蘋果多酚的分離及其體外抗氧化活性研究

蘋果多酚的分離及其體外抗氧化活性研究

0超聲波輔助提取蘋果渣多酚系統(tǒng)的研究中國是世界上大型蘋果種植和蘋果濃縮液生產(chǎn)國，每年出口約90.100萬噸水果。除了一些干燥后的食物，這些水果殘留在皮博特點中，造成了巨大的浪費。大量研究結(jié)果表明,蘋果渣中含有豐富的蘋果多酚,而多酚具有獨特的生物活性和藥理活性,是一類保健和治療作用較強的天然抗氧化物質(zhì)。多酚對人類健康的獨特功效已經(jīng)得到科學(xué)界的普遍認可。因此,從蘋果渣中提取并分離出功效較強的多酚物質(zhì),對于建立蘋果加工循環(huán)經(jīng)濟和開發(fā)強效蘋果多酚有重要理論意義和應(yīng)用價值。國內(nèi)外學(xué)者先后采用各種方法提取蘋果多酚,如Pan等采用微波輔助技術(shù)對蘋果渣中的多酚物質(zhì)進行了提取,艾志錄等對微波輔助提取蘋果渣多酚的工藝進行了研究,李志西等采用超聲波輔助技術(shù)提取蘋果渣中的多酚物質(zhì),魏福祥等研究了超臨界CO2法萃取蘋果多酚的工藝,艾志錄等對蘋果渣中的總多酚進行了大孔樹脂吸附以及體外抗氧化活性研究,仇農(nóng)學(xué)等采用多種抗氧化方法對超聲波提取的蘋果渣總多酚進行了活性評價。而單一的以總酚含量為指標提取的蘋果渣多酚普遍存在著純度低,活性不強的缺陷,使得后續(xù)多酚的分離純化工藝難度大增。因此,以總酚含量為考察指標的多酚提取工藝需進一步改進,以提高蘋果渣多酚提取物中強效多酚的含量,增強提取物的活性,使蘋果渣多酚實現(xiàn)以質(zhì)論價,優(yōu)質(zhì)優(yōu)價。而要提高蘋果渣多酚提取物的活性,必須首先確定哪類極性的多酚具有較強的活性,再依據(jù)該類多酚的極性設(shè)計相應(yīng)的提取溶劑極性。在多酚的極性與其抗氧化性方面,Giorgia等認為葡萄渣多酚的抗氧化性與總酚濃度高度相關(guān),而與提取溶劑(乙醇)濃度無關(guān)。溶劑濃度的變化只影響多酚提取物的含量,而對提取物的性質(zhì)沒有影響。而Akowuah等分別采用蒸餾水、50%甲醇、甲醇、70%丙酮和氯仿五種不同極性溶劑提取爪哇茶(Orthosiphonstamineus)多酚,然后評價其抗氧化活性,結(jié)果表明丙酮提取的多酚活性最強。文獻表明葡萄渣多酚極性與其抗氧化能力無關(guān),文獻顯示不同極性的爪哇茶多酚具有明顯不同的抗氧化能力。由此可見,不同的原料,其所含多酚的極性與抗氧化性的關(guān)系并不確定,因此,為提高蘋果渣多酚提取物的抗氧化活性,有必要確定蘋果渣多酚的極性與其抗氧化性之間的關(guān)系,而后選擇適當(dāng)極性的溶劑提取強效蘋果多酚。本文在采用超聲波輔助提取蘋果渣總多酚的基礎(chǔ)上,研究了不同極性多酚的分離以及不同極性多酚的抗氧化活性差異,以期為工業(yè)化提取蘋果渣中強效多酚提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1dpph自由基、tptz、ca-1,1-diphenyl-2-picryl-1,3,3.3-三吡啶三fig嗪蘋果渣(不含蘋果籽)由陜西恒興果汁飲料有限公司提供,露天曬干,粉碎,過60目篩。1,1-二苯基-2-苦苯肼自由基(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazylradical,DPPH·)、TPTZ(Fe3+-三吡啶三吖嗪)購自美國Sigma公司;單寧酸、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、濃磷酸、濃鹽酸、無水乙醇、硫酸亞鐵、三氯化鐵等均為國產(chǎn)分析純。1.2超聲、分光光度計AB204-N型電子天平(德國METTLER公司);U-3010雙光束紫外可見分光光度計(日本HITACHI公司);KQ-250DB型數(shù)控超聲波發(fā)生器(昆山市超聲儀器有限公司);WFJ2000型分光光度計(尤尼柯(上海)有限公司);SHZ-82水浴恒溫振蕩器(江蘇丹陽門科教儀器廠);SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);YHDGJ型冷凍干燥機(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。1.3測試方法1.3.1多酚含量測定本文采用Folin-Ciocalteu(FC法)測定蘋果多酚的濃度。FC試劑的配制,參見文獻。FC法測定多酚含量時,必須對測定方法進行進一步的驗證。