一種多溴聯(lián)苯醚對海洋赤潮微藻和米氏凱倫藻的生物毒性效應(yīng)

一種多溴聯(lián)苯醚對海洋赤潮微藻和米氏凱倫藻的生物毒性效應(yīng)

二苯基巴比妥酸鹽（pbde）是一種新型、高生態(tài)風(fēng)險的永久性有機污染物。從1979年首次在環(huán)境中檢測到PBDEs以來,已經(jīng)在大氣、土壤、水和沉積物等多種環(huán)境介質(zhì)中檢測到PBDEs污染,近年來更呈現(xiàn)出快速增長的趨勢。海洋是地球上各種污染物的最終歸宿。海水、海洋沉積物和多種海洋生物體如貝類、魚類、海鳥及哺乳類生物體內(nèi)均檢測到較高濃度的PBDEs,其中低溴代PBDEs,如BDE-47(tetra-BDEs)、BDE-99(penta-BDEs)等,易于在有機體內(nèi)富集,是生物體內(nèi)PBDEs污染物的主要成分。PBDEs含量能隨海洋生態(tài)系統(tǒng)中營養(yǎng)級升高而增大,具有明顯的生物放大作用,進而對食物網(wǎng)不同營養(yǎng)級上生物體產(chǎn)生急、慢性毒性作用,最終影響到人類的健康。海洋浮游植物是海洋食物鏈的基礎(chǔ),也是環(huán)境有機污染物從海洋進入食物網(wǎng)的重要途徑。關(guān)于PBDEs對浮游植物的研究有一些報道,但目前主要集中在淡水中,對海洋微藻的研究較少,僅有的研究也多集中于對其急性毒性效用研究方面,系統(tǒng)研究PBDEs對海洋微藻的生理生態(tài)學(xué)效應(yīng)尤其是海洋微藻對PBDEs脅迫的響應(yīng)機制研究在國內(nèi)外還未見報道。本研究以五溴聯(lián)苯醚產(chǎn)品的主要成分—已知對生物體毒性較強的四溴代BDE-47污染物為脅迫因子,以中國沿海常見的一種赤潮微藻——米氏凱倫藻為目標,在實驗生態(tài)條件下從種群、生理生化以及亞細胞水平上研究了不同濃度的BDE-47脅迫對微藻的毒性效應(yīng),探討了可能的作用機制。研究將為系統(tǒng)闡明PBDEs對海洋生態(tài)系統(tǒng)的影響提供基礎(chǔ)的實驗依據(jù)。1材料和方法1.1培養(yǎng)微藻、穩(wěn)定的海水淡化工程實驗用微藻:米氏凱倫藻(Kareniamikimotoi)取自中國海洋大學(xué)生態(tài)學(xué)實驗室。微藻培養(yǎng)過程中所用海水為取自青島市魯迅公園的自然海水,經(jīng)沉淀、過濾(0.45μm微孔濾膜),121.3℃滅菌20min后用于藻類的培養(yǎng)。微藻培養(yǎng)的三角瓶預(yù)先用1mol/L的HCl浸泡24h,蒸餾水沖洗干凈后于121.3℃滅菌20min。培養(yǎng)過程中,將已知起始密度的目標微藻接種于經(jīng)f/2培養(yǎng)液加富的滅菌海水中。微藻的培養(yǎng)溫度為(22±1)℃,光照強度為80μmolphoton/m2·s,光暗周期12h∶12h。培養(yǎng)過程中定時搖動以防止其附壁生長。所用污染物:四溴聯(lián)苯醚—BDE-47(GC-MS級)為德國AccuStandard公司生產(chǎn)的液態(tài)成品,母液濃度為50mg/L,溶劑為異辛烷。實驗時用異辛烷(AR,國藥集團化學(xué)試劑有限公司)將母液稀釋至所需濃度加入至實驗體系中。由于異辛烷為有機溶劑,可能對微藻的生長產(chǎn)生影響從而影響到最終BDE-47的實驗結(jié)果,因此在預(yù)實驗中首先開展了溶劑無明顯效應(yīng)濃度值(noobservedeffectconcentration,NOEC)的研究以消除溶劑對實驗結(jié)果的影響。預(yù)實驗時在米氏凱倫藻培養(yǎng)體系中加入不同體積比的異辛烷為:0,0.25%,0.5%、1%,2%,4%(v/v),96h后測定藻細胞數(shù),計算NOEC。異辛烷對米氏凱倫藻的NOEC為1%(v/v)。在后續(xù)的實驗中控制溶劑異辛烷的加入量不超過1%(v/v)。1.2實驗設(shè)計1.2.1密度、計數(shù)和相對增長率測定u在預(yù)實驗基礎(chǔ)上以2～2.5倍遞增的規(guī)律設(shè)定急性毒性實驗的濃度梯度。用異辛烷稀釋BDE-47母液后加入微藻培養(yǎng)體系中,使其終濃度分別為:0、0.009、0.025、0.05、0.125、0.312mg/L。