動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器及專(zhuān)用微載體

動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器及專(zhuān)用微載體廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院柯德森為什么要進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)?動(dòng)物細(xì)胞的特點(diǎn)、培養(yǎng)條件及存在問(wèn)題動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞反應(yīng)器的控制動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)專(zhuān)用微載體內(nèi)容提要?jiǎng)游锛?xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)是指離體細(xì)胞在無(wú)菌條件下分裂、生長(zhǎng)，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中不出現(xiàn)分化，不再形成組織。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的意義動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)生產(chǎn)生物工程產(chǎn)品,特別是功能蛋白質(zhì)方面具有明顯的優(yōu)勢(shì):1)同源性:直接進(jìn)行翻譯后加工,蛋白質(zhì)可直接折疊成正確的構(gòu)象翻譯后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。2)有利于產(chǎn)品的分離純化:分泌胞外、純化方便動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的意義醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域生物工程生物制藥領(lǐng)域羊水細(xì)胞培養(yǎng)羊水細(xì)胞培養(yǎng)是培養(yǎng)羊水內(nèi)脫落的胎兒細(xì)胞，做成染色體核型分析，用于診斷胎兒染色體病及胎兒畸形，是一種科學(xué)的、結(jié)果可靠的、安全的產(chǎn)前診斷法。

常用于生物工程及制藥行業(yè)的動(dòng)物細(xì)胞體系

W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’Basalmedium）。10%小牛血清，pH7.2,同工酶為G6PDB型。倍增時(shí)間為24h，有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。

MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。核型為2n=46。屬成纖維細(xì)胞。培養(yǎng)基用加小牛血清。同工酶G6PDB型。有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對(duì)不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對(duì)人的病毒敏感。

用于生產(chǎn)疫苗。

BHK-21:從5只無(wú)性別的生長(zhǎng)1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。

Vero：從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。為貼壁依賴(lài)的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。

Namalwa：從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類(lèi)淋巴母細(xì)胞。2.8%的高倍體率，12～14條標(biāo)記染色體。單條X，無(wú)Y。培養(yǎng)基為RPMI1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)α干擾素。

SP2/0-Ag14：通過(guò)融合的方法，從有羊抗紅細(xì)胞活性的BALB/c小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag亞克隆中分離獲得，能耐受8氮鳥(niǎo)嘌呤20μg/ml但在含HAT選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞和抗體。

Sf-91983年從親代IPLB—SF21AE中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲(chóng)的蛹卵組織中分離獲得。它對(duì)苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液,10%胎牛血清。用于高效表達(dá)外來(lái)蛋白制品。動(dòng)物細(xì)胞的生理特點(diǎn)動(dòng)物細(xì)胞有兩種類(lèi)型:1）非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞(血液、淋巴組織、腫瘤組織）2）貼壁依賴(lài)性細(xì)胞（大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞，包括非淋巴組織的細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞）培養(yǎng)方法1、貼壁培養(yǎng)2、懸浮培養(yǎng)3、固定化培養(yǎng)貼壁培養(yǎng):貼壁依賴(lài)性細(xì)胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開(kāi)始有絲分裂并迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)都采取這種方式.動(dòng)物細(xì)胞對(duì)周?chē)h(huán)境十分敏感:

對(duì)理化因素敏感，如：滲透壓、pH、離子濃度、剪切力、微量元素等。動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基要求高:

