動物性食品微生物學檢驗實驗

動物性食品微生物檢驗實驗

實驗一、食品檢驗中常用培養(yǎng)基的配制

一、實驗目的和要求掌握培養(yǎng)基的配制過程。認識培養(yǎng)基的組成特點掌握高壓滅菌的原理和操作方法二、培養(yǎng)基的分類培養(yǎng)基的定義：人工方法配合而成的專供微生物培養(yǎng)、分離、鑒別、研究和保存用的混合營養(yǎng)物制品。培養(yǎng)基按形態(tài)分類：固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)基按功能分類：按功能分類基礎培養(yǎng)基營養(yǎng)要求相同的微生物，所需要的營養(yǎng)物質(zhì)除少數(shù)幾種不同外，其它大部分都是共同的。因此可以配成一種基礎培養(yǎng)基，再按照某一種微生物的特殊需要，添加某種營養(yǎng)物即可。增菌培養(yǎng)基根據(jù)某種微生物的特殊營養(yǎng)要求，可配制出適合于這種微生物而不適合其他微生物生長的培養(yǎng)基。增菌培養(yǎng)基的選擇性只是相對的，是純化微生物過程的一個步驟。選擇性培養(yǎng)基含有營養(yǎng)物（增菌劑）和抑菌劑（選擇劑），通過抑菌劑的選擇性抑制作用，使所要分離的微生物得到較好的繁殖，而其他菌被抑制。抑菌劑的種類很多，如孔雀綠、煌綠、亞硒酸鈉、硝酸鹽、膽鹽等。鑒別培養(yǎng)基主要加入指示劑，如伊紅、美蘭。伊紅是酸性染料，美蘭是堿性染料。一般鑒別培養(yǎng)基選擇性鑒別培養(yǎng)基：如亞硫酸鉍瓊脂中的亞硫酸鉍和煌綠，既是抑菌劑，又是指示劑。生化反應鑒別培養(yǎng)基厭氧菌培養(yǎng)基

三、培養(yǎng)基配制的一般過程

認識該培養(yǎng)基的配方和組成特點。按照所須配制的量，進行計算稱量。先用大約3/4體積的水溶解。必要時，可加熱促進成分的溶解。用堿或酸調(diào)節(jié)pH值至所須的酸堿度，補足剩余水分。根據(jù)需要與否，加入瓊脂粉（條），煮沸直至完全溶解，并補足所揮發(fā)水分。分裝至試管或鹽水瓶等，包扎待滅菌。四、本次實驗中須配制的培養(yǎng)基1、計數(shù)瓊脂：用于細菌總數(shù)的測定2、乳糖膽鹽發(fā)酵管：用于大腸菌群的測定3、麥康凱瓊脂：可用于腸桿菌菌科的鑒別培養(yǎng)4、馬鈴薯瓊脂：用于霉菌的分離和培養(yǎng)計數(shù)瓊脂成分：蛋白胨10g牛肉粉3g氯化鈉5g蒸餾水1000ml瓊脂粉15g制法：將除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)。按正pH至7.2

7.4。加入瓊脂，加熱煮沸。使瓊脂溶化。分裝，高壓滅菌121℃，15min。附注：此培養(yǎng)基可供一般細菌培養(yǎng)之用，可傾注平板或制成斜面，如用于菌落計數(shù)，瓊脂量為1.5%，如作成平板或斜面，則應為1.8%。乳糖膽鹽發(fā)酵管成分：蛋白胨20g膽鹽5g乳糖10g蒸餾水1000ml0.04%溴甲酚紫水溶液25mlpH7.4制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示劑，分裝每管10ml，并放入一個小倒管，高壓滅菌115℃，15min。附注：雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管除蒸餾水外，其他成分加倍。麥康凱瓊脂：蛋白胨17g眎胨3g乳糖10g豬膽鹽（或牛、羊膽鹽）5g氯化鈉5g蒸餾水1000ml0.5%中性紅水溶液5ml0.01%結晶紫水溶液10ml瓊脂17g制法：（1）將蛋白胨、眎胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400ml蒸餾水中，校正pH至7.2；將瓊脂加入于600ml蒸餾水中，加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶內(nèi)，高壓滅菌121℃15min備用。（2）臨用時加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖。冷至50

55℃時，加入結晶紫和中性紅水溶液，搖勻傾注平板。附注：結晶紫有中性紅溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌?？捎糜谀c桿菌菌科的鑒別培養(yǎng)

