生物化學(xué)實驗復(fù)習(xí)總結(jié)資料(全)

生化實驗五大技術(shù)分光光度技術(shù)1.定義：根據(jù)物質(zhì)對不同波長的光線具有選擇性吸收，每種物質(zhì)都具有其特異的吸收光譜，而建立起來的一種定量、定性分析的技術(shù)。圖1-1光吸收示意圖2.基本原理：圖1-1光吸收示意圖透光度T=It/Io吸光度A=lg(Io/It)朗伯-比爾(1ambert-Beer)定律:A＝KLc【K為吸光率，L為溶液厚度（cm），c為溶液濃度（mol/L）】摩爾吸光系數(shù)ε：1摩爾濃度的溶液在厚度為1cm時，在某一特定波長下的吸光度。c=A/ε3.定量分析：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線(工作曲線)法（2）對比法（3）計算法：c=A/ε（4）差示分析法（適用于濃度過濃或過?。?）多組分混合物測定4.技術(shù)分類分子吸收法&原子吸收法；可見光（400~760nm）&紫外光（200～400nm）&紅外光（大于760nm）分光光度法；應(yīng)用方向有機(jī)物成分分析&結(jié)構(gòu)分析——紅外分光光度法測定人體內(nèi)的微量元素——原子吸收分光光度法電泳技術(shù)1.定義：帶電荷的供試品在惰性支持介質(zhì)中，在電場的作用下，向其對應(yīng)的電極方向按各自的速度進(jìn)行泳動，使組分分離成狹窄的區(qū)帶，用適宜的檢測方法記錄其電泳區(qū)帶圖譜或計算其百分含量的方法。

2.基本原理：球形質(zhì)點(diǎn)的遷移率與所帶電量成正比，與其半徑及介質(zhì)粘度成反比。ν=Q/6πrη3.影響電泳遷移率的因素：電場強(qiáng)度：電場強(qiáng)度大，帶電質(zhì)點(diǎn)的遷移率加速溶液的pH值：溶液的pH離pl越遠(yuǎn)，質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷越多，電泳遷移率越大溶液的離子強(qiáng)度

