山大分子生物學(xué) 生物基地實(shí)驗(yàn)報(bào)告三

重組質(zhì)粒的酶切以及PCR法鑒定1、判斷各組的插入片段大小：各泳道的情況：1泳道為pUC19/HindⅢMarker，2、15、23泳道為λ-HindⅢMarker，16為DL5000Marker。結(jié)合上次實(shí)驗(yàn)對(duì)各組插入片段大小的初步判斷、本次對(duì)重組質(zhì)粒酶切電泳以及PCR的結(jié)果，對(duì)各組重組質(zhì)粒插入片段大小的最終判斷如下：（1）第1組、4組、5組第二輪、6組以及本組（3組）第二輪：插入片段大小為125bp。在酶切電泳圖上可以看到這幾個(gè)組酶切產(chǎn)物有兩條較明顯的的條帶，上面一條位置基本與第1泳道pUC19/HindⅢMarker條帶相當(dāng)，可以判斷其為質(zhì)粒載體，下面一條條帶比較暗，與DL5000Marker泳道相比，其位于100bp、250bp之間，可以判斷其大小為125bp；另外，在PCR產(chǎn)物電泳圖中可以看到這幾個(gè)組重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物最明亮的條帶比DL5000中250bp的條帶稍微靠上一點(diǎn)，即其大小稍大于250bp，由于空載體上下引物之間距離約為150bp，因此判斷為單拷貝插入125bp片段。（2）第2組：插入片段大小為2322bp。酶切電泳圖中可以看到酶切產(chǎn)物有兩條條帶，上面一條位置與第一泳道酶切空載體位置相當(dāng)，下面條帶與λ-HindMarker泳道的2322bp條帶位置相當(dāng)；并且上下兩條帶的亮度基本一致，再結(jié)合上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，可以斷定此組為單拷貝插入2322bp片段。（3）第3、7、10、11組：插入片段大小為2027bp。酶切電泳圖中可以看到酶切產(chǎn)物有兩條條帶，上面一條位置與第一泳道酶切空載體位置相當(dāng)，下面一條與λ-HindMarker泳道的2027bp條帶位置相當(dāng)；同樣的上下兩條帶的亮度基本一致，再結(jié)合上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，可以斷定此組為單拷貝插入2027bp片段。（4）第8組：插入片段大小為6557bp。酶切電泳圖中可以看到酶切產(chǎn)物有兩條條帶，下面一條位置與第一泳道酶切空載體位置相當(dāng)，可以判斷其為質(zhì)粒載體，上面一條與λ-HindMarker泳道的6557bp條帶位置相當(dāng)；同樣的上下兩條帶的亮度基本一致，再結(jié)合上次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷，可以斷定此組為單拷貝插入6557bp片段。（5）第9組：插入片段大小為23130bp。判斷依據(jù)如上。（6）第12組：多拷貝插入2322bp片段和6557bp片段。酶切電泳圖中可以看到酶切產(chǎn)物有三條條帶，中間一條位置與第一泳道酶切空載體位置相當(dāng)，可以判斷其為質(zhì)粒載體，最上面一條與λ-HindMarker泳道的6557bp條帶位置相當(dāng)，最下面一條與2322bp條帶位置相當(dāng)；再結(jié)合上次實(shí)驗(yàn)電泳結(jié)果——插入片段約為9kb，可以斷定此組為多拷貝插入2322bp片段和6557bp片段。2、PCR電泳圖分析：（1）各組的產(chǎn)物大小：從電泳圖中可以看到第一輪中第1—4組以及第7—12組各組均有一條明亮的條帶，其位置接近DL5000Marker的750bp條帶，模板為插入564bpλDNA片段的重組質(zhì)粒DNA，空載體上下引物距離約為150bp，PCR產(chǎn)物大小符合預(yù)期。并且沒(méi)有非特異性條帶的出現(xiàn)，由此可以判斷對(duì)于該模板而言本次PCR比較成功。