第21章 基因工程(改)

基因重組和基因工程

GeneticRecombinationandGeneticEngineering第十四章基因基因工程基因治療分子雜交轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因敲除基因診斷生物制藥遺傳育種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）DNA測(cè)序第二節(jié)

重組DNA技術(shù)DNARecombinationTechnique重組DNA技術(shù)的發(fā)展史1973年美國(guó)斯坦福大學(xué)的科學(xué)家構(gòu)建第一個(gè)重組DNA分子1977年美國(guó)南舊金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遺傳工程公司，專門應(yīng)用重組DNA技術(shù)制造醫(yī)學(xué)上重要的藥物。1980年開始建造第一家應(yīng)用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素的工廠1985第一批轉(zhuǎn)基因家畜（兔、豬和羊），中國(guó)轉(zhuǎn)基因魚1997年英國(guó)羅林研究所成功的克隆了多莉1999年我國(guó)首例攜帶人血清白蛋白基因整合的轉(zhuǎn)基因試管公?！咸显跍Q生生長(zhǎng)快、肉質(zhì)好的轉(zhuǎn)基因魚(中國(guó))基因工程

是指在體外人工將目的基因和載體進(jìn)行重組，再導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的過程?；蚬こ?geneticengineering)目的①獲得目的基因的多拷貝

（DNA）

(DNA克隆)②獲得目的基因的表達(dá)產(chǎn)物（蛋白質(zhì)）基因工程實(shí)際上是一種“超級(jí)顯微工程”：對(duì)DNA的切割、縫合與轉(zhuǎn)運(yùn)，必須有特殊的工具。①要把目的基因從供體DNA長(zhǎng)鏈中準(zhǔn)確地剪切下來。②還要將目的基因與載體連接起來。DNA重組技術(shù)的發(fā)明——有賴于工具酶的發(fā)現(xiàn)一、重組DNA技術(shù)中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別特異序列，切割DNADNA連接酶催化DNA中相鄰的5′磷酸基和3′羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個(gè)DNA分子或片段連接DNA聚合酶Ⅰ合成雙鏈cDNA分子或片段連接缺口平移制作高比活探針DNA序列分析填補(bǔ)3′末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5

3

聚合、35

外切活性，而無53

外切活性。常用于cDNA第二鏈合成，雙鏈DNA3末端標(biāo)記等逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA替代DNA聚合酶I進(jìn)行填補(bǔ)，標(biāo)記或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5′羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針末端轉(zhuǎn)移酶在3′羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾堿性磷酸酶切除末端磷酸基1、宿主的限制與修飾現(xiàn)象限制:實(shí)際就是限制性核酸內(nèi)切酶降解外源DNA，維護(hù)宿主遺傳穩(wěn)定的保護(hù)機(jī)制。修飾:宿主細(xì)胞通過甲基化作用達(dá)到保護(hù)自身DNA的作用2、限制性核酸內(nèi)切酶定義指識(shí)別DNA的特異序列,并在識(shí)別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用：與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護(hù)自身DNA。分類Ⅰ型：限制酶、甲基化酶、ATP酶、解螺旋酶Ⅱ型：限制酶Ⅲ型：限制酶、甲基化酶（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）限制性核酸內(nèi)切酶第一個(gè)字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、三個(gè)字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個(gè)字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

種

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識(shí)別序列特點(diǎn)——

回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

GGATCCCCTAGG特異識(shí)別連續(xù)的4、6或8個(gè)堿基:出現(xiàn)的幾率分別是1/44、1/46、1/48識(shí)別序列越長(zhǎng)、切點(diǎn)越少。虞美人【宋】王文甫

順讀：黃金柳嫩搖絲軟，永日堂空掩。卷簾飛燕未歸來，客去醉眠倚枕殢殘杯。眉山遠(yuǎn)拂青螺黛，整整垂雙帶。水垂香熨窄衫輕，瑩玉碧溪春溜煙波橫。倒讀：橫波煙溜春溪碧，玉瑩輕衫窄。熨香垂水帶雙垂，整整黛螺青拂遠(yuǎn)山眉。杯殘殢枕倚眠醉，去客來歸未。燕飛簾卷掩空堂，日永軟絲搖嫩柳金黃。BamHⅠ切口：粘端切口GGATCCGATCCGHindⅡ切口：平端切口ACGGTCGTCAGC幾種不同的末端5′突出粘端（EcoRⅠ）3′突出粘端（PatⅠ）5′3′ATGCGCATCGGC5′3′GATCAT5′3′ATCG5′3′AT平頭末端（HindⅡ）GTCAGC5′3′ACGGTC5′3′名稱識(shí)別序列及切割位點(diǎn)名稱識(shí)別序列及切割點(diǎn)切割后產(chǎn)生５’突出末端:BamHⅠ5’…G▼GATCC...3’BglⅡ