：電泳液中的離子濃度增加時會引起質(zhì)點(diǎn)遷移率的降低電滲：在電場作用下液體對于固體支持物的相對移動稱為電滲技術(shù)分類：自由電泳（無支持體）區(qū)帶電泳（有支持體）：濾紙電泳（常壓及高壓）、薄層電泳（薄膜及薄板）、凝膠電泳（瓊脂、瓊脂糖、淀粉膠、聚丙烯酰胺凝膠）等電泳分析常用方法及其特點(diǎn)：小分子物質(zhì)——濾紙、纖維素、硅膠薄膜電泳復(fù)雜大分子物質(zhì)——凝膠電泳（1）醋酸纖維素薄膜電泳①這種薄膜對蛋白質(zhì)樣品吸附性小，消除紙電泳中出現(xiàn)的“拖尾”現(xiàn)象②分離速度快，電泳時間短③樣品用量少④經(jīng)過冰醋酸乙醇溶液或其它透明液處理后可使膜透明化，有利于對電泳圖譜的光吸收掃描測定和膜的長期保存→特別適合于病理情況下微量異常蛋白的檢測（胰島素、溶菌酶、胎兒甲種球蛋白）瓊脂糖凝膠電泳①瓊脂糖凝膠孔徑較大，對一般蛋白質(zhì)不起分子篩作用②瓊脂糖凝膠彈性差，不適合管狀電泳→用于等電聚焦、免疫電泳、血清脂蛋白等蛋白質(zhì)電泳，以及DNA、RNA、核苷酸的分析聚丙烯酰胺凝膠電泳①可調(diào)節(jié)孔徑大?、跈C(jī)械強(qiáng)度好，有彈性③分辨率高，用途廣④無電滲→用于不同分子量蛋白質(zhì)的電泳分離SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳該種電泳使蛋白分子相對遷移率(Rf)的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對數(shù)和相對遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的分子量→最常用定性分析蛋白質(zhì)的電泳方法，特別用于蛋白質(zhì)純度檢測&分子量測定等電聚焦電泳技術(shù)利用有pH梯度的介質(zhì)分離等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)→由于其分辨率可達(dá)0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點(diǎn)不同的蛋白質(zhì)組分，適合研究蛋白質(zhì)的微觀不均一性毛細(xì)管電泳①高靈敏度②高分辨率③高效快速④樣品少⑤成本低→符合對多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等生物大分子的分離條件層析技術(shù)固定相：固體物質(zhì)或者是固定于固體物質(zhì)上的成分；流動相：可以流動的物質(zhì)，如水和各種溶媒1.原理：當(dāng)待分離的混合物隨流動相通過固定相時，由于各組份的理化性質(zhì)存在差異，與兩相發(fā)生相互作用（吸附、溶解、結(jié)合等）的能力不同，在兩相中的分配（含量對比）不同，而且隨流動相向前移動，各組份不斷地在兩相中進(jìn)行再分配。與固定相相互作用力越弱的組份，隨流動相移動時受到的阻滯作用小，向前移動的速度快。2.技術(shù)分類：①按層析原理分類：名稱名稱分離原理吸附層析法組份在吸附劑表面吸附，固定相是固體吸附劑，各能力不同分配層析法各組份在流動相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑結(jié)和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離②按操作形式不同分類：名稱名稱操作形式柱層析法固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿著一個方向前移而達(dá)分離薄層層析法將適當(dāng)粘度的固定相均勻涂鋪在薄板上，點(diǎn)樣后用流動相展開，使各組份分離紙層析法用濾紙作液體的載體，點(diǎn)樣后用流動相展開，使各組份分離薄膜層析法將適當(dāng)?shù)母叻肿佑袡C(jī)吸附劑制成薄膜，以類似紙層析方法進(jìn)行物質(zhì)的分離3.層析法的特點(diǎn)與應(yīng)用①根據(jù)層析峰的位置及峰高或峰面積，可以定性及定量；②析法與光學(xué)、電學(xué)或電化學(xué)儀器連用，可檢測出層析后各組份的濃度或質(zhì)量，同時繪出層析圖；③層析儀與電子計算機(jī)聯(lián)用，可使操作及數(shù)據(jù)處理自動化，大大縮短分析時間；④分辨率高、靈敏度高、選擇性好、速度快→適用于雜質(zhì)多、含量少的復(fù)雜樣品分析，尤其適用于生物樣品的分離分析應(yīng)用方向柱層析、薄膜層析（以硅膠/氧化鋁為吸附劑）——分離非極性或極性不強(qiáng)的有機(jī)物離子交換層析——分子量相對較小的球狀蛋白的分離純化紙層析——氨基酸、糖類、肽類、抗生素的分離排阻層析——分離純化、分析生物大分子尤其是蛋白質(zhì)親和層析法——適用于蛋白質(zhì)的分離純化氣象層析——氨基酸、脂肪酸、單糖、雙糖、固醇類物質(zhì)的分離，多肽、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測定離心技術(shù)1.定義：利用旋轉(zhuǎn)運(yùn)動的離心力，以及物質(zhì)的沉降系數(shù)或浮力密度的差別進(jìn)行分離、濃縮和提純的一項操作。2.基本原理：利用轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時所產(chǎn)生的強(qiáng)大離心力，加快顆粒的沉降速度，把樣品中不同沉降系數(shù)或浮力密度差的物質(zhì)分離開。