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）成分：馬鈴薯（去皮切碎）300g葡萄糖20g瓊脂20g蒸餾水1000ml制法：將馬鈴薯去皮切碎，加蒸餾水至1000ml，煮沸10

20min，用紗布過濾，補加蒸餾水至1000ml，然后加葡萄糖和瓊脂，加熱溶化，分裝，高壓滅菌121℃，15min。用途：分離培養(yǎng)霉菌。五、分工第1、2組：計數(shù)瓊脂

第3、4組：乳糖膽鹽發(fā)酵管第5組：麥康凱瓊脂

第6組：馬鈴薯瓊脂實驗二細菌總數(shù)的測定一、目的和要求學習并掌握環(huán)境和食品中細菌總數(shù)測定的方法。二、實驗說明細菌總數(shù)：指食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后，所得1g或1ml檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)。主要作為食品被污染程度的標志。菌落總數(shù)的測定，只包括一群能在營養(yǎng)瓊脂上發(fā)育的嗜中溫性需氧菌的菌落總數(shù)。三、實驗材料土壤水源過期變質(zhì)的牛奶市場上銷售的變質(zhì)食品四、實驗步驟以無菌操作，將檢樣25g（25ml）剪碎放于含有225ml滅菌生理鹽水的廣口瓶內(nèi)（瓶內(nèi)置有適量玻璃珠）或滅菌研缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1∶10的均勻稀釋液。用1.0ml滅菌吸管吸取1∶10稀釋的稀釋液1ml，注入含有9.0ml滅菌生理鹽水的試管內(nèi)（注意吸管尖端不要觸及管內(nèi)液面），振搖試管混合均勻，作成1∶100的稀釋液。另取1.0ml滅菌吸管，按上項操作10倍遞增稀釋，如此每遞增稀釋一次，即換1支1.0ml吸管。根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)吮疚廴境潭鹊墓烙?，選擇3個適宜稀釋度，分別作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1.0ml稀釋液于滅菌平皿內(nèi)，每個稀釋度作兩個平皿。將涼至55℃營養(yǎng)瓊指注入平皿約15ml，并轉(zhuǎn)動平皿使混合均勻。同時將營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾入加有1.0ml滅菌生理鹽水的平皿內(nèi)作空白對照。待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平板，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h（肉、水產(chǎn)品、乳和蛋品為48h）取出，計算平板內(nèi)菌落數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)，即得每g（或ml）樣品所含菌落總數(shù)。五、計算方法1．平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在30

300之間的平板作為菌落總數(shù)測定標準。一個稀釋度使用兩個平板，采用兩個平板的平均數(shù)。其中一個平板有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)。若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個平板后乘以2代表全皿菌落數(shù)。2．稀釋度的選擇（1）應選擇平均菌落數(shù)在30

300之間的稀釋度，乘以稀釋倍數(shù)報告之。（2）若有兩個稀釋度，其生長的菌落數(shù)在30

300之間，則視二者之比如何來決定。若其比值小于2，應報告其平均數(shù)，若大于2，則報告其中較小的數(shù)字。（3）若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。附表實驗三揚州市區(qū)二道河河水細菌總數(shù)的測定實驗三食品中大腸菌群數(shù)的測定

一、目的要求學習并掌握食品和水中大腸菌群測定的基本方法。二、實驗說明大腸菌群：指一群在37℃，24h能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸、產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。該菌群主要來源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標，來評價食品的衛(wèi)生質(zhì)量，具有廣泛的衛(wèi)生學意義。食品中大腸菌群數(shù)系以每100ml（g）檢樣內(nèi)大腸菌群最近似數(shù)（MPN）來表示，其含義是指100ml（g）食品內(nèi)含有大腸菌群數(shù)的實際數(shù)值。三、實驗器材1、設備和材料天平、顯微鏡、均質(zhì)器或研缽，平皿、試管、吸管、載玻片。2、培養(yǎng)基及試劑乳糖膽鹽發(fā)酵管；伊紅美藍瓊脂平板；乳糖發(fā)酵管；蛋白胨水；革蘭氏染液。3．肉制品；乳制品；城市河道水源。四、方法步驟（一）檢樣稀釋以無菌操作將檢樣25ml（或25g）放于含有225ml滅菌生理鹽水上或其它稀釋液的滅菌玻璃瓶內(nèi)（瓶內(nèi)預置適當數(shù)量的玻璃珠）或滅菌研缽內(nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨作成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣最好用均質(zhì)器，以8000

