第三章 基因工程載體2

載體(Vector)一種具有特定功能的DNA分子，將攜帶外源DNA片段或基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并使其在受體細(xì)胞中得以維持或表達(dá)。（龍敏南，2010）攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。(李立家，肖庚富，2004)運(yùn)送遺傳物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞的工具(vehicleusedtotransfergeneticmaterialtoatargetcell).第一節(jié)基因工程載體的

一般特性及種類可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞具有自我復(fù)制的能力，并可以帶動其下游外源序列一起復(fù)制具有合適的篩選標(biāo)記含有多克隆位點(MultipleCloningSite,MCS)安全，對受體細(xì)胞無害在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高相對分子量要盡量小，拷貝數(shù)適當(dāng)1.基因工程載體的一般特性2.基因工程載體的種類按工作方式：質(zhì)粒載體、噬菌體載體、粘粒載體、人工染色體載體按功能：克隆型載體、表達(dá)型載體（表達(dá)載體又分胞內(nèi)表達(dá)和分泌表達(dá)載體，或按受體細(xì)胞不同分為原核細(xì)胞和真核細(xì)胞表達(dá)載體）按應(yīng)用對象：原核生物載體、真核生物載體、穿梭載體1.質(zhì)粒載體是以細(xì)菌質(zhì)粒(plasmid)的各種元件為基礎(chǔ)組建而成的基因工程載體。主要用途：外源基因的轉(zhuǎn)移、貯存、表達(dá)及基因文庫的構(gòu)建1.1Basicpropertiesofplasmid(3)鏈霉菌等微生物中存在線性質(zhì)粒，甚至有RNA質(zhì)粒。(4)質(zhì)粒一般賦予宿主一定的表型特征，賦予的表型特征未確定的質(zhì)粒稱為隱蔽型質(zhì)粒（crypticplasmid）。1.4PlasmidcopynumberThecopynumberofaplasmidisdeterminedbyregulatingtheinitiationofplasmidreplication.通過反義RNA調(diào)控、通過關(guān)鍵蛋白與重復(fù)區(qū)結(jié)合進(jìn)行調(diào)控兩種方式。1.5構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本原則（1）選用合適的出發(fā)質(zhì)粒（親本質(zhì)粒）出發(fā)質(zhì)粒應(yīng)含有質(zhì)?？寺≥d體的必備元件，這些元件也可以從多種出發(fā)質(zhì)粒獲得。（2）正確獲得構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的元件。一般采用限制性核酸內(nèi)切酶切割出發(fā)質(zhì)粒DNA分子獲得某種元件的DNA片段，選用的切割位點既要保證元件完整，又要使DNA片段最小。也可用PCR技術(shù)擴(kuò)增所需元件的特異DNA片段。1.5構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本原則（3）組裝合適的選擇性標(biāo)記基因根據(jù)轉(zhuǎn)化的受體細(xì)胞的特性選擇組裝什么樣的選擇性標(biāo)記基因。（4）選用合適的啟動子構(gòu)建表達(dá)質(zhì)?？寺≥d體，必須組裝合適的啟動子。真核基因在原核生物中表達(dá)時常用原核生物或病毒（噬菌體）的啟動子。最好選用外界條件誘導(dǎo)的啟動子，以便有效地控制目的基因的表達(dá)。（5）能達(dá)到目的的前提下，構(gòu)建過程力求簡單。lacZvslacZ’或lacZαβ-半乳糖苷酶基因產(chǎn)物不具酶活性，裝配為四聚體后才有酶活。該蛋白質(zhì)可分為兩部分：α鏈（lacZN端146個氨基酸）和β鏈。前者負(fù)責(zé)四聚體裝配，后者具β-半乳糖苷酶活性；只有當(dāng)兩者都存在時，才會表現(xiàn)出酶活性，該作用稱之為α-互補(bǔ)作用。這兩個部分可獨(dú)立存在，分別由兩個基因編碼。α-互補(bǔ)法篩選重組子載體質(zhì)粒上帶有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的啟動子序列和β-半乳糖苷酶N端146個氨基酸的編碼序列。這個編碼區(qū)中插入了一個多克隆位點,但并沒有破壞lacZ的閱讀框架,不影響其正常功能。宿主菌株帶有β-半乳糖苷酶C端部分序列的編碼信息。在各自獨(dú)立的情況下,載體和宿主編碼的β-半乳糖苷酶的片段都沒有酶活性。但在質(zhì)粒導(dǎo)入這類宿主菌體后可形成具有酶活性的蛋白質(zhì)。α-互補(bǔ)法篩選重組子當(dāng)外源片段插入到質(zhì)粒的多克隆位點上后會導(dǎo)致讀碼框架改變,表達(dá)蛋白失活,產(chǎn)生的氨基酸片段失去α-互補(bǔ)能力,含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子在生色誘導(dǎo)培養(yǎng)基上只能形成白色菌落。而沒有插入外源片段的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生α-互補(bǔ)，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(異丙基硫代-β-D-半乳糖苷)誘導(dǎo)形成藍(lán)色菌落。