顆粒在離心力場下的沉降情況都與沉降速度和沉降時間相關(guān)，沉降時間和速度取決于：(1)離心力；(2)顆粒的大小、形狀和密度；(3)沉降介質(zhì)的密度和粘度。3.離心形式：(I)離心過濾：在有孔轉(zhuǎn)鼓的離心機(jī)中通過過濾介質(zhì)分離懸浮液的過程為離心過濾。(2)離心沉降(或澄清)：利用固液兩相比重的差異在離心機(jī)無孔轉(zhuǎn)鼓或管子中進(jìn)行懸浮液沉降分離者為離心沉降(如用于凈制含少量固體的液體時也稱離心澄清)；(3)離心分離：利用不同溶質(zhì)顆粒在液體各部分分布的差異，分離不同比重液體的過程為離心分離。【離心過濾、離心沉降同屬固-液分離，離心分離則屬液-液分離】應(yīng)用方向普通離心機(jī)——物質(zhì)的分離&提取高速離心機(jī)——對樣品中的懸浮物質(zhì)進(jìn)行高純度的分離、濃縮、精制、提取，多用于血液、細(xì)胞、蛋白質(zhì)、病毒、激素等的分離制備超速離心機(jī)——既可以分離細(xì)胞的亞細(xì)胞器，也可以分離生物大分子酶學(xué)技術(shù)酶活性：即酶促反應(yīng)速度，指在規(guī)定條件下單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量（注：在實際測定酶促反應(yīng)速度時，以測定單位時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為好）。影響酶活性的因素：酶濃度、底物濃度、溫度、PH、抑制劑、激活劑、時間Km值的應(yīng)用①鑒定酶的種類②反映酶與底物的親合力（Km值越大，酶與底物親合力越?。圻x擇酶的最適底物④計算不同底物濃度時酶促反應(yīng)速度相當(dāng)于最大反應(yīng)速度的比率⑤設(shè)計適宜的底物濃度Vmax值的應(yīng)用用來計算酶的轉(zhuǎn)化率（TN），即單位時間內(nèi)每分子酶可使底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)的分子數(shù)酶學(xué)分析在臨床診斷上的應(yīng)用（1）在肝臟疾病診斷中的應(yīng)用（2）在急性心肌梗死診斷中的應(yīng)用（3）在急性胰腺炎診斷中的應(yīng)用（4）在骨骼疾病診斷中的應(yīng)用（5）在肌肉疾病診斷中的應(yīng)用（7）在前列腺疾病診斷中的應(yīng)用（8）在腫瘤診斷中的應(yīng)用生化經(jīng)典驗證性實驗《胰酶對蛋白質(zhì)的消化和影響酶作用的因素》實驗原理：①白明膠（膠片上蛋白質(zhì)，黑色）胰酶肽或氨基酸（無色）【以底片上白明膠的水解程度說明胰酶活性的高低】②酶的活性受到酶濃度、底物濃度、溫度、pH、抑制劑、激活劑、時間等影響實驗操作：取試管4支，標(biāo)上序號→按順序加入所需試劑→混勻、水?。A(yù)熱）→放入底片（全部浸沒）→水?。ㄩg歇搖動試管）→立即記錄褪色時間(完全或部分）①酶濃度對酶活性的影響（以酶濃度作為變量）：在其他條件不變的情況下，當(dāng)[S]》[E]時,V與[E]成正比關(guān)系。②溫度對酶活性的影響（先置于溫度100°、40°、0°、0°→1~3號管放回40°保溫）：在其他條件不變的情況下，一定范圍內(nèi)增加溫度，酶反應(yīng)速度升高；超過一定的溫度范圍以后再增加溫度，酶反應(yīng)速度下降【最適溫度不是酶的特征性常數(shù)】③pH對酶活性的影響（pH分別為5.0、7.0、10.0）：pH通過影響酶或底物的電離狀態(tài)，可影響酶的催化活性?！咀钸mpH不是酶的特征性常數(shù)】④抑制劑對酶活性的影響（分別加入NaCl、HgCl2、空白試劑）：胰蛋白酶的抑制劑有重金屬離子Hg2+，其與酶結(jié)合使酶活性降低或失活。注意事項：①在研究一種因素對酶的活性的時，需要嚴(yán)格的控制反應(yīng)中其他因素保持不變，只能改變要研究的某一種因素。②掌握好水解程度是本實驗的關(guān)鍵之一。③HgCl2有毒，操作時要格外小心，嚴(yán)防中毒。血清蛋白醋酸纖維素薄膜電泳實驗原理：①以醋酸纖維素（醋酸纖維素薄膜電泳具有微量、快速、簡便、分辨力高，對樣品無拖尾和吸附現(xiàn)象等優(yōu)點(diǎn)）為電泳支持物，在pH8.6的巴比妥緩沖液中，血清蛋白全部帶負(fù)電荷，在直流電場中向正極移動，移動速度與蛋白質(zhì)所帶電荷成正比，與顆粒大小成反比。120V電泳45min后，用氨基黑10B染色，可將血清依次分為清蛋白（最遠(yuǎn)）、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白②洗脫法定量：血清蛋白組分的相對百分?jǐn)?shù)=Ax÷A總×100%清蛋白：球蛋白=A清÷﹙Aα1+Aα2+Aβ+Aγ﹚實驗操作：準(zhǔn)備→標(biāo)記（粗糙面、鉛筆劃線）→點(diǎn)樣（粗糙面）→電泳（點(diǎn)樣面向下，點(diǎn)樣端置于負(fù)極）→染色（多條薄膜時應(yīng)逐條浸入）→漂洗（注意控制染色和漂洗的時間，防止背景過深或某些區(qū)帶太淺）→洗脫定量法定量（剪下各蛋白區(qū)帶→0.02mol/LNaOH洗脫→將洗脫液用分光光度計比色）注意事項：①點(diǎn)樣時，應(yīng)將薄膜表面多余的緩沖液用濾紙吸去，吸水量以不干不濕為宜。②點(diǎn)樣應(yīng)點(diǎn)在薄膜的毛面上，點(diǎn)樣量要適量，不宜過多或過少。③電泳時應(yīng)將薄膜的點(diǎn)樣端置于電泳槽的負(fù)極端，且點(diǎn)樣面向下。④應(yīng)控制染色時間。時間長，薄膜底色不易脫去；時間太短，著色不易區(qū)分，或造成條帶染色不均勻，必要時可進(jìn)行復(fù)染。