10000rpm的速度處理1min，做成1:10的均勻稀釋液。2.用1ml吸管，吸取1∶10稀釋液1ml，注入含有9ml滅菌生理鹽水或其它稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻作成1∶100的稀釋液。3.另取1ml滅菌吸管，按上項操作依次作10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1ml滅菌吸管。4.根據(jù)食品衛(wèi)生標準要求或?qū)z樣污染情況的估計，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種3管。（二）乳糖發(fā)酵試驗將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1ml以上者，用雙料乳糖發(fā)酵管，1ml及1ml以下者，用單料乳糖發(fā)酵管。每一稀釋度接種3管，置37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)氣者，則按下列程序進行。（三）分離培養(yǎng)將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍或麥康凱瓊脂平板上，置37℃溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18

24h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報告為大腸菌群陰性。檢樣稀釋乳糖膽鹽發(fā)酵管37℃，24小時不產(chǎn)氣產(chǎn)氣大腸菌群陰性報告伊紅美藍瓊脂平板或麥康凱平板，37℃，18

24小時革蘭氏染色乳糖微量發(fā)酵管，37℃，24小時革蘭氏陽性大腸菌群陰性報告革蘭氏陰性無芽孢桿菌產(chǎn)氣不產(chǎn)氣大腸菌群陰性報告大腸菌群陽性報告（四）證實試驗在上述平板上，挑取可疑大腸菌群落1

2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置37℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h，觀察產(chǎn)氣情況。凡乳糖管產(chǎn)氣，革蘭氏染色為陰性的無芽胞桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。五、實驗結果查大腸菌群數(shù)表得出本次實驗值。

大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表注：1、本表采用3個稀釋度1ml（g），0.1ml（g），0.01ml（g），每稀釋度3管。2、表內(nèi)所列檢樣量如改用10ml（g），1ml（g），和0.1ml（g）時，表內(nèi)數(shù)字相應降低10倍；如改用0.1ml（g），0.01ml（g）和0.001ml（g）時，則表內(nèi)數(shù)字應增加10倍，其余可類推。實驗四鮮血瓊脂的制作

一、目的要求掌握綿羊、家兔、雞等常見實驗對象的采血方法和鮮血瓊脂的制作，充分認識鮮血平板在細菌檢驗中的應用。二、實驗材料

1．碘酊，酒精棉球，3.8%的枸櫞酸鈉抗凝劑，消毒的50mL或25ml注射器，鑷子，煎毛剪。2．保溫在50

55℃左右的營養(yǎng)瓊脂。三、采血步驟

1．采血的途徑1）家兔：在心跳最明顯處進針（一般在左側(cè)第三肋骨距胸骨4cm處）。

2）雞：觸摸雞的胸骨，用手指輕按至凹陷，用9號針頭向下插入1~2cm，再水平進針，直至插入心臟。3）羊：將羊按倒，保定，剪除頸部羊毛，用手按住向心端，至血管暴露，用9或12號針頭，刺入頸靜脈。2．采血過程1）將注射器，鑷子，針頭煮沸滅菌。2）保定采血動物，剪去采血部位的毛，用碘酊消毒，再用酒精棉球脫碘。3）按照實際采血量的5%吸入抗凝劑。按照正確的部位將針頭刺入血管，抽取適量的血。將血注入滅菌的瓶子，或用酒精棉球封住針孔，以防細菌進入。3．鮮血平板的澆注將預冷至50

55℃的瓊脂，打開瓶塞，拔下注射器針頭，加入5

10%的血量，顛倒混勻(注意不能產(chǎn)生氣泡)，立即傾注平板。制好的血平板應為鮮艷的紅色。實驗五腸桿菌科主要菌屬的鑒別一、實驗目的通過本實驗掌握食品衛(wèi)生上有重要意義的腸桿菌科重要菌屬的生化特性及其鑒別要點。二、實驗材料1．提供菌種沙門氏菌；大腸桿菌；志賀氏菌；變形桿菌。2．提供鑒別試劑

