藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證課件

藥物的含量測(cè)定方法與驗(yàn)證第一節(jié) 定量分析方法的分類與特點(diǎn)一．容量分析法容量分析法是將已知濃度的滴定液（中國(guó)藥典中稱滴定液）由滴定管滴加到待測(cè)藥物的溶液中，直到所加滴定液與被測(cè)藥物按化學(xué)計(jì)量反應(yīng)完全為止，然后根據(jù)滴定液的濃度和消耗的體積，就可以計(jì)算出被測(cè)藥物的含量。容量分析的關(guān)鍵問(wèn)題是如何確定等當(dāng)點(diǎn)。容量分析通常用于測(cè)定高含量或中含量組分，即被測(cè)組分的含量在1％以上。容量分析法比較準(zhǔn)確，一般情況下相對(duì)誤差可達(dá)0.2％以下。容量分析法操作簡(jiǎn)便、快速、比較準(zhǔn)確，所用儀器普通易得，在藥品檢驗(yàn)工作中具有很大的實(shí)用價(jià)值。（5）容量分析法的計(jì)算問(wèn)題滴定度指每1ml某摩爾濃度的滴定液所相當(dāng)?shù)谋粶y(cè)藥物的重量。中國(guó)藥典用毫克（mg）表示。2）滴定度（T）的計(jì)算在容量分析中，被測(cè)藥物（B）與滴定液（A）之間都按一定的摩爾比進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)可表示為：2）滴定度（T）的計(jì)算滴定度（T）可按下式計(jì)算：M－滴定液的摩爾濃度

b－被測(cè)藥物的摩爾數(shù)

a－滴定液的摩爾數(shù)B－被測(cè)藥物的毫摩爾質(zhì)量（分子量）3）百分含量計(jì)算在測(cè)定藥物含量時(shí)，常用直接滴定法和回滴定法，其計(jì)算方法如下：a.直接滴定法此法是用滴定液直接滴定，以求得被測(cè)藥物的含量。T－滴定度值

W－供試品取量V－消耗滴定液的體積在實(shí)際工作中，所配制的滴定液的摩爾濃度與藥典中規(guī)定的摩爾濃度不一定恰好符合，此時(shí)就不能直接應(yīng)用藥典上所給出的滴定度（T），但只要乘以滴定液濃度校正因數(shù)（F）即可換算成實(shí)際的滴定度（T’），3）百分含量計(jì)算b.回滴定法（剩余滴定法）此法是先加入定量過(guò)量的滴定液A，使其與被測(cè)藥物反應(yīng)，待此反應(yīng)進(jìn)行完全后，再用另一滴定液B來(lái)回滴反應(yīng)中剩余的滴定液A。b.回滴定法I.不做空白試驗(yàn)時(shí)百分含量計(jì)算方法VA－先加入的定量過(guò)量的滴定液A體積VB－滴定液B消耗體積FA－滴定液A濃度校正因數(shù)FB－滴定液B濃度校正因數(shù)W－供試品取量T－滴定度II.做空白試驗(yàn)的百分含量計(jì)算方法V0－空白試驗(yàn)消耗硫酸滴定液體積VB－樣品測(cè)定試驗(yàn)消耗滴定液體積T－滴定度F－滴定液濃度校正因數(shù)W－供試品取樣量（g）二．光譜分析法紫外－可見(jiàn)分光光度法

1）特點(diǎn)紫外－可見(jiàn)分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)波長(zhǎng)為200nm～760nm這一范圍的電磁波的吸收特性所建立起來(lái)的光譜分析方法。主要特點(diǎn)如下：a.靈敏度高，可達(dá)10-4g/ml～10-7g/ml。b.準(zhǔn)確度高，相對(duì)誤差為2％～5％。c.儀器價(jià)格較低廉，操作簡(jiǎn)單，易于普及。d.應(yīng)用廣泛。（1）紫外－可見(jiàn)分光光度法2）朗伯－比耳定律物理意義是當(dāng)一束平行單色光垂直通過(guò)某一均勻非散射的吸光物質(zhì)時(shí), 其吸光度A與吸光物質(zhì)的濃度c及吸收層厚度l成正比。A=lg(l/T)=EclA為吸光度,T為透光率,c為吸光物質(zhì)的濃度l為吸收層厚度（1）紫外－可見(jiàn)分光光度法3）儀器校正和檢定4）對(duì)溶劑的要求應(yīng)先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長(zhǎng)附近是否符合要求（1）紫外－可見(jiàn)分光光度法5）測(cè)定法a.對(duì)照品比較法Cx為供試品溶液濃度Ax為供試品溶液的吸光度cR為對(duì)照品溶液的濃度