因為不同的物種所含多酚種類和其他干擾物質(zhì)的量是不同的。因此,建立FC法測定蘋果渣中多酚物質(zhì)含量的方法是必要的。本試驗通過考察紫外全波長掃描、繪制標準曲線、穩(wěn)定性和精密度等,對FC法測定蘋果渣中多酚的方法進行驗證。FC法測定多酚光譜掃描:方法參見文獻,以確定FC法測定多酚的最適波長。FC法穩(wěn)定性檢驗:參見文獻,以確定FC法在一段時間內(nèi)的穩(wěn)定性。FC法標準曲線的繪制:以單寧酸為標準對照品,制作標準曲線。操作如下:精確配制25mg/L單寧酸溶液,分別取此溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0mL于25mL棕色容量瓶中,并分別加入FC試劑1.0mL、Na2CO3(1mol/L)溶液5.0mL,雙蒸水定容,30℃水浴避光放置1h后,于760nm波長下測定吸光度。試驗重復(fù)5次,取平均值。以單寧酸濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制FC法標準曲線。FC法精密度測定:將已知濃度的單寧酸標準品溶液(4.0mg/L)平行測定6次,計算相對標準偏差(RSD),以確定FC法測定蘋果多酚的精密度。1.3.2蘋果總多酚的提取在本實驗室前期研究總多酚提取工藝及抗氧化性評價的基礎(chǔ)上,采用乙醇質(zhì)量分數(shù)為50%、料液比為1︰24(g/L)、溫度70℃、超聲時間30min的條件提取蘋果總多酚。再取提取液500mL,冷凍干燥后用水稀釋至120mL,過濾,備用。在備用液中加入3倍體積的乙酸乙酯,磁力攪拌30min后,于分液漏斗中分層,得乙酸乙酯萃取物和水層。在水層中再加入3倍體積的正丁醇,磁力攪拌30min后,于分液漏斗中分層,得正丁醇萃取物和水層萃取物。將三種萃取物分別進行真空冷凍干燥,后用水溶解即得到不同極性的多酚溶液。萃取工藝路線如圖1所示。1.3.3吸光度測定參照Vattem等的方法進行。在2.0mL60μmol/LDPPH·溶液(無水乙醇為溶劑)中分別加入3mL不同濃度1.3.2所制備的不同極性的蘋果多酚溶液,用力搖勻后于室溫下放置30min,測定其在517nm下的吸光度值(AS);以3mL水代替樣品為空白對照(A0);以3mL樣品與2.0mL無水乙醇混合液為樣品對照(AX),以消除樣品本身顏色的影響;以3mL水與2mL無水乙醇的混合液調(diào)儀器零點。每個樣品每個濃度重復(fù)3次,取平均值。清除率R按下式計算:1.3.4抗氧化活性/還原能力一般情況下,物質(zhì)的還原能力越強,其抗氧化活性也越高。Benzie等建立的FerricReducingAbilityofPlasma(FRAP)法原理為:TPTZ可被樣品中還原物質(zhì)還原為二價鐵形式,呈現(xiàn)出明顯的藍色,并于593nm處具有最大光吸收,根據(jù)吸光度的大小計算樣品抗氧化活性/還原能力的強弱。它反映的不是樣品針對某一種自由基的清除活性,而是樣品總還原能力。TPTZ工作液的配制參見文獻。還原力標準曲線的制作:取不同體積的0.2171mmol/LFeSO4溶液,用蒸餾水補充至2mL,再加入3mLTPTZ工作液,混勻后于37℃反應(yīng)30min,后于593nm處測定吸光度,制定還原力標準曲線。不同極性多酚樣品還原力的測定:取樣品液2mL,再加入3mLTPTZ工作液,混勻后于37℃反應(yīng)30min,后于593nm處測定吸光度。根據(jù)吸光度值和還原力標準曲線,計算FeSO4當(dāng)量濃度。2結(jié)果與分析2.1蘋果渣多酚體系的檢測采用1.3.1的方法進行光譜掃描的結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,在波長為760nm附近,單寧酸和蘋果渣多酚的反應(yīng)液均出現(xiàn)最大吸收峰,并且峰的形狀和位置差別很小。這說明以單寧酸作為多酚的標準品完全可行,多酚提取液中的其他非多酚類物質(zhì)對多酚含量的測定不會產(chǎn)生較大影響。因此,后續(xù)總酚含量測定試驗均采用單寧酸作為多酚標準品,波長均選用760nm。2.2fc對多酚物質(zhì)的絡(luò)合反應(yīng)的影響采用1.3.1的方法進行反應(yīng)液隨時間變化的穩(wěn)定性研究,結(jié)果如表1所示。由表1可以看出,多酚物質(zhì)與FC試劑反應(yīng),反應(yīng)生成物在760nm下的吸光度值在30℃水浴中隨時間的延長而不斷變化,當(dāng)水浴時間達到1h時,其吸光度趨于穩(wěn)定。