1）發(fā)酵管包括葡萄糖，乳糖，麥芽糖，甘露醇，蔗糖，尿素酶，枸櫞酸鹽，硫化氫等。2）蛋白胨水3）葡萄糖蛋白胨水4）三糖鐵瓊脂5)以及各種選擇性培養(yǎng)基。BS平板、DHL平板、EMB平板、麥康凱平板。三、實驗步驟及方法1．將4種細菌分別接種糖發(fā)酵管。2．將4種細菌分別接種蛋白胨水和葡萄糖蛋白胨水，進行吲哚試驗和V-P試驗檢測。3．將4種細菌分別接種麥康凱平板4．將4種細菌分別接種三糖鐵瓊脂5．將4種細菌分別接種BS平板、DHL平板、EMB平板，比較其生長特點。6.細菌的形態(tài)學觀察吲哚試驗原理蛋白質(zhì)中的色氨酸有些細菌如大腸埃希氏菌吲哚對位二甲基氨基苯甲醛+玫瑰吲哚紅色①試劑配方一：對二甲基氨基苯甲醛 1g無水乙醇 95mL濃鹽酸 20mL②試劑配方二：對二甲基氨基苯甲醛5g戊醇（或異戊醇）75mL濃鹽酸

25mL先用乙醇溶解試劑后加鹽酸，避光保存。M.R試驗接種大腸桿菌或沙門氏菌于5mL葡萄糖蛋白胨水中，置37℃培養(yǎng)3-5d）；于培養(yǎng)物中加入幾滴試劑；變紅色者為陽性反應，桔紅到黃色則為陰性。M.R試劑陽性陰性V-P試驗接種大腸桿菌或沙門氏菌于1mL葡萄糖蛋白胨水中，置37℃培養(yǎng)3-5d）；于培養(yǎng)物中加入0.5mLV-P甲液；隨后加V-P乙液0.5mL，輕搖；靜置10-15min。15min內(nèi)變紅者為陽性。V-P甲液V-P乙液陽性陰性M.R與V-P試驗原理M.R試驗：甲基紅是一種pH指示劑：當細菌分解葡萄糖產(chǎn)酸且產(chǎn)酸量大時；在加入甲基紅指示劑后顯紅色為陽性。pH4.4-6.2紅→黃葡萄糖丙酮酸乙酰甲基甲醇2,3-丁二烯醇某些細菌能發(fā)酵二乙酰堿V-P試驗：+胨中的胍基化合物注意：通常M.R和V-P試驗是密切相關：如果一個微生物M.R是陽性，則V-P是陰性；或者相反。粉紅色化合物+三糖鐵瓊脂反應模式表示：A／A＋；－吲哚、M.R、V-P試驗結果大腸桿菌沙門氏菌吲哚試驗M.R試驗V-P試驗吲哚試驗M.R試驗V-P試驗四、實驗結果的觀察與記錄實驗六食品中沙門氏菌的檢驗一、目的和要求熟悉并掌握對可疑食品中沙門氏菌的檢驗程序和鑒定方法。背景知識：1）沙門氏菌屬是腸道桿菌科中最重要的病原菌屬，它是引起人類和動物發(fā)病和食物中毒的主要病原菌。2）食品中沙門氏菌的含量較少，且常由于食品加工過程使其受到損傷而處于瀕死的狀態(tài)。故為了分離食品中的沙門氏菌，對某些加工食品必須經(jīng)過前增菌處理，用無選擇性的培養(yǎng)基使處于瀕死狀態(tài)的沙門氏菌恢復其活力，再進行選擇性增菌，使沙門氏菌得以增殖而大多數(shù)的其它細菌受到抑制。二、實驗材料

1．檢驗對象a.預先準備的各種肉制品，鮮肉；罐頭；鹽水鵝；b.從市場中采集的其它可疑食品。2．載玻片；滅菌試管；滴管；滅菌燒杯；勻漿器；滅菌生理鹽水；天平3．沙門氏菌菌種，以雞白痢、雞傷寒為宜。三、檢驗步驟1．對可疑食品進行總體觀察，判斷其氣味、色澤，罐頭食品是否有胖聽現(xiàn)象等。2．對于凍肉、蛋品、乳品及其他加工食品均應經(jīng)過前增菌。方法是以無菌操作取25g（ml），加在裝有225ml緩沖蛋白胨水的500ml廣口瓶內(nèi)。固體食品可先磨碎或乳化，于37℃培養(yǎng)4h（干蛋品18

