靶向PCR CTC檢測技術(shù)

靶向PCRCTC檢測技術(shù)——幫助臨床醫(yī)生更全面地評估肺癌LungCancerinSolidTumorinChina=？液態(tài)活檢通過外周血中的腫瘤細(xì)胞或者腫瘤基因組信息來評估腫瘤病理活檢通過原發(fā)灶腫瘤組織來評估腫瘤CTCctDNAmircoRNALNCRNAOthers

傳統(tǒng)的組織細(xì)胞學(xué)檢測液態(tài)活檢在肺癌中的應(yīng)用治療策略事件肺癌待查輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測治療方案選擇療效評估耐藥機(jī)理新藥研發(fā)治療策略事件疑似肺癌輔助診斷早癌肺癌晚期肺癌癌癥耐藥復(fù)發(fā)監(jiān)測治療方案選擇耐藥機(jī)理新藥研發(fā)CTC的臨床應(yīng)用價值療效評估CTC(數(shù)量）(負(fù)向富集+靶向PCR）ctDNA(基因變異）1、K.Pantel,etal.NatRevClinOncol,2009;2、K.PantelandMR.Speicher,Oncogene2015什么是循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell，CTC）？腫瘤釋放如外周血中CTCs數(shù)量的多少，可間接反應(yīng)腫瘤發(fā)生發(fā)展的功能狀態(tài)CTC：在腫瘤發(fā)生過程中，具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞和不具有干細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞，均由原發(fā)腫瘤脫落釋放入外周血，兩者統(tǒng)稱循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CirculatingTumorCell）CTC1CTC≠有轉(zhuǎn)移：侵入第二器官CTCs，稱之為DTC（disseminatedTumorCell），只有由具有干細(xì)胞特征的DTC所形成的微轉(zhuǎn)移灶，逃避免疫識別才可能發(fā)展成為腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移2第9周的乳腺管組織切片：乳腺管周圍非典型性增生第30周的腫瘤組織切片：新生的腫瘤上皮細(xì)胞形成牙槽并侵襲周圍基質(zhì)CK+cellsHER-2+cells什么時候可以檢測到CTC？早期腫瘤外周血中即可檢出CTCWHe,etal.ProcNatlAcadSci,2007早期腫瘤外周血中即可檢出CTC表達(dá)中等量FR的M109鼠肺癌細(xì)胞通過皮下注射的方式被移植到BALB/c小鼠的背部側(cè)面移植2周后，在小鼠耳部的血管中每分鐘可以檢測到大約1.4個CTC細(xì)胞移植后第3和第4周，則每分鐘可分別檢測7個和18個CTC，隨著腫瘤逐漸增大數(shù)量呈指數(shù)上升在腫瘤移植的前4周內(nèi)，沒有在任何組織切片中發(fā)現(xiàn)到存在轉(zhuǎn)移性癌癥的跡象CTC富集技術(shù)密度與大小免疫磁珠（負(fù)向富集or陽性富集)微流體CTC

檢測方法CTC檢測技術(shù)靶向PCR免疫熒光普通PCR=+“方法”“收獲”“垃圾”蟹餌沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低正向富集優(yōu)勢：純度高劣勢：回收率低（漏掉CTC）幸好沒貪嘴，我們逃了“方法”“收獲”“垃圾”沒水了，我們躲不了了放水負(fù)向富集優(yōu)勢：回收率100%劣勢：純度略低大小富集（ISET）優(yōu)勢：簡單劣勢：漏掉小的CTC細(xì)胞幸好沒吃胖，我們逃了網(wǎng)篩CTC檢測技術(shù)檢測原理肺癌細(xì)胞FR(葉酸受體）高度表達(dá)CTC：FR=1:50萬EMT轉(zhuǎn)化不影響FR豐度其他血細(xì)胞不表達(dá)FRCTC回收率接近100%磁珠富集易操作和自動化靈敏度超高，負(fù)向富集可滿足檢測要求信號二次放大，1個CTC信號放大10^12倍無需人工經(jīng)驗判讀，結(jié)果客觀準(zhǔn)確可實現(xiàn)CTC的定量CTC檢測

靶向PCR，信號放大，保證高度敏感性

1個CTC信號放大1012倍CTC檢測優(yōu)勢一：陰性富集不丟失循環(huán)腫瘤細(xì)胞優(yōu)勢二：靶向探針特異性高優(yōu)勢三：PCR擴(kuò)增信號，確保高敏感性優(yōu)勢四：PCR儀判斷CTC技術(shù)，避免人為誤差3mL血1mL/3mL血3mL血1個CTC/3mL血50萬FR/1個CTC1個CTC/1slide100萬信號/1個FR1個信號/1個CTCFR靶向PCR——1個CTC細(xì)胞信號方法10^12倍（萬億倍）細(xì)胞免疫熒光——1個CTC細(xì)胞信號幾乎沒有放大CellSearch:正向富集+免疫熒光技術(shù)進(jìn)行捕獲和鑒定EpCAM–上皮細(xì)胞粘附分子APC–異藻藍(lán)蛋白熒光染料CK–細(xì)胞角蛋白PE–藻紅蛋白熒光染料DAPI–4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA熒光染料）上皮細(xì)胞白細(xì)胞抗EpCAM磁流體EpCAM抗原CD45抗原CK抗原抗CD45-APC染料抗CK-PE染料熒光染料16EpCAM陰性細(xì)胞中，存在大量CTCCellResearch系統(tǒng)主要使用EpCAM（上皮粘附分子）做為探針

研究證實，EpCAM陰性的細(xì)胞中也存在CTCJiataoLou,etal.PlosOne20132004CellSearch:乳腺癌中檢測出，但肺癌敏感性低2011CellResearch:采用的抗體(EpCAM)對EMT細(xì)胞特異性差，而肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移入血需要EMT的過程3mL血→6個小時→得到報告檢測流程肺癌領(lǐng)域，CTC檢測技術(shù)對比CytoploRare?（格諾）CellSearch?CyttelTM（北京萊爾）CanpatrolTM（益善）CTC-Biopsy?（武漢友之友)核心技術(shù)免疫磁珠負(fù)向富集靶向配體PCR技術(shù)

流式正向富集技術(shù)熒光標(biāo)記免疫磁珠負(fù)向富集、Fish技術(shù)ISET（濾膜）原位雜交RNA分析ISET（濾膜)熒光標(biāo)記特異性88%80%83%75%70%靈敏度80%30%腺癌：46%30%30%自動化半自動全自動半自動半自動全自動血樣體積3mL7.5mL4mL5mL10mL適應(yīng)癥早、中和晚期肺癌晚期乳腺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌晚期肺癌、胰腺癌、乳腺癌晚期癌腫晚期癌腫早期（I期）敏感性67%0%20%(2/10)未報道未報道中晚期敏感性89%25%（22/87)61%-88%30%40%報告時間6h/12樣本6h/8樣本48h/1樣本48h/1樣本3天可視化否是是是是不同CTC計數(shù)對于肺癌診斷的特異性與敏感性CTC計數(shù)診斷肺癌敏感性診斷肺癌特異性2.09