米根霉對(duì)木糖和葡萄糖代謝的影響

米根霉對(duì)木糖和葡萄糖代謝的影響

木纖維是世界上最常見的可再生原材料，也是巖石原料的理想替代品。但目前這些生物質(zhì)資源僅有一小部分為人類所用,更多的是被遺棄或焚燒,資源浪費(fèi)的同時(shí)造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。研究表明木質(zhì)纖維素經(jīng)物理、化學(xué)、生物等方法處理后,可轉(zhuǎn)化為葡萄糖(約占1/2)、木糖(約占1/3)等單糖。前者可進(jìn)一步被微生物有效利用,而后者的利用過程往往受到抑制,成為限制木質(zhì)纖維素有效利用的一大瓶頸。為提高木糖的利用效率,研究者在構(gòu)建工程菌和優(yōu)化發(fā)酵條件等方面做了大量工作,但尚缺乏對(duì)于木糖代謝特征的充分了解,而只有盡可能清晰的了解微生物的代謝過程,才有可能從全局上實(shí)現(xiàn)微生物代謝木糖的過程調(diào)控。米根霉是一種重要的工業(yè)微生物,主要用于富馬酸、乳酸等大宗化學(xué)品以及蛋白酶等酶制劑的生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)外對(duì)米根霉利用五碳糖的研究主要集中于從外部手段優(yōu)化發(fā)酵過程,效果往往不明顯。如Kautola等以少根根霉為發(fā)酵菌株,采用固定化技術(shù)優(yōu)化木糖為碳源的培養(yǎng)條件,經(jīng)10d發(fā)酵,富馬酸最高轉(zhuǎn)化率僅0.24g/g,生產(chǎn)強(qiáng)度僅0.071g/(L·h)。本研究團(tuán)隊(duì)結(jié)合實(shí)踐經(jīng)驗(yàn),采用分步利用木糖和葡萄糖的策略,建立了以木質(zhì)纖維素為原料發(fā)酵制備富馬酸的新工藝,但缺乏深入的理論依據(jù)。本研究以米根霉為研究對(duì)象,通過分析木糖、葡萄糖培養(yǎng)下其胞內(nèi)外物質(zhì)代謝及能量代謝的差異,獲取木糖代謝的關(guān)鍵因素,為工業(yè)發(fā)酵合理利用木糖提供參考,為微生物高效利用木質(zhì)纖維素提供理論研究基礎(chǔ)。1材料和方法1.1材料表面1.1.1細(xì)菌米根霉(Rhizopusoryzae)ME-F12(ATCC20344的誘變菌株),南京工業(yè)大學(xué)代謝工程實(shí)驗(yàn)室保藏。1.1.2濃硫酸調(diào)節(jié)so47hpa培養(yǎng)基組成(g/L):木糖或葡萄糖30,MgSO40.5,KH2PO40.6,ZnSO4·7H2O0.0176,FeSO4·7H2O0.000498,尿素2。用1∶9濃硫酸調(diào)節(jié)至pH3.0。調(diào)整米根霉孢子懸浮液濃度為107個(gè)/mL,取1mL接種至50mL培養(yǎng)基,置于35℃往復(fù)搖床,轉(zhuǎn)速為200r/min,培養(yǎng)54h。1.2殘?zhí)?、有機(jī)酸、atp的測(cè)定1.2.1pH的測(cè)定:pHS-3C型精密酸度計(jì)測(cè)定。1.2.2細(xì)胞干重的測(cè)定:將培養(yǎng)物抽濾,蒸餾水洗滌3次,60℃烘干至恒重,稱重。1.2.3總蛋白的測(cè)定:考馬斯亮藍(lán)法。1.2.4脂肪的測(cè)定:索氏抽提法。1.2.5細(xì)胞內(nèi)碳水化合物的測(cè)定:比色分析法。1.2.6對(duì)糖轉(zhuǎn)化率的測(cè)定:菌體積累量與糖耗量的比值。1.2.7殘?zhí)羌坝袡C(jī)酸的測(cè)定:高效液相色譜法。高效液相色譜工作站DIONEXHPLCP680BIO-RADAminexHPX-87H,300mm×7.8mm;流動(dòng)相:5mmol/LH2SO4;流速:0.8mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:65℃。