第四章 工具酶及應用

1第四章基因工程的工具酶及其應用2TOOLSFORGENECLONINGSCISSORS:RESTRICTIONENZYMESGLUE:DNALIGASEVEHICLE:PLASMIDORVIRALVECTORS3

基因工程的工具酶定義用于DNA或RNA切割和連接的各種酶叫做工具酶。4

“分子剪刀”的發(fā)現(xiàn)者5第一節(jié)限制性核酸內(nèi)切酶限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease，RE)是由細菌自己產(chǎn)生的一種能識別雙鏈DNA中的特定序列，并以內(nèi)切方式水解核酸中磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶。6

在細菌體內(nèi)，這種內(nèi)切酶可以分解外源性的DNA物質(zhì)，例如病毒等；而細菌本身的DNA同一識別序列中的某些堿基被甲基化所保護。這種細菌內(nèi)部的限制與修飾作用分別由核酸內(nèi)切酶和甲基化酶完成，構(gòu)成了類似免疫的防御系統(tǒng)。7解釋何謂內(nèi)切酶

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紅色為外切酶的作用位點，藍色為內(nèi)切酶的作用位點

8限制性核酸內(nèi)切酶的分類目前已發(fā)現(xiàn)的限制性核酸內(nèi)切酶600余種，可分為三大類。Ⅱ類限制性核酸內(nèi)切酶廣泛用于基因工程；特點：識別切割位點比較專一，只有切割作用。無甲基化修飾作用。Ⅰ類和Ⅲ類限制性核酸內(nèi)切酶同時具有內(nèi)切活性和甲基化修飾活性，且識別位點復雜，特異性差，不適用于基因工程。9一.限制性內(nèi)切酶的命名HindⅢH in dⅢ細菌屬名的第一個字母細菌種名的前兩個字母細菌菌株的第一個字母同一菌株中發(fā)現(xiàn)的第三種酶10EcoRIE co RI細菌屬名的第一個字母細菌種名的前兩個字母該酶的基因位于R質(zhì)粒上該菌株發(fā)現(xiàn)的第一種內(nèi)切酶1112二.II型限制酶的識別特點識別專一的核苷酸順序，并在該順序的固定位置切割，識別順序為回文結(jié)構(gòu)。（Palindrome）

客上天然居居然天上客1314EcoRI

PstI

HpaI

5'3'3'-GACGTC--CTGCAG-5'5'3'-GAATTC-5'3'-CTTAAG-5'5'3'3'-GTTAAC--CAATTG-5'stickyend5'粘末端3'stickyend3'粘末端bluntend

平末端三.限制性內(nèi)切酶的切割方式15四.識別位點與切割方式限制性內(nèi)切酶識別序列一般為6個核苷酸，如EcoRI，HindIII，BamHI，居多數(shù)。也有少數(shù)限制性內(nèi)切酶，識別序列為4個、5個、或更多的核苷酸如8個及8個以上，當識別序列核苷酸數(shù)為單數(shù)時，則以中間的核苷酸作為對稱軸。如GTNAC（N代表四種核苷酸）。16一般說來，在DNA分子中，識別序列短的出現(xiàn)概率大，識別序列長的出現(xiàn)概率小。有N個核苷酸的識別序列出現(xiàn)概率為1/4n。如識別4個核苷酸Sau3A，則間隔256（4×4×4×4）個核苷酸就有一次機會出現(xiàn)識別位點。如識別8個核苷酸的NotI，則需間隔65536個核苷酸才有一次機會出現(xiàn)識別位點。17稀切酶：有些酶的識別位點在核苷酸序列中出現(xiàn)的幾率很小，可稱為稀切酶。為了獲得大的DNA片段，需用稀切酶切割。個別限制性內(nèi)切酶可識別兩種以上的核苷酸序列，如AccI既可識別GTATAC，又可識別GTCGAC。18位點偏愛：限制性內(nèi)切酶識別序列兩側(cè)的核苷酸組成與酶切效率有關(guān)，比如NaeI在pBR322質(zhì)粒上有4個識別位點，其中兩個位點可迅速被NaeI切割。第三個位點稍慢。而位于1285處的第四個識別序列，切割的效率只有其他位點的1/15。19同尾酶：兩種酶識別不同的順序，但切割 產(chǎn)生的粘末端相同，叫做同尾酶。同尾酶產(chǎn)生的粘末端，可通過堿基互補連接，形成的位點稱為“雜種位點”，該位點不能再被原來的兩種酶切割。20例：AGATCTGGATCCTCTAGACCTAGGBglⅡBamH

ⅠATCTAGGATCCG連接酶AGATCCTCTAGG21同位酶:識別相同的序列,但切割位點不同.同裂酶:又稱異源同工酶，來源不同,但識別位點和切割位點相同.切割位點也可以不同，例如SamI(CCC↓GGG)和XmaI(C↓CCGGG)22五.限制性內(nèi)切酶的反應條件

反應溫度一般為37oC反應體積20μlDNA含量0.5－1μg酶含量1－2uDNA純度：OD260/280nm>1.7陽離子Mg2+反應時間1-1.5hpH7.523限制性核酸內(nèi)切酶的反應條件各種限制性核酸內(nèi)切酶反應條件相似，主要區(qū)別是對鹽濃度的需求不同。據(jù)此可分為三組低鹽組0～50mmol/LNaCl中鹽組

50～100mmol/LNaCl高鹽組100～150mmol/LNaCl24限制性核酸內(nèi)切酶的星號活性

當酶切條件發(fā)生變化時，限制性核酸內(nèi)切酶的專一性可能會降低，導致同種酶識別多種序列，這種現(xiàn)象稱作限制性核酸內(nèi)切酶的星號活性。25例如EcoRI在正常條件下識別GAATTC,但在低鹽（小于50mmol/L)、高pH（大于8）、甘油大量存在時，識別序列增加了AAATTC、GAGTTC,導致EcoRI在DNA分子上的切割位點大大增加。26第二節(jié)其他工具酶一.DNA聚合酶作用:依據(jù)模版,連接游離的單核苷酸,形成與 模版互補的新鏈。

271.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ

該酶具有三種酶活性

5’→3’DNA聚合活性

3’→5’外切酶活性識別切除錯配的核苷酸

5’→3’DNA外切酶活性285′CCGATA-OH

3′3′GGCTATCGGA

5′CCGATAGCCT3′3′GGCTATCGGA5’→3’DNA聚合酶活性DNA聚合酶ⅠdNTP295′CCGATA-OH3′3′GGC DNA聚合酶Ⅰ 5′CCG 3′GGC＋dA,dT3’→5’外切酶活性302.大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ大片段