必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長(zhǎng)因子、貼壁因子等。1、培養(yǎng)基組成：血清是目前細(xì)胞培養(yǎng)基中不可缺少的成分，向細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需要的激素、轉(zhuǎn)移蛋白和其他營(yíng)養(yǎng)成分，已成為細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)到最優(yōu)化和降低成本的主要障礙。降低血清用量和采用無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基是目前研究的熱點(diǎn)。六大限制細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：血清培養(yǎng)基的主要缺點(diǎn)及其原因：血清中含有細(xì)胞生長(zhǎng)必須的微量組分，但這些組分的成分及其作用至今未清楚，因此無(wú)法取代；血清的存在是產(chǎn)物純化的主要障礙；血清是病毒污染及其他未知因素影響的主要來(lái)源，增加了細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)品潛在的使用危險(xiǎn)；血清是培養(yǎng)基成本的主要部分；血清同時(shí)也有生長(zhǎng)抑制的作用；血清使用使實(shí)驗(yàn)和生產(chǎn)過(guò)程標(biāo)準(zhǔn)化變得困難。2、限制細(xì)胞生長(zhǎng)的因素：動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)能達(dá)到的細(xì)胞密度較低的主要原因是培養(yǎng)條件和最優(yōu)化控制的困難，包括：細(xì)胞代謝產(chǎn)物的毒害：乳酸、氨等；營(yíng)養(yǎng)物的耗竭可利用的表面積的限制；接種的細(xì)胞最小密度；解決問(wèn)題的方法是通過(guò)過(guò)程調(diào)控來(lái)實(shí)現(xiàn)：灌注系統(tǒng)、換液、流加等，其中灌注是最好的方法。同時(shí)采用合理的培養(yǎng)系統(tǒng)以增加表面積并提供最佳的物理化學(xué)環(huán)境。細(xì)胞凋亡3、污染的控制：污染來(lái)源包括細(xì)胞種子、血清、試劑、實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作人員。污染控制起始于細(xì)胞種子及其保存；除菌方法的改進(jìn)是關(guān)鍵---血清？可高溫滅菌的培養(yǎng)基的研究；設(shè)備的合理設(shè)計(jì)及操作人員的培訓(xùn)必不可少。4、產(chǎn)物表達(dá)的控制：?jiǎn)栴}：細(xì)胞生長(zhǎng)的最優(yōu)化條件并不一定是表達(dá)的產(chǎn)物的最優(yōu)化條件？問(wèn)題的解決在于上游分子生物學(xué)的研究5、硬件和過(guò)程設(shè)計(jì)參數(shù)：硬件設(shè)計(jì)中的主要問(wèn)題：細(xì)胞培養(yǎng)條件的控制（溫度、溶解氧、二氧化碳、pH、滲透壓），其中充分的氧傳遞是所有生物反應(yīng)器中的共同問(wèn)題；而其他條件對(duì)動(dòng)物細(xì)胞來(lái)說(shuō)可以接受的范圍都比較窄。污染的排除；遏制潛在生物毒害物的擴(kuò)散；足夠表面積的提供；培養(yǎng)過(guò)程中剪切力的控制（攪拌、通氣、收獲）6、產(chǎn)物收獲目前細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物的收率很低，不及總蛋白的1%，主要原因在于：血清蛋白質(zhì)的污染；細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物濃度低；產(chǎn)物在培養(yǎng)條件下不穩(wěn)定；解決方法：使用無(wú)血清培養(yǎng)基；開(kāi)發(fā)在無(wú)血清培養(yǎng)基中穩(wěn)定蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法；開(kāi)發(fā)篩選技術(shù)以得到產(chǎn)量高的細(xì)胞克隆；開(kāi)發(fā)產(chǎn)物分離技術(shù)：親和柱、中空纖維、微囊等動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的方式1、貼壁培養(yǎng)2、懸浮培養(yǎng)3、固定化培養(yǎng)一.貼壁培養(yǎng)概念:貼壁依賴(lài)性細(xì)胞在培養(yǎng)中要貼附于壁上才能迅速鋪展,開(kāi)始有絲分裂并迅速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,這種培養(yǎng)方式就叫貼壁培養(yǎng).多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)都采取這種方式.1.單層靜置貼壁培養(yǎng)2.多層固定培養(yǎng)法玻璃圓柱鈦碟裝置3.微載體培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn):表面積/體積比大;微載體懸浮于培養(yǎng)基中,細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境均一,便于監(jiān)測(cè)和控制;培養(yǎng)基利用率高;采樣重演性好;收獲過(guò)程不復(fù)雜;放大較容易;勞動(dòng)強(qiáng)度小,占用空間小.4.中空纖維培養(yǎng)法:

模擬脈管在細(xì)胞間分布擴(kuò)散的原理,采用合成的中空纖維制成類(lèi)似脈管的分布擴(kuò)散系統(tǒng).細(xì)胞接種于中空纖維外表面與反應(yīng)器內(nèi)表面之間,培養(yǎng)液自入口進(jìn)入儲(chǔ)罐,進(jìn)行再生處理,循環(huán)使用.6.玻璃珠床反應(yīng)器二.懸浮培養(yǎng)概念:是指細(xì)胞在培養(yǎng)器中自由懸浮生長(zhǎng)的過(guò)程.主要用于非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞培養(yǎng),如雜交瘤細(xì)胞等.是在微生物發(fā)酵的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的;可以借鑒微生物發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn);由于動(dòng)物細(xì)胞比較脆弱,所以在攪拌通氣等方式上必須比微生物培養(yǎng)更加溫和.三.固定化培養(yǎng)概念:利用吸附或包埋等固定化的方式將細(xì)胞限制在一定的空間內(nèi),然后以固定化的顆粒進(jìn)行懸浮培養(yǎng).該方法對(duì)貼壁性和非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞都是適合的.常用的包埋培養(yǎng)方法:對(duì)非貼壁依賴(lài)性細(xì)胞常用海藻酸鈣包埋;對(duì)貼壁依賴(lài)性細(xì)胞常用膠原包埋.動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式分為5種:分批式、流加式、半連續(xù)式、連續(xù)式、灌注式一、分批式操作：概念：是將細(xì)胞和培養(yǎng)液一次性裝入反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞不斷生長(zhǎng)，產(chǎn)物也不斷形成，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，將整個(gè)反應(yīng)系取出。培養(yǎng)過(guò)程：滯后期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、減速期、穩(wěn)定期、衰退期優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便，容易掌握，是最常用的方式；缺點(diǎn)：不能使細(xì)胞自始至終處于最優(yōu)條件下。二、流加式操作：概念：先將一定量的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器，，在培養(yǎng)過(guò)程中隨著細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的不斷消耗，新的營(yíng)養(yǎng)成分不斷補(bǔ)充至反應(yīng)器內(nèi)，使細(xì)胞進(jìn)一步代謝，到反應(yīng)終止時(shí)取出整個(gè)反應(yīng)系。特點(diǎn)：1）能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度；2）整個(gè)過(guò)程中反應(yīng)體積是變化的。存在二種流加方式：無(wú)反饋控制流加：反饋控制流加：最常見(jiàn)的流加物質(zhì)：葡萄糖、谷氨酰胺等能源和碳源三、半連續(xù)式操作（反復(fù)分批式、換液培養(yǎng)）：概念：在分批培養(yǎng)操作的基礎(chǔ)上，不全部取出反應(yīng)系，剩余部分重新補(bǔ)充新的營(yíng)養(yǎng)成分，再按分批式操作方式進(jìn)行培養(yǎng)，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液的總體積保持不變。優(yōu)點(diǎn)：可反復(fù)收獲培養(yǎng)液，對(duì)培養(yǎng)基因工程動(dòng)物細(xì)胞分泌有用產(chǎn)物或病毒培養(yǎng)過(guò)程比較實(shí)用。四、連續(xù)操作：概念：在培養(yǎng)過(guò)程中一方面新鮮培養(yǎng)液不斷加入反應(yīng)器內(nèi)，另一方面又將反應(yīng)液連續(xù)不斷地取出，使反應(yīng)條件處于一種恒定狀態(tài)。優(yōu)點(diǎn)：維持細(xì)胞一直處于優(yōu)化狀態(tài)下，促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物的形成；對(duì)細(xì)胞生理和代謝規(guī)律的研究是一種重要的手段。五