采用示差檢測(cè)器分析糖,采用紫外檢測(cè)器分析有機(jī)酸,檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。1.2.8NADH,NAD,ATP的提取與分析:取lmL菌液于-40℃甲醇中淬火5min,-8℃5000×g離心5min,棄上清;加入1mL0.1MNaOH或HCl沸水浴10min,冰浴冷卻至0℃,滴加一定量HCl或NaOH進(jìn)行中和,5000×g離心10min,上清用于NADH,NAD,ATP的測(cè)定。NADH,NAD,ATP的分析:高效液相色譜工作站DIONEXHPLCP680,分析柱:sepaxHP-C18column4.6mm×250mm;流動(dòng)相A:0.6%H2PO4(用三乙胺調(diào)pH至6.6),流動(dòng)相B:甲醇,A、B按照9:1配比;流速:1mL/min;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:25℃;紫外波長(zhǎng)254nm。2結(jié)果和討論2.1木糖與葡萄糖混糖培養(yǎng)條件對(duì)米根霉生物量的影響分別以木糖和葡萄糖為碳源培養(yǎng)米根霉,結(jié)果如圖1所示,米根霉利用兩種不同碳源生長(zhǎng)時(shí)存在明顯的差異:以木糖為碳源時(shí),菌體遲滯期較葡萄糖長(zhǎng),這可能與微生物對(duì)六碳糖的偏愛性有關(guān)。但培養(yǎng)結(jié)束時(shí)(54h),以木糖為碳源生物量達(dá)9.93g/L,對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為37.19%;而葡萄糖為碳源的最高生物量?jī)H為7.28g/L,對(duì)糖轉(zhuǎn)化率為25.46%。故相較于葡萄糖,木糖更利于米根霉的生物量積累。將木糖與葡萄糖以等質(zhì)量混合(總糖濃度為30g/L),考察混糖培養(yǎng)條件下米根霉的生長(zhǎng)狀況,結(jié)果如圖2所示。米根霉優(yōu)先利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng),當(dāng)葡萄糖消耗至較低濃度時(shí)(30h,2.5g/L),開始迅速消耗木糖,生物量也從2.5g/L上升到6g/L,在42h生物量達(dá)到最大值6.58g/L;從糖耗和生長(zhǎng)特性可見,米根霉中可能存在類似酵母細(xì)胞的糖轉(zhuǎn)運(yùn)模式,即木糖、葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)基于相同的膜蛋白,而該蛋白對(duì)葡萄糖的親和力較高,故在較高濃度的葡萄糖存在時(shí),木糖的利用受到抑制,而當(dāng)葡萄糖消耗殆盡后,轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可大量轉(zhuǎn)運(yùn)木糖,促進(jìn)其利用。2.2不同菌株對(duì)cod-pcr反應(yīng)的影響取發(fā)酵36h和48h時(shí)兩種碳源培養(yǎng)條件下的米根霉菌體進(jìn)行細(xì)胞組分測(cè)定,其碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪含量如表1所示。以木糖為碳源的培養(yǎng)條件下,細(xì)胞相關(guān)組分的含量明顯高于葡萄糖,碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪的含量,在36h分別比葡萄糖培養(yǎng)下高出42.0%、78.3%、51.3%;在48h分別比葡萄糖培養(yǎng)下高出39.3%、65.2%、31.4%。碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪屬于生物大分子物質(zhì),而木糖在微生物體內(nèi)的代謝主要通過磷酸戊糖途徑(PP途徑),其中涉及NADPH、核糖及其衍生物的大量合成,為生物大分子的合成提供了充足的原料。