將處于指數(shù)生長期的微藻接種于250mL錐形瓶中,使其初始細胞數(shù)為1.0×104/mL,實驗總體積為150mL。實驗以不加入BDE-47的一組為空白對照組,以加入實驗濃度下最大體積的異辛烷的一組為溶劑對照組,每實驗設(shè)3個平行組(n=3)。整個實驗周期為96h,每隔24h取樣,Lugol碘液固定,血球計數(shù)板計數(shù),計算微藻種群的密度變化、相對增長率的變化,并計算EC50。相對增長率按照以下公式計算:K=lnNt?lnN0TΚ=lnΝt-lnΝ0Τ其中:Nt為培養(yǎng)t時刻的細胞數(shù);N0為起始細胞數(shù);T為培養(yǎng)時間(h)。1.2.2抗氧化酶活性測定選擇微藻與有機污染物脅迫響應(yīng)密切相關(guān)的谷胱甘肽解毒系統(tǒng)的四個指標:谷胱甘肽過氧化物酶(glutathioneperoxidase,GPx)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(gultathioneStransferases,GST)、谷胱甘肽還原酶(glutathionereductase,GR)以及還原型谷胱甘肽含量(gultathione-SH,GSH)。在急性毒性實驗基礎(chǔ)上設(shè)置脅迫濃度。處于指數(shù)生長期的米氏凱倫藻接種于300mL三角瓶中,使其起始細胞數(shù)達到5×104/mL。在培養(yǎng)體系中加入BDE-47母液,使終濃度為0.250mg/L,其他培養(yǎng)條件如1.1所述。分別取培養(yǎng)到第0d、5d、10d、15d、20d的藻液10mL,4℃、5000r/min離心20min,收集藻細胞,提取粗酶液。GPx活性采用Lawrence方法進行;GST活性測定參照Habig的方法;GR活性的測定參照Foyer方法;抗氧化劑GSH測定參照Griffiths方法;可溶性蛋白的含量測定采用Bradford的方法。酶活性的測定用酶標儀(SpectraMAX190)在相應(yīng)的波長條件下進行檢測。所檢測的酶活性以酶單位/mg蛋白(U/mg)表示。每實驗組設(shè)3組平行(n=3)。1.2.3透射電子顯微鏡transmis觀察,有關(guān)檢測取10mL0.250mg/L脅迫18d的微藻藻液,在4℃下,以3500r/min離心15min,收集藻細胞,用2.5%的戊二醛(0.lmol/L磷酸緩沖液配制,pH=7.2)固定,以0.lmol磷酸緩沖液洗滌3次后用1%的鋨酸(0.lmol/L磷酸緩沖液配制,pH=7.4)于4℃保存3h,用乙醇以10%的遞增率逐級脫水,環(huán)氧樹脂滲透、包埋,LKB-NOVA型超薄切片機切片,檸檬酸鉛染色,透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,HITACHI-700TEM)觀察并拍照。1.2.4污染脅迫對產(chǎn)酶活性的影響利用SPSS16.0one-wayANOVA在α=0.05水平上進行組間差異性分析。使用Sigmaplot10.0作圖,數(shù)值以平均值±標準誤(mean±SE)給出(n=3)。利用單因子方差分析的Tukey’spost-hoc多重比較檢驗(Tukey’spost-hocmultiplecomparisontests)檢測污染脅迫對酶活性的影響;利用雙變量Pearson相關(guān)性分析研究抗氧化組分(酶活性或抗氧化劑含量)變化之間的相關(guān)性,P<0.05認為顯著相關(guān),P<0.01認為極顯著相關(guān)。2結(jié)果與討論2.1兩組患者的ec50不同濃度的BDE-47脅迫均可對米氏凱倫藻種群增長產(chǎn)生顯著的抑制作用:在同一濃度條件下隨著脅迫時間的延長,微藻種群的相對增長率在逐漸下降(圖1-A);同時,在特定的時間條件下細胞數(shù)量的變化也表現(xiàn)出明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系(圖1-B),即脅迫濃度越高,對種群細胞數(shù)量的抑制越明顯。以96h的實驗結(jié)果為例:0.125mg/L處理組中米氏凱倫藻的抑制率達到45%,而0.312mg/L組中的抑制率則可升至52%。