AR為對(duì)照品溶液的吸光度為平均重量（或裝量）；D為稀釋體積；W為供試品取樣量；B為制劑的標(biāo)示量。（1）紫外－可見(jiàn)分光光度法5）測(cè)定法b.吸收系數(shù)法吸收系數(shù)通常應(yīng)大于1005）測(cè)定法c.計(jì)算分光光度法一般不宜用作含量測(cè)定d.比色法供試品本身在紫外-可見(jiàn)光區(qū)沒(méi)有強(qiáng)吸收，或在紫外區(qū)雖有吸收，但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當(dāng)?shù)娘@色劑使反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收波長(zhǎng)移至可見(jiàn)光區(qū)后測(cè)定。（1）紫外－可見(jiàn)分光光度法（2）熒光分析法特點(diǎn)高靈敏度熒光自熄滅：濃度太大時(shí)，溶液會(huì)有“自熄滅” 作用，應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行。易受干擾：必須做空白試驗(yàn)（2）熒光分析法2）干擾因素的排除溶劑不純會(huì)使測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生較大誤差，必須做空白對(duì)照，用磨口玻璃蒸餾器蒸餾后再使用。溶液：濃度不宜過(guò)高懸浮物有散射溶氧會(huì)降低熒光強(qiáng)度，通惰性氣體除氧pH對(duì)熒光強(qiáng)度有影響玻璃量器：應(yīng)保持高度潔凈溫度：對(duì)熒光強(qiáng)度有影響（2）熒光分析法3）測(cè)定法濃度與熒光強(qiáng)度的線性關(guān)系較窄，故 應(yīng)在0.5-2之間為宜，如有超過(guò)，應(yīng)在調(diào)節(jié)溶液濃度后再測(cè)。1、特點(diǎn)與適用性高靈敏度：最低檢出濃度可達(dá)10-15～10-12g/ml。高專屬性：可有效分離樣品中與待測(cè)組分結(jié)構(gòu)相近的有關(guān)物質(zhì)。高效能與高速度：用于定量分析的HPLC和GC通?？稍?0分鐘或20分鐘內(nèi)完成藥物的定量分析，或在30分鐘內(nèi)完成藥物復(fù)方制劑中的多組分同時(shí)定量分析。三．色譜分析法三．色譜分析法2、分類

色譜分析法（又稱層析法）根據(jù)其分離原理可分為：吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜與排阻色譜。

又可根據(jù)分離方法分為：紙色譜法、薄層色譜法、柱色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。（一）高效液相色譜法

1、對(duì)儀器的一般要求色譜柱C18柱最常用（2）檢測(cè)器最常用為紫外檢測(cè)器，包括二極管陣列檢測(cè)器，其他還有熒光檢測(cè)器、蒸發(fā)光散射檢測(cè)器、電化學(xué)檢測(cè)器和質(zhì)譜檢測(cè)器。（3）流動(dòng)相三．色譜分析法三．色譜分析法（一）高效液相色譜法

2、系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)（1）色譜柱的理論塔板數(shù)（n）：用于評(píng)價(jià)色譜柱的分離效能(2)分離度（R）：用于評(píng)價(jià)待測(cè)組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)（一）高效液相色譜法

2、系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)色譜系統(tǒng)的重復(fù)性：用于評(píng)價(jià)連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。色譜峰的拖尾因子：用于評(píng)價(jià)色譜峰的對(duì)稱性。三．色譜分析法（一）高效液相色譜法

