玉米淀粉生產(chǎn)乳酸的米根霉hb12的篩選

玉米淀粉生產(chǎn)乳酸的米根霉hb12的篩選

硫酸乳（1actacid）的學(xué)名是2-羥色胺。這是一種重要的多功能酸。這是世界上應(yīng)用最廣泛的三種酸之一。乳酸、乳酸鹽及其衍生物廣泛用于食品、制藥、制革、紡織、環(huán)保和農(nóng)業(yè)中。近年來,L-乳酸作為生產(chǎn)聚乳酸的原料而倍受重視。聚乳酸作為無毒、可降解的生物相容性高分子材料可用來制造生物可降解塑料、綠色包裝材料和藥用修復(fù)材料等,緩解了能源及環(huán)境危機(jī),因此具有廣闊的應(yīng)用前景。乳酸的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法以及微生物發(fā)酵法。微生物發(fā)酵法生成乳酸因其原料來源廣泛、生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品光學(xué)純度高、安全性好等優(yōu)點(diǎn)而成為生產(chǎn)乳酸的重要方法,因此近年來利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸已經(jīng)成為乳酸研究熱點(diǎn)之一。生產(chǎn)菌株的選育是發(fā)酵生產(chǎn)乳酸研究中最為重要的工作之一,提高菌株發(fā)酵水平是降低乳酸生產(chǎn)成本的關(guān)鍵措施之一。目前生產(chǎn)乳酸的菌株主要有霉菌中的根霉屬和細(xì)菌中的乳酸菌屬。根霉屬中常用的菌種有米根霉(Rhizopusoryzae)、行走根霉(R.stolonifer)、小麥曲根霉(R.ritici)和美麗根霉(R.elegans)等。由于米根霉發(fā)酵生產(chǎn)乳酸具有光學(xué)純度高、營養(yǎng)需求簡單、好氧發(fā)酵及產(chǎn)物容易提純等優(yōu)點(diǎn),而成為國內(nèi)外工業(yè)生產(chǎn)乳酸普遍采用的菌種。為節(jié)省乳酸發(fā)酵成本,近年來關(guān)于乳酸的研究主要集中在發(fā)酵原料的選擇。玉米來源豐富、價(jià)格低廉,因此在乳酸工業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用玉米加工產(chǎn)物,如玉米生粉、玉米淀粉等。國內(nèi)外專家學(xué)者在利用玉米生粉、玉米淀粉發(fā)酵生產(chǎn)乳酸方面進(jìn)行了大量的研究。如白冬梅等研究了淀粉酶、纖維素酶等對米根霉發(fā)酵玉米生粉生產(chǎn)乳酸的影響,確定了各種酶的最佳用量,在玉米生粉質(zhì)量濃度為140g/L時(shí)乳酸產(chǎn)量達(dá)71.65g/L。Tay等利用米根霉在旋轉(zhuǎn)纖維床生物反應(yīng)器中發(fā)酵玉米淀粉生成L-乳酸,乳酸的收率接近100%,最高質(zhì)量濃度達(dá)127g/L,生成速率最高達(dá)1.65g/(L·h)。本實(shí)驗(yàn)從河北承德地區(qū)的土壤中篩選到的一株米根霉HB12,該菌能直接利用高濃度玉米淀粉高效轉(zhuǎn)化為乳酸。重點(diǎn)研究該菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的營養(yǎng)需求及發(fā)酵條件,為其應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)提供依據(jù)。1材料和方法1.1米根霉hb12乳酸標(biāo)準(zhǔn)品美國Sigma公司;玉米淀粉福建塞翁福食品股份有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。米根霉(Rhizopusoryzae)HB12,由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保存。初始發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖100,(NH4)2SO42,KH2PO40.3,MgSO4·7H2O0.3,ZnSO4·7H2O0.05,CaCO370(單獨(dú)滅菌),自然pH值。1.2培養(yǎng)基成分的篩選在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中,接種100μL(孢子數(shù)為108個(gè)/mL)的HB12孢子懸浮液,于裝有50mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,37℃、200r/min發(fā)酵培養(yǎng)96h,收集發(fā)酵液于12000r/min離心10min,取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)檢測其乳酸產(chǎn)量,以篩選出最佳培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件。