噬菌粒phagemidpUC118和pUC119分別來自pUC18和pUC19。它們帶有M13噬菌體DNA合成的起始與終止及DNA包裝進(jìn)入噬菌體顆粒所必需的順式序列。接受外源DNA區(qū)段后，可以像質(zhì)粒一樣以常規(guī)方式進(jìn)行增殖。當(dāng)帶上這些質(zhì)粒的細(xì)胞被適當(dāng)?shù)慕z狀噬菌體感染時，可合成質(zhì)粒DNA的其中1條鏈，并包裝進(jìn)入子代噬菌體顆粒，從菌體內(nèi)放出。1.7質(zhì)粒表達(dá)載體典型的大腸桿菌表達(dá)載體詳見第六章1.

噬菌體載體2.單鏈絲狀噬菌體載體2.噬菌體載體2.1噬菌體載體野生型λ噬菌體DNA圖譜左臂：從A到J長約20kb,其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。中段：長約20kb，是λDNA整合和切出，溶原生長所需的序列。右臂:長約10kb,是調(diào)控區(qū),控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及λDNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。λ噬菌體DNA末端為長12個核苷酸的互補(bǔ)單鏈稱為粘端(cohesiveend，cos)。左右臂包含λDNA復(fù)制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。Sincephageλcanaccommodateonlyabout5%morethanitsnormalcomplementofDNA,vectorderivativesareconstructedwithdeletionstoincreasethespacewithinthegenome.插入型載體本身可以包裝形成噬菌斑，可插入外源DNA片段較小取代型載體本身不能包裝形成噬菌斑，可插入外源DNA片段較大大腸桿菌絲狀噬菌體包括M13噬菌體、f噬菌體等，其基因組均是單鏈閉環(huán)DNA分子，其中M13mp系列克隆載體是對野生型M13加以改造，插入了多克隆位點和LacZ’基因后的載體，同樣可以利用IPTG和X-gal作藍(lán)白篩選。M13噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的RFDNA。RFDNA很容易從感染細(xì)胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進(jìn)行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導(dǎo)入細(xì)胞。載體的插入位點在M13噬菌體基因組中絕大多數(shù)為必需基因，只有兩個間隔區(qū)可用來插入外源DNA（基因Ⅱ/Ⅳ和基因Ⅷ/Ⅲ之間）?；颌蚝突颌糁g的508bp間隔區(qū)是主要的外源片段插入位點。在基因Ⅷ和基因Ⅲ主要用作噬菌體展示?；颌部捎脕砜寺⊥庠雌?。3.粘粒(Cosmid)載體如果將λ噬菌體左右臂和中段都去除，僅留下λDNA兩端不少于280bp并含有cos位點以及與包裝相關(guān)的核苷酸序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因（氨芐青霉素抗性基因）、多克隆位點等，就可構(gòu)成cos質(zhì)?；蚍Q為粘質(zhì)粒的載體。cosmid結(jié)合了質(zhì)粒克隆載體和λ噬菌體載體的優(yōu)點。能像l-DNA那樣進(jìn)行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞能像質(zhì)粒那樣在受體細(xì)胞中自主復(fù)制重組操作簡便，篩選容易裝載量大（35-45kb）且克隆片段具有一定的大小范圍不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細(xì)胞主要用于基因組文庫的構(gòu)建，適于做真核細(xì)胞大片段的克隆。粘粒(Cosmid)載體的特點第三節(jié)酵母基因克隆載體廣泛存在于釀酒酵母中，位于酵母細(xì)胞核內(nèi)，拷貝數(shù)為50～100個(也說20~80個)只攜帶與復(fù)制和重組有關(guān)的4個蛋白質(zhì)基因（REP1，REP2，REP3，REP4），不賦予宿主細(xì)胞任何表型，屬于隱蔽性質(zhì)粒。它最顯著的特征是質(zhì)粒上有兩個600bp的反向重復(fù)序列（IR）在兩個IR上各有一個專一性重組位點（FRT），由于這兩個FRT間的相互重組，產(chǎn)生兩種互變異構(gòu)型的混合質(zhì)粒，即A和B型1.2μm質(zhì)粒：穿梭載體

所謂的穿梭載體是指一類人工構(gòu)建的，具有兩種不同復(fù)制起點和選擇標(biāo)記，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的載體。以大腸桿菌細(xì)胞為寄主進(jìn)行基因操作具有技術(shù)成熟、方便實用等很多優(yōu)點，而在其它的原核生物或真核生物細(xì)胞中進(jìn)行直接的基因操作總是有很多麻煩的問題有待解決。所以，構(gòu)建能夠穿梭于大腸桿菌與其它生物細(xì)胞之間的載體就能解決這些難題了。第四節(jié)真核生物基因克隆的載體

和人工染色體1.植物基因克隆的載體目前的載體系統(tǒng)有病毒的載體系統(tǒng)