三．丙二酸對琥珀酸脫氫酶的競爭性抑制作用1.實驗原理：①琥珀酸脫氫酶是一種重要的脫氫酶，其輔基為FAD，在缺氧的情況下，可使琥珀酸脫氫生成延胡索酸，脫下之氫可將藍(lán)色的甲烯藍(lán)還原成無色的甲烯白。丙二酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)與琥珀酸相似，它能與琥珀酸競爭而和琥珀酸脫氫酶結(jié)合。若琥珀酸脫氫酶已與丙二酸結(jié)合，則不能再催化琥珀酸脫氫，即無法使甲烯藍(lán)變?yōu)闊o色甲烯白。②競爭抑制劑使酶的Km↑，Vmax不變，抑制程度取決于酶與抑制劑的相對親和力&[I]/[S]。2.實驗操作：酶提取液的制備→取試管6支，編號→按圖步驟操作酶提取液（ml）磷酸緩沖液（ml）0.2mol/L琥珀酸（滴）0.02mol/L琥珀酸（滴）0.2mol/L丙二酸溶液（滴）0.02mol/L丙二酸溶液（滴）蒸餾水（滴）甲烯藍(lán)（滴）試管12-8---83試管22-8--8-3試管32-8-8--3試管42--88--3試管5-28---83試管62-8---83（試管6，在酶提取液先在100℃的水浴加熱煮沸5min）→各管溶液立即混均勻，沿試管壁加入液體石蠟，約0.5cm→各管置于37℃的水浴中保溫，切勿搖動試管，隨時觀察比較各試管顏色的變化，記錄褪色時間注意事項：①酶提取液的制備應(yīng)操作迅速，以防止酶活性降低。②加入液體石蠟的作用是隔絕空氣，以避免空氣中的氧氣對實驗造成影響，因此加石蠟時試管壁要傾斜，注意不要產(chǎn)生氣泡。③37℃水浴保溫過程中，不能搖動試管，避免空氣中的氧氣接觸反應(yīng)溶液，使得還原型的甲烯白重新氧化成藍(lán)色。④實驗結(jié)果結(jié)束后，一定要洗干凈試管內(nèi)的液體石蠟。豬肝中核酸的提取與鑒定1.實驗原理：①核蛋白的提取：②從核蛋白中提取核酸：③核酸（DNA、RNA）成分的鑒定實驗操作：①勻漿制備②分離抽提：將肝勻漿倒入離心管內(nèi)→加入2％三氯醋酸4ml，攪拌后靜置3分鐘→3000轉(zhuǎn)離心5分鐘→傾去上清液，向沉淀中加入95%乙醇，攪勻后置于沸水中加熱2min→冷卻后離心5min→傾去上層酒精液，在沉淀中加入10％NaCl溶液4ml攪勻→置于沸水中加熱8分鐘并不斷攪拌→冷卻后離心（3000轉(zhuǎn)每分鐘，5分鐘）→將上清液倒入小燒杯內(nèi)→取等量的95％乙醇，逐步滴加小燒杯內(nèi)，邊加邊搖勻→白色沉淀逐漸出現(xiàn)后，靜置10分鐘→將小燒杯內(nèi)容物倒入離心管，離心（3000轉(zhuǎn)每分鐘，5分鐘）→傾倒上清液即得到核酸鈉的白色沉淀③RNA與DNA的成分的鑒定注意事項：①在離心管平衡后，對稱放入離心機(jī)，切忌將沒加管套的離心管放入離心機(jī)，離心完后取出離心管②避免液體灑在離心機(jī)上面或鉆頭上③啟動離心機(jī)后，離心機(jī)如有不正常反應(yīng)或噪音，應(yīng)立即停止離心，并分析原因雙縮脲法測定血清蛋白質(zhì)含量實驗原理：①血清中蛋白質(zhì)的多肽的肽鍵（-CO-NH-）在堿性溶液中能與2價銅離子作用生成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。蛋白質(zhì)+CuSO4+OH-→紫紅色絡(luò)合物這種紫紅色絡(luò)合物在540nm處有明顯吸收峰，吸光度在一定范圍內(nèi)與血清蛋白含量呈正比關(guān)系，經(jīng)與同樣處理的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液比較，即可求得蛋白質(zhì)含量。②利用吸收光譜對蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析（最大波長位于540nm處）（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線法（2）標(biāo)準(zhǔn)管法 CX/AX=CS/AS，已知CS，測定AS、AX，可求得CX實驗操作：取7支試管，編號，按照圖1操作并記錄?？瞻坠軜?biāo)準(zhǔn)管測定管12345蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液-0.20.40.60.81.0-待測血清樣本------1.0氯化鈉溶液1.00.80.60.40.2--雙鎖脲試劑4.04.04.04.04.04.04.0λ光吸收值00.0850.1810.2610.3540.4380.317混勻各管，室溫放置10min，以空白管調(diào)零，在波長540nm比色，讀取各管光吸收值。注意事項：①須于顯色后30min內(nèi)測定，且各管由顯色到比色時間應(yīng)盡可能一致。②樣品蛋白質(zhì)含量應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。③用分光光度計要注意：取吸收池時，應(yīng)拿毛玻璃兩面，切忌用手拿捏透光面，以免粘上油污；液體的體積為比色杯的2/3-3/4;不要將比色杯放在分光光度計上；試驗完成后，關(guān)閉電源，洗凈比色皿。紙層析法觀察轉(zhuǎn)氨基作用實驗原理：①氨基酸的轉(zhuǎn)氨基作用實驗組發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，最后體系中有兩種氨基酸；對照組不發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)，體系中只有一種氨基酸；