3、測(cè)定法（1）內(nèi)標(biāo)法三．色譜分析法（2）外標(biāo)法：第二節(jié) 樣品分析的前處理方法含金屬或鹵素的藥物，在分析前需要經(jīng)過(guò)不同方法處理后，方可進(jìn)行測(cè)定。處理方法因金屬或鹵素在分子中結(jié)合的牢固程度而異。而含金屬的有機(jī)藥物，有兩種情況：一是金屬原子不直接與碳原子相連，通常為有機(jī)酸及酚的金屬鹽或配位化合物，稱為含金屬的有機(jī)藥物。二是金屬原子直接與碳原子以共價(jià)鍵相連接，結(jié)合狀態(tài)比較牢，稱為有機(jī)金屬藥物。一．不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法直接測(cè)定法經(jīng)水解后測(cè)定法

1)直接回流后測(cè)定法例如：三氯叔丁醇的含量測(cè)定（銀量法）2)用硫酸水解后測(cè)定法例如：硬脂酸鎂含量測(cè)定（3）經(jīng)氧化還原后測(cè)定法

1）堿性還原后測(cè)定法鹵素結(jié)合于芳環(huán)上時(shí)，由于分子中碘的結(jié)合較

牢固，需在堿性溶液中加還原劑（如鋅粉）回流，使碳－碘鍵斷裂，形成無(wú)機(jī)碘化物后測(cè)定。例如：泛影酸含量測(cè)定（銀量法）2）酸性還原后測(cè)定法例如：碘番酸含量測(cè)定一．不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法b．含鐵藥物將含鐵藥物加酸溶解后，便游離出Fe3＋，利用Fe3＋在酸性溶液中氧化碘化鉀，析出的碘可用硫代硫酸鈉滴定液滴定以測(cè)定含量。一．不經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法（3）經(jīng)氧化還原后測(cè)定法3）利用藥物中可游離的金屬離子的氧化性測(cè)定含量（間接碘量法）a．含銻藥物二．經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法

條件：含金屬有機(jī)藥物及有機(jī)鹵素藥物結(jié)構(gòu)中的金屬原子、鹵素與碳原子結(jié)合牢固者，用水解或氧化還原后測(cè)定方法難以將有機(jī)結(jié)合的金屬原子及鹵素轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)機(jī)的金屬化合物及鹵素化合物。（1）濕法破壞1）硝酸－高氯酸法本法破壞能力強(qiáng)，反應(yīng)比較強(qiáng)烈。故進(jìn)行破壞時(shí)，必須嚴(yán)密注意切勿將容器中的內(nèi)容物蒸干，以免發(fā)生爆炸。本法適用于血、尿、組織等生物樣品的破壞。經(jīng)本法破壞后，所得的無(wú)機(jī)金屬離子，一般為

高價(jià)態(tài)。本法對(duì)含氮雜環(huán)藥物的破壞不夠完全，此時(shí)宜選用干法燒灼進(jìn)行破壞。二．經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法（1）濕法破壞2）硝酸－硫酸法本法適用于大多數(shù)有機(jī)物質(zhì)的破壞，如燃料、中間體或藥物等。經(jīng)本法破壞分解所得的無(wú)機(jī)金屬離子均為高價(jià)態(tài)。因堿土金屬可與硫酸形成不溶性的硫酸鹽，