（2）圖中看到第5、6組除了在750bp附近的條帶，還有一條大小約為250bp的條帶，出現(xiàn)這條帶的原因可能是：這兩個(gè)組各做了兩組PCR反應(yīng)體系，推測(cè)操作者在加完第一個(gè)體系的模板（插入125bp片段的重組質(zhì)粒）后沒(méi)有換槍尖，直接又在第二個(gè)體系中加第二種模板，在反應(yīng)中有兩種模板均得到擴(kuò)增，因此電泳結(jié)果出現(xiàn)兩條條帶（3）圖中還可以看到，第一輪各組所用模板一致，但各組條帶的亮度卻不一致，分析原因可能是：PCR反應(yīng)體系中各種反應(yīng)液（ddH2O除外）都是微量的，由于各操作者的操作不一致性以及移液槍的精確性差異都會(huì)導(dǎo)致制備的反應(yīng)體系中各反應(yīng)液量不一致，因此最終得到的目的條帶的量會(huì)存在一定差異。另外，在電泳上樣時(shí)，各組的上樣量也會(huì)有微量差異。（4）圖中可以看到，第二輪中各組的電泳結(jié)果很不理想，非特異性條帶比較多。除了最下面那條比較亮的目的條帶——大小約為250bp（稍大于250bp）外，還有3條非特異性的條帶：其大小從上到下依次約為3000bp、2000bp、500bp。500bp這條非特異性條帶出現(xiàn)的可能原因分析：①該P(yáng)CR反應(yīng)設(shè)定的延伸的溫度和時(shí)間對(duì)于模板1（插入564bp片段的重組質(zhì)粒）而言比較合適，可能對(duì)于相對(duì)較小的模板2（插入125bp片段的重組質(zhì)粒）而言不是最合適的。②這些組使用的模板是上次實(shí)驗(yàn)各組提取的重組質(zhì)粒DNA，不可避免的會(huì)摻雜微量的細(xì)菌染色體DNA，導(dǎo)致非特異性條帶的擴(kuò)增。由于四個(gè)組均出現(xiàn)相似的情況，基本可以排除操作中細(xì)菌或DNA污染反應(yīng)體系這種可能性。（5）可以看到第二輪中本組(3組)PCR失敗，沒(méi)有出現(xiàn)目的條帶，但在約2kb處出現(xiàn)一條很暗的雜帶。分析原因：因?yàn)橛须s帶的出現(xiàn)，不可能是模板沒(méi)有加到體系中，由于酶的加液量很小，所以很可能是Taq酶沒(méi)有加到反應(yīng)體系中。（6）可以看到第11組第二輪PCR產(chǎn)物電泳條帶比較暗，但其位置與第一輪各組條帶位置相當(dāng)。很可能是因?yàn)槠渖蠘訒r(shí)，將樣液點(diǎn)漂，導(dǎo)致條帶很暗。3、在酶切電泳圖1中可以看到，插入片段為125bp的各組的酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果中，在空載體條帶的下方都出現(xiàn)了一條很暗的條帶，而且與對(duì)應(yīng)的超螺旋質(zhì)粒比較，該條帶位置稍靠上。經(jīng)分析，這條帶應(yīng)該是開(kāi)環(huán)的重組質(zhì)粒DNA。因?yàn)闉槭?25bp條帶能夠在電泳圖上顯示出來(lái)，對(duì)插入125bp片段的重組質(zhì)粒進(jìn)行過(guò)量酶切，因此不可避免存在沒(méi)有被酶切完全的質(zhì)粒；假設(shè)其為線性質(zhì)粒，與λ-HindⅢMarker相比，該條帶大小約2kb，不符合實(shí)際，因此斷定其為開(kāi)環(huán)質(zhì)粒DNA。4、上次實(shí)驗(yàn)報(bào)告結(jié)果判斷中，我判斷錯(cuò)了三個(gè)結(jié)果：第2、3、7、10、11組判斷插入片段為2027bp或2322bp，沒(méi)有給出確切的答案，實(shí)際為第2組插入片段大小為2322bp，第3、7、10、11組插入片段大小為2027bp；第9組判斷為9416bp，實(shí)際為23130bp；第12組沒(méi)有判斷，實(shí)際應(yīng)為多拷貝插入2322bp片段和6557bp片段。錯(cuò)誤原因：①在判斷第2、3、7、10、11組的結(jié)果時(shí)，只是利用超螺旋重組質(zhì)粒條帶與SupercoiledDNAMarker條帶比較，而沒(méi)有充分利用各組的線性帶與DL5000DNAMarker和λ-HindⅢMarker進(jìn)行比較。由于插入2322bp片段、2027bp片段的重組質(zhì)粒其超螺旋電泳條帶位置非常接近，在比較時(shí)不好判斷是跑膠本身的偏移偏差還是相似條帶大小不一帶來(lái)的必然結(jié)果，因此還應(yīng)該利用其線性條帶進(jìn)行進(jìn)一步的判斷。②第9組的判斷錯(cuò)誤原因：查閱資料得知，當(dāng)重組質(zhì)粒超過(guò)20kb時(shí)，很難轉(zhuǎn)