②紙層析法（分配層析）：濾紙——支持物固定相——水流動相——乙醇（有機(jī)溶劑）由于混合物中的各成分的分配系數(shù)不同，分離受固定相的阻力和受流動相的推力影響不同，各組分移動速度不同，有效成分和雜質(zhì)在這兩個相中連續(xù)多次地進(jìn)行分配、吸附和交換作用，最終結(jié)果是使混合物得到分離。③在固定相中分配趨勢較大的組分，隨流動相移動的速率較慢，不同組分在紙上移動的速率不同，用Rf表示：Rf=溶質(zhì)中心到原點(diǎn)中心的距離/溶劑前緣到原點(diǎn)中心的距離物質(zhì)在一定的溶劑中的分配系數(shù)是一定的，故比移值Rf可用來鑒別被分離的物質(zhì)。實驗操作：①肝勻漿的制備②轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)：取干凈試管2支，分別標(biāo)明測定管與對照管，按下表操作試劑（d）測定管試劑（d）測定管 對照管

肝勻漿 10 10

37℃水浴10min沸水浴10min

丙氨酸 10 10

α-酮戊二酸10 10

③點(diǎn)樣（注意點(diǎn)樣斑點(diǎn)不可太大，直徑應(yīng)小于0.5cm）④層析：在濾紙圓心處打一小孔，另取同類濾紙卷成圓筒如燈芯插入小孔；將濾紙放在培養(yǎng)皿上，燈芯下端浸入層析液中,待溶劑前沿距濾紙邊