24h）。3．增菌移取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml氯化鎂孔雀綠增菌液或四硫磺酸鈉煌綠增菌液內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18

24h。同時，另取10ml，轉(zhuǎn)種于100ml亞硒酸鹽胱氨酸增菌液內(nèi)，于37℃培養(yǎng)18

24h。4．分離取上述增菌液接種于BS瓊脂或DHL瓊脂，進行純培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)18-24小時。并挑取單個菌落進行進一步的生化鑒定。5．生化試驗各種糖發(fā)酵試驗，三糖鐵實驗，尿素酶試驗，做涂片染色鏡檢應為G—陰性桿菌，必要時做氧化酶試驗，應為陰性。6．血清學試驗1）抗原的準備2）O抗原的鑒定3）鞭毛抗原的鑒定四、討論分析

1、如何了解前增菌在沙門氏菌檢驗中所起的作用？2、在腸桿菌科利用哪些鑒別方法可把沙門氏菌屬同腸桿菌科其它屬區(qū)別開？3、沙門氏菌血清學鑒定應遵循什么方法進行？實驗八金色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、腸球菌的檢驗一、實驗目的1．認識三種細菌在培養(yǎng)基上的生長表現(xiàn)2．認識三種細菌在菌體排列上的特點二、實驗內(nèi)容1.對三種細菌做革藍氏染色鏡檢,比較其形態(tài)學差異.2．Baird-Parker氏培養(yǎng)基的劃線培養(yǎng)

金黃色葡萄球菌在Baird-Parker氏培養(yǎng)基上為圓形、光滑凸起、濕潤、直徑為2

3mm，顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一渾濁帶，在外層有一透明帶Baird-Parker氏培養(yǎng)基成分胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰5g瓊脂20gpH值7.3增菌劑的配法30%的卵黃鹽水50ml與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10ml混合，保存于冰箱內(nèi)。制作將Baird-Parker氏培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻至50℃，加入增菌劑5%，充分搖勻后，傾注平板。培養(yǎng)基應是致密不透明的，使用前在冰箱內(nèi)儲存不得超過48h?？梢愿膭尤缦拢?0%的卵黃鹽水以及除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液保存于冰箱內(nèi)。將Baird-Parker氏培養(yǎng)基高壓滅菌并冷卻至50℃，直接加入30%的卵黃鹽水5%，1%亞碲酸鉀溶液1%。3．血漿凝固酶試驗A．試管法1）吸取1：4稀釋的新鮮兔血漿0.5ml，放入小試管中，2）再加入培養(yǎng)24h的金黃色葡萄球菌肉浸液肉湯培養(yǎng)物0.5ml，震蕩混勻，置37℃，每30min觀察一次，觀察6h，3）如呈現(xiàn)凝固，即將試管傾斜或倒置，呈現(xiàn)凝塊者，為陽性結果。玻片法通常用于檢測葡萄球菌胞壁上的凝集因子。取未稀釋的兔血漿及生理鹽水各一滴，分別放于潔凈玻片上，挑取試驗菌，分別與鹽水及血漿混合，立即觀察，凝者判為陽性。本實驗中采用玻片法進行凝集實驗玻片法進行凝集試驗，檢查金色葡萄球菌細胞壁上的凝集因子。再挑取菌落與鹽水混勻，使菌體成云霧狀最后加一滴血漿，使之與細菌混合先加數(shù)滴生理鹽水3．美藍牛乳試驗原理在牛乳美藍培養(yǎng)基中，0.1%的美藍對

溶血鏈球菌和

鏈球菌有抑制作用，而糞腸球菌和乳球菌屬細菌不受影響，可在其中生長，產(chǎn)生脫氫酶，使美藍變?yōu)榘咨７椒▽⒓毦釉谂Ｈ槊浪{培養(yǎng)基上，置37℃培養(yǎng)4天，如有生長則培養(yǎng)基的藍色逐漸消失，即為美藍還原試驗陽性，相反顏色不變，即為陰性。試驗菌株：腸球菌（+）；溶血鏈球菌（—）3．牛乳美藍培養(yǎng)基成分脫脂乳100ml1%美藍1~2ml混合后，分裝試管，115℃，20min滅菌，備用。4．腸球菌培養(yǎng)基（EC）

將腸球菌在此培養(yǎng)基上做劃線分離成分胰蛋白胨2g酵母浸粉