第六章 細胞培養(yǎng)的基本技術

第五章細胞培養(yǎng)的基本技術第一節(jié)、培養(yǎng)細胞的

取材和分離一、培養(yǎng)室內的無菌操作（1）培養(yǎng)前的準備（2）培養(yǎng)室和超凈臺的消毒（3）洗手和著裝（4）無菌培養(yǎng)操作二、培養(yǎng)細胞的取材（1）取材的基本要求A、取材的組織最好盡快培養(yǎng)。B、取材時應嚴格無菌消毒。C、取材和原代培養(yǎng)時要用鋒利的器械如手術刀片切碎組織，盡量減少對細胞的機械損傷。二、培養(yǎng)細胞的取材（1）取材的基本要求D、對于血液、脂肪、結締組織和壞死組織等，取材時要細心除去。E、胚胎組織較成熟個體的組織容易培養(yǎng)，分化地的較分化高的組織容易生長，腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。二、培養(yǎng)細胞的取材（2）組織材料的分離目前常用分散組織的方法有機械法和化學法兩種二、培養(yǎng)細胞的取材（2）組織材料的分離A、細胞懸液的分離方法如材料為血液、羊水等細胞懸液時，一般采用低速離心方法。（2）組織材料的分離B、組織塊的分離方法a、機械分散法（2）組織材料的分離B、組織塊的分離方法b、剪切分離法（2）組織材料的分離B、組織塊的分離方法c、消化分離法消化法是結合生化和化學手段把已剪切成較小體積的組織進一步分散的方法。胰蛋白酶法、膠原酶法、EDTA法三、細胞的計數血球計數板16中格×25小格計算公式：

細胞數/ml=100小格內細胞個數/100×400×10000×稀釋倍數25中格×16小格計算公式：

細胞數/ml=80小格內細胞個數/80×400×10000×稀釋倍數在計數時，對沉降在格線上的細胞的統(tǒng)計應有統(tǒng)一的規(guī)定。如細胞位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的細胞按規(guī)定計入相應的格中。第二節(jié)原代培養(yǎng)原代培養(yǎng)：是從供體取得組織細胞后在體外進行的首次培養(yǎng)。原代培養(yǎng)分為：一、組織塊培養(yǎng)法二、消化培養(yǎng)法三、器官培養(yǎng)法一、組織塊培養(yǎng)法

組織塊培養(yǎng)法是常用的、簡便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法。即將組織剪切成小塊后，接種于培養(yǎng)瓶。一、組織塊培養(yǎng)法

步驟：1、取材修剪沖洗2、剪成1mm3左右的小塊3、移入培養(yǎng)瓶4、間距5mm分布組織小塊5、翻轉培養(yǎng)瓶37℃靜止1-2h6、翻正培養(yǎng)瓶培養(yǎng)7、原代細胞培養(yǎng)一、組織塊培養(yǎng)法

二、消化培養(yǎng)法1、消化分離法消化細胞2、鏡檢，發(fā)現組織已分散成細胞團或單個細胞，終止消化，篩網過濾，大塊繼續(xù)消化。3、過濾的消化液，低速離心，加培養(yǎng)液，細胞計數后，接入培養(yǎng)瓶。第三節(jié)傳代培養(yǎng)和

細胞系的維持傳代培養(yǎng)的原因？原代培養(yǎng)后，由于細胞數量增加，整個培養(yǎng)器皿，逐漸被細胞覆蓋，如果不進行傳代培養(yǎng)細胞會因生存空間不足或密度過大，營養(yǎng)障礙，影響細胞生長。一、原代培養(yǎng)的首次傳代傳代：細胞由原代培養(yǎng)瓶內分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱為傳代。二、細胞傳代方法1、貼壁細胞的消化法傳代二、細胞傳代方法1、貼壁細胞的消化法傳代（1）吸出或倒掉瓶內的舊培養(yǎng)液。（2）加入適量的消化液消化。（3）鏡檢，發(fā)現細胞質回縮，細胞間隙增大后，應立即終止消化（4）吹打瓶壁細胞，制成細胞懸液（5）技術，接種到新的培養(yǎng)瓶。二、細胞傳代方法1、懸浮細胞的傳代懸浮細胞多采用離心方法傳代，即將細胞連同培養(yǎng)液一并轉移到離心管內，800-1000rpm離心5min,然后取出上清，加入新的培養(yǎng)液到離心管內，用吸管吹打使之形成細胞懸液，然后傳代接種。細胞系的維持是通過換液，傳代，再換液、再傳代和細胞凍存實現的。三、培養(yǎng)細胞的維持細胞系的維持注意的要點：1、細胞系檔案要記錄好。2、細胞系的傳代、換液一般都有自身的規(guī)律性，要注意保持其穩(wěn)定的規(guī)律性。3、多種細胞系維持傳代，要嚴格操作程序，以防細胞之間交叉污染。4、每一種細胞都應有充足的凍存儲備。四、細胞培養(yǎng)的常規(guī)檢查1、檢查營養(yǎng)液的pH值。新鮮培養(yǎng)液呈橙紅色（pH7.2）細胞生長旺盛，代謝產生的酸性物質積累增多，營養(yǎng)液酸化變黃，