5’…A▼GATCT...3’EcoRⅠ

5’…G▼AATTC...3’HindⅢ

5’…A▼AGCTT...3’HpaⅡ

5’…C▼CGG...3’MboⅠ

5’…▼GATC...3’NdeⅠ

5’…GA▼TATG...3’切割后產(chǎn)生3’突出末端:ApaⅠ

5’…GGGCC▼C...3’HaeⅡ

5’…PuGCGC▼Py...3’KpnⅠ

5’…GGTAC▼C...3’PstⅠ

5’…CTGCA▼G...3’SphⅠ

5’…GCATG▼C...3’切割后產(chǎn)生平末端:AluⅠ

5’…AG▼CT...3’EcoRⅤ

5’…GAT▼ATC...3’HaeⅢ

5’…GG▼CC...3’PvuⅡ

5’…CAG▼CTG...3’SmaⅠ

5’…CCC▼GGG...3’限制性內(nèi)切核酸酶同尾酶有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個(gè)相同的粘性末端稱為配伍未端。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同功異源酶來源不同的限制酶，但能識(shí)別和切割同一位點(diǎn)，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ二、基因載體定義為攜帶目的基因，實(shí)現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的目的基因被擴(kuò)增而特意設(shè)計(jì)的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的目的基因可表達(dá)成多肽鏈而特意設(shè)計(jì)的載體稱為表達(dá)載體。最少需要啟動(dòng)子理想載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)⑴能自主復(fù)制；⑵有遺傳標(biāo)記，便于重組體的篩選和鑒定⑶常具有多個(gè)酶的單一酶切位點(diǎn)，稱為多克隆位點(diǎn)；⑷表達(dá)型載體應(yīng)配備與宿主細(xì)胞適應(yīng)的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等。1.質(zhì)粒

(plasmid)特點(diǎn)能在宿主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立自主復(fù)制；帶有某些遺傳信息,會(huì)賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀（如抗藥性等）。質(zhì)?！?xì)菌染色體外的小型環(huán)狀雙鏈DNA分子pBR322質(zhì)粒DNA噬菌體是比細(xì)菌還小得多的微生物，和病毒侵犯真核細(xì)胞一樣，噬菌體侵犯細(xì)菌，也可以認(rèn)為它是細(xì)菌里的“寄生蟲”。它本身是一種核蛋白，核心是一段DNA，結(jié)構(gòu)上有一個(gè)蛋白質(zhì)外殼和尾巴，尾巴上的微絲可以把噬菌體的DNA注入細(xì)菌內(nèi)。2.噬菌體(phage)

pUC192686bpamprGsul1874Ctr1011779Ppal1766OriAmll806Xmnl2294Scal2177Spal2501Aatll2617EcoO10926740Ndel183Narl235LacZ′396447EcoRISaclKpnlSmalXmalBamHIXbalHincIIPstISphIHindIIIpUC噬菌體篩選標(biāo)記的依據(jù)：①pUC的LacZ基因：β半乳糖苷酶α片段（N末端）②宿主：β半乳糖苷酶ω片段（C末端）①②同時(shí)表達(dá)，才有β半乳糖苷酶的活性，使特異的作用物（X-gal）轉(zhuǎn)變?yōu)樗{(lán)色。若目的基因插入pUC的LacZ基因：N末端片段無法生成，宿主無β半乳糖苷酶活性X-gal培養(yǎng)呈白色。α互補(bǔ)利用α-互補(bǔ)篩選重組體pUC18pUC182686bpβ半乳糖苷酶N端編碼序列啟動(dòng)子ampr轉(zhuǎn)化β半乳糖苷酶N端編碼序列細(xì)菌染色體（酶缺陷）pUC18細(xì)菌在含X-gal和Lac操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)含載體的pUC18藍(lán)色菌落裂開的N端外源DNA裂開的N端多克隆位點(diǎn)amprpUC182686bp轉(zhuǎn)化pUC18細(xì)菌在含X-gal和Lac操縱子誘導(dǎo)劑的瓊脂上培養(yǎng)含重組體的pUC18白色菌落3.粘性質(zhì)粒(柯斯質(zhì)粒,cosmid)COSHindⅢBamHⅠEcoRⅠEcoRⅠPJB8PstⅠSalⅠApR質(zhì)粒+噬菌體。具有二者的雙重特性其它載體1）酵母人工染色體載體（yeastartificialchromosomeYAC）：大容量的載體。2）細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)3）病毒改造的載體：真核重組及其表達(dá)載體、基因治療載體。DNA病毒：SV40（猴腎病毒）、痘苗病毒。RNA病毒：反轉(zhuǎn)錄病毒、植物病毒。昆蟲病毒：具宿主專一性強(qiáng)特點(diǎn)，能表達(dá)原核與真核兩類基因。質(zhì)粒限制性酶切限制性酶切含目的基因的外源DNADNA連接酶目的基因重組質(zhì)粒受體菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染非轉(zhuǎn)化菌含重組體轉(zhuǎn)化菌篩選陽性菌落擴(kuò)增副本培養(yǎng)液中繁殖后在三、基因工程的操作過程（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

（四）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點(diǎn)連接(2)不同限制酶切位點(diǎn)連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建（三）限制性核酸內(nèi)切酶的應(yīng)用BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割T4

DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點(diǎn)連接目錄不同限制酶切位點(diǎn)（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點(diǎn)BglⅡ切割位點(diǎn)+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體目錄目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄2.平端連接5′3′3′5′載