1.2.1最佳碳源和氮源的確定分別選取100g/L的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糯米淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、紅薯淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源,其余組分不變,接種和培養(yǎng)方法不變,考察不同碳源對HB12發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。確定最佳碳源后,分別選取2g/L的酵母膏、蛋白胨、豆粕粉、硫酸銨、尿素和氯化銨代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源,其余組分不變,接種和培養(yǎng)方法同上,比較不同氮源對HB12發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。在確定最佳碳源和氮源后,分別添加50、60、70、80、90g/L的CaCO3,其他成分相同,比較不同中和劑碳酸鈣添加量對HB12發(fā)酵產(chǎn)酸的影響。為探討KH2PO4、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O對HB12產(chǎn)酸的影響,在預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn),以確定最佳無機(jī)鹽離子質(zhì)量濃度。1.2.2接種量對乳酸產(chǎn)量的影響溫度的影響:分別在30、33、35、37℃和40℃條件下發(fā)酵培養(yǎng),考察不同溫度對乳酸產(chǎn)量的影響。接種量的影響:將108個(gè)/mL的孢子液分別接種15、25、50、100μL和200μL,考察不同接種量對乳酸產(chǎn)量的影響。裝液量的影響:采用250mL三角瓶,裝液量分別為30、40、50、60mL和70mL,其他條件相同,考察不同裝液量對乳酸產(chǎn)量的影響。1.2.3確定最佳產(chǎn)酸量的確定在最佳培養(yǎng)基組成和最佳培養(yǎng)條件下,進(jìn)行搖瓶發(fā)酵,分別于24、36、48、60、72、84、96、108h和120h時(shí)取樣,所得發(fā)酵液于12000r/min離心10min,取上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)檢測其乳酸產(chǎn)量,確定達(dá)到最大產(chǎn)酸量的時(shí)間。1.2.4l-乳酸測定葡萄糖測定:采用高效液相色譜分析,色譜柱為Waters的氨基糖柱,流動相為乙腈-水(體積比75:25)的混合液,流速為1mL/min,進(jìn)樣量為20μL,柱溫為40℃。L-乳酸定量檢測:高效液相色譜分析,色譜柱為迪馬公司的C18反相柱(4.6mm×250mm,5μm);流動相為0.01mol/L的磷酸氫二銨溶液,用磷酸調(diào)pH值至2.6,經(jīng)0.45μm孔徑合成纖維素酯膜過濾后,超聲脫氣1h;流速0.8mL/min,檢測波長210nm,進(jìn)樣量20μL,柱溫為室溫。建立乳酸工作曲線外標(biāo)方程,依此計(jì)算乳酸產(chǎn)量。2結(jié)果與分析2.1由于培養(yǎng)基成分的優(yōu)化2.1.1玉米淀粉添加量對酸奶發(fā)酵的影響如表1所示,米根霉HB12利用單糖、二糖以及淀粉類碳源發(fā)酵生產(chǎn)乳酸能力都較為良好,其中利用蔗糖能力最強(qiáng),其次為玉米淀粉?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)乳酸的發(fā)酵成本,選用玉米淀粉作為發(fā)酵碳源。利用低成本的玉米淀粉生產(chǎn)高附加值的乳酸對合理開發(fā)利用玉米、循環(huán)利用資源、發(fā)展農(nóng)村經(jīng)濟(jì)有著積極而又重要的意義。試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了玉米淀粉的添加量,結(jié)果如表2所示。HB12可以較好地利用不同質(zhì)量濃度的玉米淀粉,尤其是能有效利用高質(zhì)量濃度的玉米淀粉來生產(chǎn)乳酸。其中140g/L玉米淀粉能產(chǎn)85.8g/L的乳酸,轉(zhuǎn)化率為61.3%,160g/L玉米淀粉能產(chǎn)93.4g/L的乳酸,轉(zhuǎn)化率為58.4%。綜合考慮成本、產(chǎn)量以及轉(zhuǎn)化率等因素,選取140g/L玉米淀粉為發(fā)酵碳源。