將會(huì)吸附被測(cè)定的金屬離子，使測(cè)定的結(jié)果偏

低。所以本法不適用于含堿土金屬有機(jī)藥物的

破壞。此時(shí)，可改用硝酸－高氯酸法進(jìn)行破壞。二．經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法（1）濕法破壞3）硫酸－硫酸鹽法本法所用硫酸鹽為硫酸鉀或硫酸鈉，因硫酸鈉為含水化合物，不利于有機(jī)破壞，故一般多采用硫酸鉀。加入硫酸鹽的目的，是為了提高硫酸的沸點(diǎn)，以使樣品破壞完全。同時(shí)，也防止硫酸在加熱過(guò)程中過(guò)早地分解為三氧化硫而損失。二．經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法注意a.濕法破壞所用的儀器，一般為硅玻璃或硼玻璃制成的凱氏燒瓶；b.所用試劑及蒸餾水均不應(yīng)含有被測(cè)金屬離子或干擾測(cè)定的其它金屬離子等組分；c.由于整個(gè)操作過(guò)程所用礦酸量數(shù)倍于樣品，所以必須按相同條件進(jìn)行空白試驗(yàn)校正；d.操作時(shí)應(yīng)在通風(fēng)櫉內(nèi)進(jìn)行。二．經(jīng)有機(jī)破壞的前處理方法（2）干法破壞本法是將有機(jī)物灼燒灰化以達(dá)分解的目的。應(yīng)注意的問(wèn)題加熱或灼燒時(shí)，應(yīng)控制溫度在420℃以下，以防止某些被測(cè)金屬化合物的揮發(fā)?；一耆c否，直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

c.經(jīng)本法破壞后，所得灰分往往不易溶解，但此時(shí)切勿棄去。（2）干法破壞3) 適用于濕法不易破壞完全的有機(jī)物（如含氮雜環(huán)類有機(jī)藥物）以及某些不能用硫酸進(jìn)行破壞的有機(jī)藥物。不適用于含易揮發(fā)性金屬（如汞、砷等）有機(jī)藥物的破壞。（3）氧瓶燃燒法氧瓶燃燒法是將有機(jī)藥物放入充滿氧氣的密閉的燃燒瓶中進(jìn)行燃燒，并將燃燒所產(chǎn)生的欲測(cè)物質(zhì)吸收于適當(dāng)?shù)奈找褐?，然后根?jù)欲測(cè)物質(zhì)的性質(zhì)，采用適宜的分析方法進(jìn)行鑒別，檢查或測(cè)定含鹵素有機(jī)藥物或含硫、氮、硒等其它元素的有機(jī)藥物。本法是快速分解有機(jī)物的簡(jiǎn)單方法，它不需要復(fù)雜設(shè)備，就能夠使有機(jī)化合物中的待測(cè)元素定量分解成離子型。第三節(jié) 藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證的目的是證明采用的方法適合于相應(yīng)檢測(cè)要求需驗(yàn)證的分析項(xiàng)目有：鑒別試驗(yàn)，雜質(zhì)定量或限度檢查，原料藥或制劑中有效成分含量測(cè)定以及制劑中其它成分（如降解產(chǎn)物、防腐劑等）的測(cè)定驗(yàn)證內(nèi)容有：準(zhǔn)確度、

精密度（包括重復(fù)性、中間精密度和重現(xiàn)性）、專屬性、檢測(cè)限、定量限、線性、范圍和耐用性。1．準(zhǔn)確度準(zhǔn)確度是指用該方法測(cè)定的結(jié)果與真實(shí)值或參考值接近的程度，一般以回收率（％）表示。（1）含量測(cè)定方法的準(zhǔn)確度原料藥可用已知純度的對(duì)照品或樣品進(jìn)行測(cè)定，或用本法所得結(jié)果與已建立準(zhǔn)確度的另一方法測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較。制劑可用含已知量被測(cè)物的各組分混合物進(jìn)行測(cè)定。如不能得到制劑的全部組分，可向制劑中加入已知量的被測(cè)物進(jìn)行測(cè)定，或與另一個(gè)已建立準(zhǔn)確度的方法比較結(jié)果。3）制劑的含量測(cè)定（2）數(shù)據(jù)要求在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如制備3個(gè)不同濃度的樣品，各測(cè)定3次。應(yīng)報(bào)告已知加入量的回收率（％），或測(cè)定結(jié)果平均值與真實(shí)值之差及其可信限2．精密度