如脂肪酸的合成,需要足夠的NADPH,僅以葡萄糖為碳源時(shí),主要經(jīng)蘋果酸酶轉(zhuǎn)化蘋果酸,而木糖代謝直接通過PP途徑可以生成大量的NADPH,在不影響TCA循環(huán)的同時(shí),滿足脂肪酸的合成;此外,蛋白質(zhì),碳水化合物等細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)合成過程中,也受到一部分PP途徑中代謝產(chǎn)物的影響。故木糖的利用促進(jìn)了生物大分子物質(zhì)的合成,從而使得培養(yǎng)結(jié)束時(shí)米根霉生物量較葡萄糖為碳源時(shí)高。2.3木糖培養(yǎng)過程中ph的變化考察了米根霉利用木糖、葡萄糖條件下胞外小分子物質(zhì)的代謝情況,結(jié)果如圖3所示。可以明顯看出,葡萄糖培養(yǎng)條件下(3-A),L-乳酸、L-蘋果酸、富馬酸最大積累量分別為1.97、0.63、0.56g/L,木糖培養(yǎng)下(3-B)三者分別僅為0.86、0.62、0.47g/L。葡萄糖的代謝主要與糖酵解途徑相關(guān),利于有機(jī)酸等小分子物質(zhì)的合成,致使在培養(yǎng)過程中pH呈下降趨勢(shì);相反,在木糖為碳源的培養(yǎng)過程中,pH不斷上升,最后維持在中性狀態(tài)。該現(xiàn)象也可能是導(dǎo)致在木糖培養(yǎng)條件下生物量相對(duì)較高的原因之一,即以葡萄糖為碳源時(shí),不斷降低的pH對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用,使得最終生物量偏低;而以木糖為碳源時(shí),pH上升,抑制作用不明顯,促使培養(yǎng)后期菌體大量積累。2.4木糖培養(yǎng)對(duì)碳源還原力的影響不同碳源下胞內(nèi)還原力的大小,主要通過NADH/NAD+體現(xiàn)出來。對(duì)不同碳源條件下的胞內(nèi)NAD+、NADH和ATP含量進(jìn)行分析,結(jié)果如圖4所示。通過對(duì)圖4的分析發(fā)現(xiàn),木糖培養(yǎng)條件下胞內(nèi)還原力高于葡萄糖培養(yǎng),這可能是由于木糖醇轉(zhuǎn)化為木酮糖的過程中,大量消耗了NAD+,生成NADH,最終導(dǎo)致NADH/NAD+提高。王桂蘭和San提出,菌體胞內(nèi)還原力與碳源還原力呈正相關(guān),本文的情況與之類似:木糖的還原力高于葡萄糖,對(duì)應(yīng)培養(yǎng)條件下米根霉菌體的胞內(nèi)還原力也相對(duì)要高。ATP是主要能量載體。如圖4分析可知,總體而言,在木糖培養(yǎng)條件下,胞內(nèi)ATP含量較葡萄糖為碳源培養(yǎng)時(shí)要高,尤其是在菌體生長(zhǎng)初期,木糖培養(yǎng)下ATP含量是葡萄糖培養(yǎng)時(shí)的5倍。由此可見,菌體在木糖培養(yǎng)下能量更充沛,這與上文木糖培養(yǎng)NADH含量高的現(xiàn)象相對(duì)應(yīng),即木糖培養(yǎng)下菌體為維持NAD+與NADH的相對(duì)平衡,通過電子傳遞鏈將更多NADH氧化成NAD+,為菌體提供更多ATP,最終導(dǎo)致利用木糖過程中菌體生物量積累較多。通過對(duì)2種碳源下NADH/NAD+、ATP的變化監(jiān)測(cè),可見指向生物量積累的能量代謝旺盛是影響木糖產(chǎn)酸量低的主要原因,這與Maas的結(jié)論相一致。3木糖代謝過程的原理及最佳條件本文以木糖和葡萄糖為碳源,考察了不同碳源培養(yǎng)條件下米根霉菌體生長(zhǎng)、細(xì)胞組分以及有機(jī)酸代謝的差異,同時(shí)聯(lián)系胞內(nèi)能量代謝分析了造成木糖代謝特性的原因。研究結(jié)果表明,米根霉代謝木糖時(shí)產(chǎn)生較高的胞內(nèi)還原力及ATP,促使細(xì)胞生物量的合成以及細(xì)胞大分子組分的合成,指向生物量積累的