通常米根霉能產(chǎn)生淀粉酶和糖化酶,因此可以利用淀粉或淀粉質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。試驗(yàn)在發(fā)酵液中檢測到淀粉酶酶活和葡萄糖,可以推測米根霉HB12通過分泌淀粉酶等將高質(zhì)量濃度的玉米淀粉有效地分解為小分子糖,進(jìn)而轉(zhuǎn)化為乳酸。2.1.2發(fā)酵氮源的確定確定最佳碳源后,進(jìn)一步研究不同氮源對米根霉HB12產(chǎn)酸影響。氮源對米根霉HB12發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響試驗(yàn)如表3所示。不同氮源對HB12產(chǎn)酸影響較大。無機(jī)氮源比有機(jī)氮源更利于該菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸,當(dāng)?shù)礊闊o機(jī)氮源時(shí)產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率均高于有機(jī)氮源。其中當(dāng)?shù)礊槁然@時(shí)產(chǎn)量最高,達(dá)91.0g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)65.0%。無機(jī)氮源比有機(jī)氮源價(jià)格低,故使用氯化銨作為氮源有助于降低生產(chǎn)成本。試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了氯化銨的添加量結(jié)果如圖1所示,氯化銨添加量對HB12產(chǎn)酸影響很大,當(dāng)氯化銨質(zhì)量濃度較低時(shí)乳酸產(chǎn)量也不高,隨著氯化銨質(zhì)量濃度的增大,乳酸產(chǎn)量不斷提高,當(dāng)超過2g/L時(shí)乳酸產(chǎn)量下降。故選擇2g/L的氯化銨作為發(fā)酵氮源。氮源的質(zhì)量濃度對微生物的菌體生長和產(chǎn)物產(chǎn)量有較大的影響,當(dāng)?shù)床蛔銜r(shí)會使菌體生長緩慢或產(chǎn)物產(chǎn)量過低,而當(dāng)?shù)促|(zhì)量濃度過高,又會造成菌體快速生長,消耗過多的糖,使得產(chǎn)物質(zhì)量濃度較低。2.1.3碳酸鈣添加量對乳酸發(fā)酵過程的影響從表4可以看出,當(dāng)碳酸鈣添加量小于80g/L時(shí),不能夠充分中和發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸,產(chǎn)物抑制明顯,但當(dāng)添加量超過80g/L時(shí),又使得發(fā)酵后期液體變黏稠,影響了發(fā)酵過程。因此,選取碳酸鈣添加量為80g/L。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,產(chǎn)酸量不斷增加,pH值也隨之下降,從而抑制發(fā)酵的繼續(xù)進(jìn)行。因此乳酸發(fā)酵過程一般通過添加中和劑來調(diào)節(jié)pH值進(jìn)行發(fā)酵。碳酸鈣作為乳酸發(fā)酵過程的中和劑,可將乳酸沉淀下來,減輕乳酸的反饋抑制作用,其添加量對細(xì)胞生長及產(chǎn)酸均有一定的影響。若加入量過少,乳酸中和不完全,產(chǎn)物抑制不能解除,導(dǎo)致產(chǎn)酸量不高;若加入量過多,使發(fā)酵后期發(fā)酵液變黏稠甚至凝固,也會影響發(fā)酵過程,從而使得乳酸產(chǎn)量下降。因此,在發(fā)酵過程中確定合適的碳酸鈣添加量是非常必要的。2.1.4kh2po4最佳添加量的確定為確定最佳的KH2PO4、ZnSO4·7H2O、MgSO4·7H2O和FeSO4·7H2O的無機(jī)鹽離子質(zhì)量濃度,設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn),因素和水平設(shè)計(jì)方案和結(jié)果見表5。根據(jù)表5的極差分析,可得出影響因素的主次順序是A>C>D>B。KH2PO4的質(zhì)量濃度對產(chǎn)酸的影響較大,其次是MgSO4·7H2O,FeSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O的影響最小,最優(yōu)組合為A2B2C2D1,經(jīng)驗(yàn)證,此條件下得乳酸產(chǎn)量為96.5g/L,均高于其他試驗(yàn)組,故使用A2B2C2D1作為最佳無機(jī)鹽離子,即KH2PO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O的添加量分別為0.3、0.3、0、0.05g/L較為合適。