精密度是指在規(guī)定的測(cè)試條件下，同一個(gè)均勻樣品，經(jīng)多次取樣測(cè)定所得結(jié)果之間的接近程度。含量測(cè)定和雜質(zhì)定量測(cè)定考慮方法的精密度。（1）精密度表示方法偏差（deviation，d）a.b.相對(duì)誤差（relative

deviation，RD）：若兩份平行操作，設(shè)A、B為兩次測(cè)得值，則其相對(duì)偏差為：c.最大相對(duì)偏差：相對(duì)偏差用來(lái)表示測(cè)定結(jié)果的精密度，根據(jù)對(duì)分析工作的要求不同而制訂的最大值（也稱“允許差”）。一般，各種含量測(cè)定的允許差如下：容量分析法為0.3％；重量分析法為0.5％；凱氏定氮法為1％；氧瓶燃燒法為0.5％；儀器分析法為3％。（1）精密度表示方法2）標(biāo)準(zhǔn)偏差（Standard

deviation，SD或S）（1）精密度表示方法3）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative

standarddeviation，RSD）也稱變異系數(shù)（coefficient

of

variation，CV）（2）重復(fù)性、中間精密度及重現(xiàn)性重復(fù)性在相同條件下，由一個(gè)分析人員測(cè)定所得結(jié)果的精密度稱為重復(fù)性。在規(guī)定范圍內(nèi)，至少用9次測(cè)定結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，如制備3個(gè)不同濃度的樣品，各測(cè)定3次，或把被測(cè)物濃度當(dāng)作100％，用至少測(cè)定6次的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。2）中間精密度在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)室，不同時(shí)間由不同分析人員用不同設(shè)備測(cè)定結(jié)果的精密度，稱為中間精密度。為考查隨機(jī)變動(dòng)因素對(duì)精密度的影響，應(yīng)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行中間精密度試驗(yàn)。變動(dòng)因素為不同日期、不同分析人員、不同設(shè)備。3）重現(xiàn)性在不同實(shí)驗(yàn)室由不同分析人員測(cè)定結(jié)果的精密度，稱為重現(xiàn)性。當(dāng)分析方法將被法定標(biāo)準(zhǔn)采用時(shí)，應(yīng)進(jìn)行重現(xiàn)性試驗(yàn)。如建立藥典分析方法時(shí)通過(guò)協(xié)同檢驗(yàn)得出重現(xiàn)性結(jié)果，協(xié)同檢驗(yàn)的過(guò)程、重現(xiàn)性結(jié)果均應(yīng)記載在起草說(shuō)明中。（3）數(shù)據(jù)要求

均應(yīng)報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)偏差、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和可信限。3．專屬性專屬性是指在其它成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）可能存在下，采用的方法能準(zhǔn)確測(cè)定出被測(cè)物的特性。鑒別反應(yīng)、雜質(zhì)檢查、含量測(cè)定方法，均應(yīng)考查其專屬性。3．專屬性鑒別反應(yīng)應(yīng)能與可能共存的物質(zhì)或結(jié)構(gòu)相似化合物區(qū)分，不含被測(cè)成分的樣品，以及結(jié)構(gòu)相似或組分中的有關(guān)化合物，均應(yīng)呈負(fù)反應(yīng)。（2）含量測(cè)定和雜質(zhì)測(cè)定色譜法和其它分離方法，應(yīng)附代表性圖譜，以說(shuō)明專屬性。圖中應(yīng)標(biāo)明諸成分的位置，色譜法中的分離度應(yīng)符合要求。在雜質(zhì)可獲得的情況下，對(duì)于含量測(cè)定，試樣中可加入雜質(zhì)或輔料，考查測(cè)定結(jié)果是否受干擾，并可與未加雜質(zhì)和輔料的試樣比較測(cè)定結(jié)果，對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定，也可向試樣中加入一定量的雜質(zhì)，考查雜質(zhì)能否得到分離。3．專屬性3）在雜質(zhì)或降解產(chǎn)物不能獲得的情況下，可將含有雜質(zhì)或降解產(chǎn)物的試樣進(jìn)行測(cè)定，與另一個(gè)經(jīng)驗(yàn)證了的或藥典方法比較結(jié)果，用強(qiáng)光照射，高溫，高濕，酸、堿水解，或氧化的方法進(jìn)行加速破壞，以研究降解產(chǎn)物。含量測(cè)定方法應(yīng)比對(duì)二法的結(jié)果，雜質(zhì)測(cè)定應(yīng)比對(duì)檢出的雜質(zhì)個(gè)數(shù)，必要時(shí)可采用光二極管陣列檢測(cè)和質(zhì)譜檢測(cè)，進(jìn)行純度檢查。4．檢測(cè)限檢測(cè)限（limit