繼續(xù)放置1h,其值也不再變化。由此可知,FC法測定總酚的最佳測定條件為在30℃下水浴1h。2.3標準曲線的繪制試驗確定了以單寧酸為標準品的總多酚測定標準曲線方程為y=0.0933x+0.0127,R2=0.9994。其中,y——760nm處吸光度;x——單寧酸濃度,mg/L。所得標準曲線如圖3所示,可以看出單寧酸作為總多酚測定的標準物質(zhì)時,吸光度與其濃度呈良好的相關(guān)性。因此,以吸光度計算其相當(dāng)?shù)膯螌幩釢舛鹊姆椒ㄊ强尚械?。后續(xù)試驗中多酚的量均指以單寧酸計算的量。2.4精密度和重現(xiàn)性同一樣品,6次測定在760nm處的吸光度值依次為0.397,0.395,0.388,0.391,0.392,0.394,其相對標準偏差為0.813%,小于1.0%,由此可見測定方法精密度高,重現(xiàn)性好,可以用于多酚濃度的測定。2.5提取的多酚配比采用1.3.2的方法,分離得到多酚提取量平均值為4.07g/kg。表明蘋果渣中富含多酚類物質(zhì),加之年產(chǎn)90~100萬t果渣的豐富資源,因此有進一步研究的價值。按照極性從小到大的順序,乙酸乙酯層、正丁醇層、水層多酚的質(zhì)量比為1︰7︰9,即采用乙醇溶液質(zhì)量分數(shù)為50%、料液比1︰24、溫度70℃、超聲提取時間30min的條件提取的多酚中,水層多酚占52.94%,正丁醇層多酚占41.18%,乙酸乙酯層多酚占5.88%。因此,根據(jù)不同極性的萃取溶劑,按照相似相溶的原理,該分離方法可以按極性分離蘋果渣中總多酚。2.6不同極性蘋果渣多酚對dpph的清除作用DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基,若受試物能將其清除,則表明受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過氧化鏈的作用。采用1.3.3的方法測定不同極性蘋果渣多酚對DPPH·的清除作用,結(jié)果如圖4所示。由圖4可知,乙酸乙酯層,正丁醇層以及水層蘋果渣多酚對DPPH·均具有較強的清除效果,且隨其多酚濃度的增加而不斷增強。但它們的清除能力又不完全相同,水層的抗氧化能力最強,其次為正丁醇層,而乙酸乙酯層相對較弱。50%清除率時,乙酸乙酯層多酚濃度最大,為8.305mg/L;正丁醇層多酚濃度其次,為7.305mg/L;而水層多酚濃度最小,為6.160mg/L。由此可見,水層多酚的抗氧化力最強,多酚的抗氧化性與其極性呈正相關(guān)。2.7還原力測定多酚的濃度和表面活性劑的抗氧化活性采用1.3.4的方法進行試驗,得還原力測定標準曲線,如圖5所示。從圖5可以看出:硫酸亞鐵濃度在0.02171~0.2171mmol/L范圍內(nèi)與其593nm處的吸光度成良好線性關(guān)系。方程為:y=4.6423x+0.0068,其中:y——539nm處的吸光度,x——FeSO4的濃度,mmol/L,相關(guān)系數(shù)R2=0.9986。因此,以593nm處的吸光度換算成多酚的FeSO4當(dāng)量濃度的方法是可行的。取不同濃度和不同極性的多酚樣品后,按照1.3.4的方法進行還原力測定,結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出:隨著蘋果渣多酚濃度的增加,FeSO4當(dāng)量濃度也在不斷增加,即還原力不斷增加。多酚濃度與還原力總體呈正相關(guān)。但不同極性的多酚,其還原力又各不相同,其中水層多酚的還原力最強,正丁醇層次之,而乙酸乙酯層的總還原力相對較弱?？梢姸喾拥倪€原力與其極性呈正相關(guān)。由2.6及2.7的試驗結(jié)果可以看出,水層多酚的活性都明顯強于正丁醇層和乙酸乙酯層。這可能是水層多酚分子在以水或者極性溶劑為主的抗氧化體系中溶解能力比正丁醇或者乙酸乙酯層的能力強(相似相溶)。在相同的濃度條件下,水層多酚分子由于可以在抗氧化體系中自由的分散,就可對抗氧化體系中的自由基進行及時的清除。而正丁醇和乙酸乙酯層多酚均需花費一定時間穿透弱極性溶劑與抗氧化體系中的極性溶劑所形成的液-液屏障,不能及時阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生,抗氧化能力大大減小。通過研究還發(fā)現(xiàn),蘋果渣中多酚的極性與其抗氧化活性呈正相關(guān),即極性越大,抗氧化能力越強。再結(jié)合“相似相溶”原理,不難看出,增強提取溶劑的極性有利于增加高極性蘋果渣多酚的得率,同時也有利于提高蘋果渣多酚提取物中強效多酚的含量。3液-液萃取法