pairedt-test分析結(jié)果表明,實驗組與對照組之間的差異均達到顯著水平(P<0.05)。利用概率單位回歸求得48h和96h的EC50分別為0.164、0.219mg/L(表1)。依據(jù)國家環(huán)?？偩帧吨腥A人民共和國環(huán)境保護行業(yè)標準—新化學(xué)物質(zhì)危害評估導(dǎo)則》規(guī)定對本實驗中所得到的EC50值進行分析,結(jié)果顯示BDE-47屬于極高毒性物質(zhì)(EC50≤1mg/L)。急性毒性的實驗結(jié)果與孟范平、Kallqvist等相一致,但所得到的EC50數(shù)值卻差異較大,可能原因在于:(1)所用微藻種類不同。不同門類的微藻如綠藻門、甲藻門、硅藻門等具有不同的細胞結(jié)構(gòu),比如細胞壁的有無或是否具備甲板、硅質(zhì)殼等結(jié)構(gòu)均會影響到微藻細胞對外源脅迫的耐受強度。本實驗所用的米氏凱倫藻盡管沒有細胞壁,但是卻具有外殼(epitheca),在一定程度上保護細胞免受傷害。(2)助溶劑的差異。常見BDE-47的助溶劑為丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜等,本實驗根據(jù)購買的液體BDE-47試劑而確定所用溶劑為異辛烷。不同的助溶劑與有機物表現(xiàn)出不同的聯(lián)合效應(yīng)。(3)本實驗所用脅迫濃度均為理論濃度,而非BDE-47在水溶液中的實際濃度。關(guān)于BDE-47在水中的濃度還需要進一步測定。2.2抗氧化系統(tǒng)活性在谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)中,米氏凱倫藻GPx活性在脅迫前10d可被顯著誘導(dǎo),其活性明顯高于對照組(P<0.05);之后隨著脅迫時間的延長下降明顯,與對照組相比差異顯著(P<0.05);第20d時GPx活性下降至對照組的44%,差異極顯著(P<0.01)(圖2-A)。與GPx的變化不同,在脅迫前5d時間內(nèi)GST活性沒有被顯著誘導(dǎo)(P>0.05),僅僅略高于對照組;之后處理組的GST活性顯著降低(P<0.05),且隨著時間的延長下降趨勢更加明顯,在第15d、20d,GST活性分別下降至對照組的47.3%,72.7%(P<0.01)(圖2-B)。如圖2-C,GR的活性變化與GST的極為類似,均是在脅迫的前5d變化不顯著(P>0.05),之后有所降低,且隨著時間延長活性下降的趨勢更為明顯(P<0.05)。整個脅迫周期內(nèi),GR活性于第20d降到最低,比該時間點的對照組相比降低了68.2%(P<0.01)。相似的,在最初的5d內(nèi)處理組GSH含量略有下降,但與對照組無顯著差異(P>0.05),之后均顯著低于相應(yīng)對照組(P<0.05),且隨著時間延長下降趨勢更為明顯,其中在10d、20d分別下降了39.2%(P<0.01)、47.9%(P<0.01)(圖2-D)。當生物體受到環(huán)境脅迫(溫度、鹽度的變化,污染物暴露等)時體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS),進而產(chǎn)生氧化損傷(oxidativeinjury)。生物體可通過抗氧化系統(tǒng)的防御機制來緩解這種氧化脅迫,其中谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)是生物體內(nèi)重要的抗氧化防御體系,也是生物解毒系統(tǒng)第二階段的重要生理過程。有關(guān)谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)對外源有機污染物脅迫響應(yīng)的研究已有一些報道,比如葡萄牙南岸海洋蛤蜊(Ruditapesdecussatus)體內(nèi)的GPx活性能被PCHs、PCBs等顯著誘導(dǎo),可作為監(jiān)測該區(qū)域環(huán)境污染物水平的生物標志物;歐洲鰻鱺的標志物反應(yīng)發(fā)現(xiàn),GPx、GST活性及GSH含量變化對葡萄牙PateiradeFermentelos淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)的環(huán)境變化具有的靈敏氧化應(yīng)激響應(yīng)。