枯草芽孢桿菌的分離培養(yǎng)及初步應(yīng)用

枯草芽孢桿菌的分離培養(yǎng)及初步應(yīng)用

半個(gè)世紀(jì)以來，化學(xué)農(nóng)藥的防治和病蟲害預(yù)防對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)起了重要作用，但長期以來，化學(xué)農(nóng)藥被多次不適當(dāng)使用，導(dǎo)致了許多問題?？莶菅挎邨U菌(Bacillussubtilis,簡稱BS)是內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌,其菌體在生長過程中產(chǎn)生枯草菌素、桿菌肽等抗菌活性物質(zhì),對(duì)各種致病菌有明顯的抑制作用。由于其能產(chǎn)生耐熱抗逆的芽孢,對(duì)菌劑的生產(chǎn)、劑型加工及其在環(huán)境中的存活、定殖與繁殖都十分有利。因此它是一種理想的生防微生物,在植物病害的生物防治中得到了廣泛的應(yīng)用。本試驗(yàn)以枯草芽孢桿菌為材料進(jìn)行透射電鏡樣品制備和觀察,為BS的生物防治工作提供一些基礎(chǔ)理論依據(jù)。1梯度丙酮ph值枯草芽孢桿菌為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)電鏡平臺(tái)實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)。黏合劑:2%瓊脂糖。固定液:戊二醛(2.5%),1%鋨酸。緩沖液:磷酸緩沖液(PBS,0.1mol/L,pH7.4)。脫水劑:30%、50%、70%、80%、90%、100%的梯度丙酮。包埋劑:SPI812環(huán)氧樹脂(沿用Luftl1961年的配方,A液、B液體比1:9)。2實(shí)驗(yàn)方法2.1瓊脂糖的制備對(duì)枯草芽孢桿菌菌種平板分離純培養(yǎng),然后接種到三角瓶中NYDA(營養(yǎng)肉湯8g,酵母浸膏5g,葡萄糖10g,水1000mL)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)3d。待長到密度較高時(shí),收集到2mL離心管中,3000r/min離心2min得到細(xì)菌團(tuán)。加熱2%瓊脂糖至溶解,然后待其溫度降到37℃左右,將融解的瓊脂糖加入離心管中,包裹住細(xì)菌團(tuán)。待瓊脂糖凝固后,將多余的瓊脂糖切去,并將瓊脂糖包裹的細(xì)菌團(tuán)切成1mm3大小的塊狀,放入2mL離心管。2.2前安裝2.5%戊二醛的PBS(0.1mol/L,pH7.4)溶液加入離心管中,4℃固定過夜。2.3洗衣粉1.5mLPBS(0.1mol/LpH7.4)加入離心管中,室溫下漂洗3次,每次15min。2.4固定后的固定每個(gè)離心管中加0.5mL1%鋨酸室溫作用2h。2.5洗衣粉1.5mLPBS(0.1MpH7.4)加入離心管中,室溫下漂洗3次,每次15min。2.6梯度丙酮作用依次將1.5mL的30%、50%、70%、80%、90%、100%梯度丙酮加入離心管中,室溫作用30min。最后純丙酮室溫3次脫水,每次30min以徹底脫去樣品塊中的水分。2.7dmp-30包埋滲透:丙酮-包埋劑(體積比3:1)作用8h→丙酮-包埋劑=(體積比1:1)作用12h→丙酮-包埋劑(體積比3:1)作用12h→純包埋劑(不加DMP-30)作用12h→包埋劑(加DMP-30)作用12h,整個(gè)過程均在40℃進(jìn)行。包埋:向21孔硅化包埋板每孔中先加入少量包埋劑(加DMP-30),用牙簽挑出樣品,放入包埋孔的兩端,最后將每孔加滿。將包埋板放入烘箱中聚合,45℃預(yù)聚合24h,再60℃完全聚合24h。2.8包埋材料的下底邊將聚合好的包埋塊放入專用的樣品夾中,在解剖鏡下用單面刀片修去頂端和組織周圍多余的包埋劑,并使包埋材料呈金字塔形。修出的材料面上下底邊要平行,邊角要銳。LeicaUC6超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片,切片厚度60nm,切片成帶后,用眉毛筆將帶狀切片撈到以Formvar(聚乙烯醇縮聚甲醛,0.2%)作為支持膜的銅網(wǎng)上,放入切片盒中,自然干燥。2.9醋酸鉛的染色在一培養(yǎng)皿中灌注蠟,做成蠟槽,待凝固。在培養(yǎng)皿蓋上涂抹凡士林,密封蠟盤。取飽和醋酸鈾溶液滴入蠟槽中,然后用尖頭鑷子夾取銅網(wǎng),將有材料的一面朝下放在染色液中,染色30min。取出銅網(wǎng),經(jīng)過3次雙蒸水漂洗后,按照同樣方法進(jìn)行檸檬酸鉛染色10min。取出銅網(wǎng),用濾紙吸干多余的水,放入切片盒中。2.10超聲切片觀察使用H7650透射電鏡,加速電壓80kV觀察超薄切片。用Gatan832digitalcamera成像,獲得枯草芽孢桿菌的超微結(jié)構(gòu)。3超微結(jié)構(gòu)的觀察按照上述步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn),獲得如圖1所示結(jié)果。圖片中枯草芽孢桿菌的超微結(jié)構(gòu)清楚,特別是細(xì)胞壁為3層。細(xì)胞內(nèi)的核區(qū)不能明顯分辨出,可能是菌處于生長旺盛期,核區(qū)分散不呈團(tuán)狀。a、b、d:菌體縱切面bar=0.2μmc:菌體增殖時(shí)橫切面bar=0.5μm4透射電鏡觀察c對(duì)于散在細(xì)胞的細(xì)菌,在透射電鏡樣品制備過程中很難成塊。故采用瓊脂糖固定成塊狀,為接下來的漂洗、后固定、脫水、滲透和包埋提供了極大的方便。從而不必每一步都要離心使樣品成塊。通過對(duì)枯草芽孢桿菌透射電鏡制樣的摸索,找到了一種適合散在細(xì)胞、細(xì)菌的透射電鏡制樣方法-瓊脂糖包埋成塊法。瓊脂糖包埋后,使用手術(shù)刀片切除多余的瓊脂糖并將樣品切成1mm3大小的小塊。樣品的體積一定要小,否則不但會(huì)影響后固定效果而且會(huì)導(dǎo)致滲透困難,從而致使樣品得不到很好的固定或超薄切片無法進(jìn)行,最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。脫水過程中,若當(dāng)天不能完成滲透等步驟,樣品可以在70%丙酮中過夜,不能放在100%丙酮中