藏的原始菌種稱為保藏菌種或原種（stochculture）。任務(wù)：廣泛收集實驗室和生產(chǎn)用菌種、菌株、病毒毒株（有時還包括動、植物的細胞株和微生物質(zhì)粒等），并將它們妥善保藏，使之不死、不衰、不亂，便于研究、交換和使用。國家設(shè)立專門的菌種保藏機構(gòu)1.菌種保藏的原理首先，要挑選典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體進行保藏。其次，創(chuàng)造一個使微生物代謝不活潑、生長受抑制的環(huán)境條件。再次，添加保護劑或酸堿中和劑，避免保藏過程中細胞受傷。2.菌種保藏的方法一種良好的菌種保藏方法保持原菌的優(yōu)良性狀長期穩(wěn)定方法的通用性操作的簡便性設(shè)備的普及性（1）定期移植保藏法操作方法：將菌種接種在斜面、液體或穿刺培養(yǎng)基上，待生長完全后，置普通冰箱4℃保藏，濕度50％～70％以下，棉塞換成不通氣橡皮塞更好。優(yōu)點：方便，不受條件限制，各類微生物均可。缺點：時間短、傳代多、易退化。低溫可減緩生長速度，單細胞仍有一定的活動條件，一般4～6個月必須傳代一次。（2）液體石蠟法操作方法：生長完全的斜面上覆蓋無菌的液體石蠟，液面高于斜面1cm，普通冰箱保藏。加上石蠟可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，也可隔氧，保藏時間1～2年，除石油發(fā)酵微生物外，各類微生物均可使用。注意：石蠟的純度（3）砂土保藏法操作方法：沙和土用酸浸泡去除其中的有機質(zhì)，洗滌中和，干燥，分裝于安瓶管內(nèi)，加塞滅菌，把健壯的孢子懸液滴于砂土中攪拌均勻，真空干燥后封口，置于冰箱或干燥器中。優(yōu)點：低溫、干燥、無氧、無營養(yǎng)，保藏效果好，時間可達幾年至數(shù)十年。缺點：只適用于產(chǎn)孢子的微生物，不能用于保藏營養(yǎng)細胞。（4）冷凍干燥保藏法操作方法：是將液體樣品（含保護劑的菌懸液）在凍結(jié)狀態(tài)下升華其中水分，最后達到干燥。培養(yǎng)物用無菌脫脂牛奶—保護劑制成菌懸液，加入安瓶中，冷凍、抽真空、封口。優(yōu)點：低溫、干燥、無氧、有保護劑，可保藏各大類微生物