在本實驗中,BDE-47均可以誘導(dǎo)GPx、GST、GR活性及GSH含量的變化,表明谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)在米氏凱倫藻抵御BDE-47脅迫中可能發(fā)揮重要的作用。谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)中的酶類或非酶類物質(zhì)在脅迫下的響應(yīng)有所不同。本實驗中,隨著BDE-47脅迫時間的加長,GPx和GST活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,但變化較小;而GR活性及GSH含量不斷下降,隨著脅迫時間的延長變化最靈敏。這與王悠等發(fā)現(xiàn)GPx是鱸魚(Lateolabraxjaponicus)對十二烷基苯磺酸鈉和苯并芘脅迫響應(yīng)中最為靈敏的生物標志物,而GST、GSH變化相對較小的結(jié)論相一致。同時對這些指標進行Pearson相關(guān)系數(shù)分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)多種指標之間存在相關(guān)性(表2)。多種抗氧化組分在功能上具有一定的重疊性,可以相互聯(lián)系、相互調(diào)節(jié),因此這可能是導(dǎo)致活性(含量)之間存在一定相關(guān)性的原因。其中GR與GST、GSH之間呈現(xiàn)明顯的相關(guān)性,可作為指示BDE-47污染脅迫的生物標志物系統(tǒng)的成分之一,為指示海洋中的BDE-47污染變化提供預(yù)警性。2.3類囊體膜系統(tǒng)的消失從圖3-A,B中可以看出,對照組的細胞輪廓十分清晰,呈現(xiàn)橢圓形至梨形;細胞膜連續(xù)平滑;色素體沿質(zhì)膜內(nèi)側(cè)分布,結(jié)構(gòu)完整,膜系統(tǒng)發(fā)達,內(nèi)部的類囊體整齊平行排列;線粒體、細胞核、淀粉體和蛋白核等細胞結(jié)構(gòu)清晰可見。經(jīng)過BDE-47脅迫后,米氏凱倫藻細胞輪廓依舊清晰,但細胞內(nèi)基質(zhì)出現(xiàn)了許多高電子密度區(qū)域,還有大的不規(guī)則透明空泡(圖3-C)。細胞器結(jié)構(gòu)受到明顯破壞,其中色素體系統(tǒng)損傷嚴重,類囊體腫脹,片層結(jié)構(gòu)模糊不清,有的出現(xiàn)溶解消失,類囊體膜系統(tǒng)幾近崩潰(圖3-D);線粒體數(shù)量減少,結(jié)構(gòu)嚴重變形,內(nèi)嵴大部分溶解;盡管核仁清晰可見、核內(nèi)基質(zhì)濃厚,但細胞核兩層膜中間形成空泡,部分核膜破裂(圖3-C)。對比脅迫前后米氏凱倫藻超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),BDE-47可對亞細胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生明顯的損傷,其中以線粒體和葉綠體等損傷最為明顯。完整有序的細胞結(jié)構(gòu)是微藻各項生理生化活動順利進行的基礎(chǔ),所以BDE-47所引起米氏凱倫藻超微結(jié)構(gòu)的變化必將影響細胞活動的發(fā)生。葉綠體的數(shù)量及結(jié)構(gòu)的變化可以反映光合作用能力,其中類囊體是光反應(yīng)的場所,是葉綠體的核心結(jié)構(gòu)。類囊體整齊有序的排列方式能保證較大的光面積和光合速率,而BDE-47破壞了片層結(jié)構(gòu)及垛疊程度,影響了米氏凱倫藻光能吸收;同時,類囊體膜系統(tǒng)的崩潰導(dǎo)致電子傳遞的各種成分無法準確分布和定位,影響電子傳遞鏈的正常運轉(zhuǎn)。BDE-47阻礙了光合作用的發(fā)生,進而對米氏凱倫藻的代謝產(chǎn)生毒害作用。線粒體是真核生物進行氧化代謝的部位,是糖酵解和三羧酸循環(huán)發(fā)生的場所,是細胞的“動力工廠”。同時線粒體還參與細胞周期調(diào)控、細胞生長、抗病毒響應(yīng)及細胞凋亡等過程,被稱