of

detection，LOD）是指試樣中被測(cè)物能被檢測(cè)出的最低濃度或量。它無(wú)需定量測(cè)定，只要指出高于或低于該規(guī)定的濃度或量即可根據(jù)所采用的分析方法來(lái)確定檢測(cè)限。4．檢測(cè)限（1）常用的方法非儀器分析目視法用已知濃度的被測(cè)物，試驗(yàn)出能被可靠地檢測(cè)出的最低濃度和量。2）儀器分析時(shí)的測(cè)定法a．當(dāng)用紫外分光光度法和熒光分析法時(shí)

b．當(dāng)用GC法和HPLC法時(shí)（2）數(shù)據(jù)要求應(yīng)附測(cè)試圖譜，說(shuō)明測(cè)試過(guò)程和檢測(cè)限結(jié)果。5．定量限定量限（limit

of

quantitation，LOQ）是指樣品中被測(cè)物能被定量測(cè)定的最低

量，其測(cè)定結(jié)果應(yīng)具一定準(zhǔn)確度和精密

度。6．線性線性是指在設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)，測(cè)試結(jié)果與

試樣中被測(cè)物濃度直接呈正比系的程度。如UV法：要求濃度點(diǎn)為

n

=

5；吸收度A一般在0.3～0.7；相關(guān)系數(shù)r>0.9999。如HPLC法：要求濃度點(diǎn)為

n

=

5～7；相關(guān)系數(shù)r>0.9999。7．范圍范圍是指能達(dá)到一定精密度、準(zhǔn)確度和線性、測(cè)試方法適用的高低限濃度或量的空間。耐用性耐用性是指在測(cè)定條件有小的變動(dòng)時(shí)，測(cè)定結(jié)果不受影響的承受程度，為常規(guī)檢驗(yàn)提供依據(jù)。第五章 體內(nèi)藥物分析

體內(nèi)藥物分析是指體內(nèi)樣品（生物體液、器官或組織）中藥物及其代謝物或內(nèi)源性生物活性物質(zhì)的定量分析。

與體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究和臨床治療藥物監(jiān)測(cè)密切相關(guān)。體內(nèi)樣品特點(diǎn)：采樣量少待測(cè)物濃度低干擾物質(zhì)多體內(nèi)藥物分析的特點(diǎn)：體內(nèi)樣品需經(jīng)分離與濃集，或經(jīng)化學(xué)衍生化處理后才能進(jìn)行分析對(duì)分析方法的靈敏度及專屬性要求較高分析工作量大，測(cè)定數(shù)據(jù)的處理和結(jié)果的闡明較為復(fù)雜。第一節(jié) 常用體內(nèi)樣品的制備與貯藏一、體內(nèi)樣品的種類包括血液、尿液、唾液、頭發(fā)、臟器組織、乳汁、精液、腦脊液、淚液、膽汁、胃液、胰液、淋巴液、糞便等樣品。最常用的是血漿或血清。二、體內(nèi)樣品的采集與制備（一）血樣測(cè)定血中藥物濃度通常是指測(cè)定血漿或血清中的藥物濃度，而不是指含有血細(xì)胞的全血中的藥物濃度。血漿濃度可作為作用部位藥物濃度的可靠指標(biāo)。1、血樣的采集待藥物在血液中分布均勻后取樣通常從靜脈采集血樣，根據(jù)血中藥物濃度和分析方法靈敏度的要求，一般每次采血1-5ml,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)，采血量不宜超過(guò)動(dòng)物總血量的十分之一。通常從靜脈采集，有時(shí)從毛細(xì)血管采血。2、血漿的制備血漿的取得是在加肝素、構(gòu)椽酸、草酸鹽等抗凝劑的全血經(jīng)離心后分取一般lml的全血需加0.1～0.2mg的肝素，加入血樣后立即輕輕旋搖，但勿太猛烈，以免導(dǎo)致血細(xì)胞破裂。3、血清的制備血清是由血液中纖維蛋白原等影響下，引起血液凝結(jié)而析出的澄清黃色液體，經(jīng)離心其量約為全血量的20％～40％。在室溫高時(shí)，血凝過(guò)程進(jìn)行得很快，宜在血凝后半小時(shí)內(nèi)分離血清。當(dāng)室溫低時(shí)，血凝過(guò)程較慢，可將血液置37℃溫度下加速血清析出。采取血樣后，應(yīng)及時(shí)分離血漿或血清，并最好立即進(jìn)行分析。如不能立即測(cè)定時(shí)，應(yīng)妥善儲(chǔ)存。短期保存時(shí)置冰箱（4℃），長(zhǎng)期保存時(shí)要在冷凍櫉（庫(kù)）（-20℃）中冷凍保存。4、全血的制備將采集的血液置含有抗凝劑的試管中，但不經(jīng)離心操作，保持血漿和血細(xì)胞處于均相，則稱為全血。適用