經(jīng)優(yōu)化后得到發(fā)酵培養(yǎng)基最佳組成成分為:玉米淀粉140g/L、NH4Cl2g/L、KH2PO40.3g/L、MgSO4·7H2O0.3g/L、ZnSO4·7H2O0.05g/L、CaCO380g/L。2.2優(yōu)化輸入條件下牛奶發(fā)酵條件的結(jié)果2.2.1溫度對乳酸產(chǎn)量的影響從表6可以看出,在35℃以下時(shí),隨著溫度升高,產(chǎn)乳酸量也明顯提高,隨著溫度繼續(xù)上升,產(chǎn)酸量下降,40℃時(shí)乳酸產(chǎn)量下降至83.7g/L。35℃時(shí)達(dá)到最大值,乳酸產(chǎn)量為96.5g/L,轉(zhuǎn)化率為68.9%。微生物的生長和產(chǎn)物的合成都是在各種酶的催化下進(jìn)行的,溫度是保證微生物生長和產(chǎn)酶的重要條件之一。當(dāng)溫度過低或過高時(shí),菌體生長緩慢,淀粉酶等活性不高,都會影響到乳酸產(chǎn)量。米根霉HB12在35℃時(shí)菌體生長最好,乳酸產(chǎn)量最好,因此本試驗(yàn)選擇35℃作為培養(yǎng)溫度。2.2.2乳酸產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率如圖2所示,隨著接種量的增加,HB12發(fā)酵產(chǎn)酸量先增加后減少,在接種量為25μL(即孢子數(shù)為2.5×106個(gè))時(shí)乳酸產(chǎn)量最高,其產(chǎn)量為102.1g/L,轉(zhuǎn)化率為72.9%。當(dāng)孢子數(shù)過少時(shí),菌體生長過慢,不利于米根霉生產(chǎn)乳酸,增大接種量可縮短菌體生長達(dá)到高峰的時(shí)間,從而使乳酸生成提前,但隨著接種量的繼續(xù)增大,菌體生長過快,營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快,菌體早衰,使發(fā)酵后勁不足,從而影響產(chǎn)酸量及轉(zhuǎn)化率。2.2.3裝液量對發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的影響確定最佳接種量后,進(jìn)一步考察不同裝液量對HB12產(chǎn)酸的影響,結(jié)果如表7所示。在250mL三角瓶中,隨著裝液量的增加,HB12發(fā)酵產(chǎn)酸量先增加后減少。裝液量越小,相同培養(yǎng)條件下溶氧越大;反之亦然。當(dāng)裝液量30mL逐漸到50mL時(shí),乳酸產(chǎn)量明顯增大,在裝液量為50mL時(shí),產(chǎn)酸量和轉(zhuǎn)化率均最高,對原料利用最充分。繼續(xù)增大裝液量,發(fā)酵產(chǎn)生乳酸的量又有減少的趨勢。裝液量主要影響其溶氧,由此推斷出該菌利用淀粉發(fā)酵產(chǎn)乳酸要求一定的溶氧即可,溶氧過大或過小均不利于乳酸的產(chǎn)生。因此,選擇50mL裝液量。2.3玉米淀粉的發(fā)酵效率在最佳培養(yǎng)基和最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)條件下,考察其生產(chǎn)乳酸過程,結(jié)果見圖3。米根霉前期迅速生長,有效分解玉米淀粉,葡萄糖質(zhì)量濃度快速上升,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,米根霉不斷利用葡萄糖生成乳酸,葡萄糖質(zhì)量濃度逐漸減少直至全部被利用。乳酸產(chǎn)量方面,36h之前基本不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸速度很慢,發(fā)酵36h后乳酸產(chǎn)量迅速增加,在發(fā)酵96h時(shí)已基本完成產(chǎn)酸過程,隨著殘?zhí)堑暮谋M,乳酸幾乎不再增長,在108h時(shí)乳酸產(chǎn)量達(dá)到最大值104.9g/L,之后產(chǎn)酸量不再增加,平均產(chǎn)酸速率達(dá)0.97g/(L·h),對玉米淀粉的轉(zhuǎn)化率達(dá)74.9%。許多研究者針對米根霉發(fā)酵高質(zhì)量濃度玉米淀粉生產(chǎn)乳酸做了大量的研究。如史連生等利用米根霉在3L發(fā)酵罐中,將質(zhì)量濃度為130g/L玉米淀粉轉(zhuǎn)化為94.1g/L乳酸,對糖的轉(zhuǎn)化率為79.6%,在工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的64L發(fā)酵罐中,乳酸產(chǎn)量僅為101.6g/L。而本實(shí)驗(yàn)米根霉HB12在不使用淀粉酶、糖化酶等酶制劑的作用下可直接將140g/L玉米淀粉高效轉(zhuǎn)化為乳酸,通過搖瓶發(fā)酵108h產(chǎn)乳酸104.9g/L,轉(zhuǎn)化率達(dá)74.9%。生產(chǎn)成本低,操作簡單,轉(zhuǎn)化率高,具有很好的工業(yè)應(yīng)用前景。3n