需專門測(cè)定平均分布于血細(xì)胞內(nèi)、外的藥物濃度

血漿內(nèi)藥物濃度波動(dòng)太大，又難以控制，或血漿中藥物濃度很低而影響測(cè)定。（二）尿液尿樣的缺點(diǎn)尿液中藥物濃度的改變不能直接反映血藥濃度，即與血藥濃度相關(guān)性差；受試者的腎功能正常與否直接影響藥物排泄，因而腎功能不良者不宜采集尿樣；嬰兒的排尿時(shí)間難于掌握；尿液不易采集完全并不易保存。（三）唾液用唾液作為樣品測(cè)定藥物濃度的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)與采取血樣不同，患者制劑可以不受時(shí)間和地點(diǎn)的限制，很容易地反復(fù)采集；采集時(shí)無(wú)痛苦無(wú)危險(xiǎn)；有些唾液中藥物濃度可以反映血漿中游離型藥物濃度。a.由于唾液是由腮腺、頜下腺及舌下腺等各腺體分泌的組成不同的混合液體，其組成也會(huì)發(fā)生經(jīng)時(shí)變動(dòng)；唾液中的藥物濃度與血漿中的游離型藥物濃度相比容易 變動(dòng)；唾液中藥物濃度與血漿中藥物濃度的比值（S/P）只有少 數(shù)藥物是恒定值；有些與蛋白結(jié)合率較高的藥物，藥物在唾液中的濃度比 血漿濃度低很多，需要高靈敏度的分析方法才能檢測(cè)；對(duì)有些患者（如癲癇、昏迷）不能采集唾液樣品。缺點(diǎn)（四）組織1、組織樣品的制備測(cè)定前，需均勻化制成水性基質(zhì)勻漿溶液，再用適當(dāng)方法萃取藥物。某些水中難溶的藥物，也可直接使用甲醇或水-甲醇混合溶液進(jìn)行組織勻漿。（四）組織2、組織樣品的處理沉淀蛋白法：加入蛋白沉淀劑（甲醇、乙腈、高氯酸、三氯醋酸等），取上清液供萃取用。酸水解或堿水解法：只適用在熱酸或熱堿條件下穩(wěn)定的少數(shù)藥物（或毒物）的測(cè)定。酶水解法：最常用的酶是蛋白水解酶中的枯草菌溶素。酶水解法的特點(diǎn)：可避免某些藥物在酸及高溫下降解；對(duì)與蛋白質(zhì)結(jié)合緊密的藥物，可顯著改善回收率；可用有機(jī)溶劑直接提取酶解液而無(wú)乳化現(xiàn)象生成；當(dāng)采用HPLC法檢測(cè)時(shí)，無(wú)需再進(jìn)行過(guò)多的凈化操作。（五）頭發(fā)頭發(fā)樣品的取樣方便；可獲得長(zhǎng)期長(zhǎng)期的用藥史信息。分析對(duì)象的含量低，分析樣品的的預(yù)處理繁雜、干擾多。1、頭發(fā)樣品的采集要有代表性和同一性。

2、頭發(fā)樣品的洗滌3、頭發(fā)樣品的處理直接用甲醇提取；酸水解；堿水解；酶水解第二節(jié) 體內(nèi)樣品分析的前處理一、體內(nèi)樣品預(yù)處理的目的使待測(cè)藥物游離藥物進(jìn)入體內(nèi)后，即與血漿蛋白結(jié)合，同時(shí)部分經(jīng)生物轉(zhuǎn)化生成代謝物及綴合物。滿足測(cè)定方法的要求體內(nèi)樣品介質(zhì)組成復(fù)雜、干擾多，而待測(cè)藥物組分濃度低，需經(jīng)預(yù)處理，使其分離及濃集。改善分析環(huán)境為防止分析儀器的污染、劣化，提高測(cè)定靈敏度和選擇性等。二、常用體內(nèi)樣品預(yù)處理方法主要應(yīng)考慮生物樣品的種類，被測(cè)定藥物的性質(zhì)和測(cè)定方法三個(gè)方面的問(wèn)題。樣品的分離、純化技術(shù)應(yīng)該依據(jù)生物樣品的類型。根據(jù)被測(cè)定藥物的結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)及藥理性質(zhì)、存在形式、濃度范圍等，采取相應(yīng)的前處理方法。樣品于測(cè)定前是否需要純化以及純化到什么程度均與其后采用的測(cè)定方法的不同而不同。1、加入與水相混溶的有機(jī)溶劑加入水溶性的有機(jī)溶劑，可使蛋白質(zhì)的分子內(nèi)及分子間的氫鍵發(fā)生變化而使蛋白質(zhì)凝聚，使與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物釋放出來(lái)。2、加入中性鹽加入中性鹽，使溶液的離子強(qiáng)度發(fā)生變化。中性鹽能將與蛋白質(zhì)水合的水置換出來(lái)，從而使蛋白質(zhì)脫水而沉淀。（一）去除蛋白質(zhì)3、加入強(qiáng)酸當(dāng)pH低于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)以陽(yáng)離子形式存在。此時(shí)加入強(qiáng)酸，可與蛋白質(zhì)陽(yáng)離子形成不溶性鹽而沉淀。4、熱凝固法當(dāng)待測(cè)物熱穩(wěn)定性好時(shí)，可采用加熱的方法將一些熱變性蛋白質(zhì)沉淀。（二）分離與濃集

1）液相萃取法固相萃取法超濾法被測(cè)組分的濃集（三）綴合物的水解

1、酸水解法加入適量的鹽酸溶液，比較簡(jiǎn)便、快速，但藥物水解過(guò)程會(huì)分解，專一性較差2、酶解法在測(cè)定一些酸及受熱不穩(wěn)定的藥物，常需用酶解法。最常用的酶是葡萄糖醛酸苷酶或硫酸

酯酶。藥物不分解，專屬性強(qiáng)，但時(shí)間長(zhǎng)及酶

制劑可能引入的黏蛋白導(dǎo)致乳化或色譜柱阻塞。

3、溶劑解法加入溶劑在萃取過(guò)程中被分解（四）化學(xué)衍生化目的a.使藥物變成具有能被分離的性質(zhì)；b.提高檢測(cè)的靈敏度；c.增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性；d.提高對(duì)光學(xué)異構(gòu)體的能力。2）藥物分子中含有活潑H者均可被化學(xué)衍生化，如含－COOH、－OH、－NH2、－NH－、－SH等

官能團(tuán)的藥物都可被衍生化。3）GC中化學(xué)衍生化法4）HPLC中化學(xué)衍生化法第三節(jié) 體內(nèi)樣品分析方法與方法驗(yàn)證一、分析方法的建立（一）分析方法的選擇1