第九章 基因工程與干細(xì)胞工程

第九章基因工程與干細(xì)胞工程基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室宋方洲

140多年前（1865），在捷克莫勒溫鎮(zhèn)一個(gè)修道院里沉醉于豌豆雜交實(shí)驗(yàn)的Mendel也許根本就沒(méi)有想到，他提出的遺傳因子在半個(gè)世紀(jì)后被Morgen定義為基因；1944年Avery證明了基因的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA；20世紀(jì)50年代初Watson和Crick又揭示了DNA的分子結(jié)構(gòu)；70年代初DNA已可在體外被隨意拼接并轉(zhuǎn)回到細(xì)菌體內(nèi)遺傳和表達(dá)。生命科學(xué)的飛速發(fā)展孕育了現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)——基因工程。今天，人們?cè)诔胸浖苌峡梢再I到保持期很長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因土豆，“多利”克隆綿羊走出實(shí)驗(yàn)室，基因工程正在使整個(gè)人類生活方式發(fā)生重大變革。引言第一部分基因工程

現(xiàn)在，關(guān)于基因工程的概念，不同的學(xué)者和不同的專著有不同的解釋，很難有一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的、準(zhǔn)確的和固定的概念，而且，隨著學(xué)科的發(fā)展，其內(nèi)涵還在不斷的擴(kuò)展和延伸。就現(xiàn)在的學(xué)科發(fā)展情況，可作以下闡述。同時(shí)，為便于同學(xué)們學(xué)習(xí)理解,有必要對(duì)其相關(guān)的幾個(gè)概念作一介紹。一、基因工程的基本概念1、遺傳工程（GeneticEngineering）是七十年代才開始發(fā)展起來(lái)的一門新技術(shù)，是在分子遺傳學(xué)的理論基礎(chǔ)上，綜合采用了分子生物學(xué)與微生物學(xué)的現(xiàn)代方法和手段建立起來(lái)的。也是遺傳學(xué)和工程學(xué)相結(jié)合的一門技術(shù)科學(xué)。借用工程技術(shù)上的概念和設(shè)計(jì)思想，在離體條件下，對(duì)生物細(xì)胞、細(xì)胞器、染色體或DNA分子進(jìn)行按圖施工的遺傳操作，以求定向改造生物的遺傳特性。（一）遺傳工程、基因工程與生物工程的定義這一先進(jìn)技術(shù)的興起，標(biāo)志著現(xiàn)代遺傳學(xué)或生物科學(xué)已發(fā)展到定向控制和改造遺傳或生物性狀的新階段。遺傳工程可分為狹義和廣義兩種：（1）狹義的遺傳工程即基因工程（2）廣義的遺傳工程包括：基因工程、細(xì)胞工程、染色體工程、細(xì)胞器工程等2、基因工程（GeneticEngineering）原稱遺傳工程，又稱基因操作（genemanipulation）、重組DNA（recombinantDNA）:是指采用類似于工程建設(shè)的方式，按照預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，將一種或多種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組構(gòu)建成雜種DNA分子，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，以改變生物原有的遺傳特性并表達(dá)出新的性狀，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。因此，供體、受體和載體稱為基因工程的三大要素，其中相對(duì)于受體而言，來(lái)自供體的基因?qū)儆谕庠椿?。除了少?shù)RNA病毒外，幾乎所有生物的基因都存在于DNA結(jié)構(gòu)中，而用于外源基因重組拼接的載體也都是DNA分子，因此基因工程亦稱為重組DNA技術(shù)（DNARecombination）。另外，DNA重組分子大都需在受體細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增，故還可將基因工程表征為分子克?。∕olecularCloning）或基因的無(wú)性繁殖。3、生物工程（Biotechnology），又稱生物技術(shù)、生物工藝學(xué)。也是20世紀(jì)70年代誕生的一門新型技術(shù)。是根據(jù)生物學(xué)、化學(xué)和工程學(xué)的原理進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的經(jīng)營(yíng)和開發(fā)微生物、動(dòng)植物細(xì)胞及其亞細(xì)胞組分，進(jìn)而利用生物體所具有的功能元件（如基因、蛋白質(zhì)等）來(lái)提供商品或社會(huì)服務(wù)的一門綜合性科學(xué)技術(shù)。

生物工程被看作為新技術(shù)的革命標(biāo)志之一，它與電子信息技術(shù)、新材料和新能源等技術(shù)并列，成為關(guān)系到人類生存和社會(huì)進(jìn)步、發(fā)展的世界高技術(shù)領(lǐng)域的重要支柱。這不僅因?yàn)樗芯颗c開發(fā)的對(duì)象是可以再生的生物資源，而且還因?yàn)樗鼘?duì)當(dāng)今人類面臨的人口和食物、能源和資源以及環(huán)境和健康等迫切需要解決的問(wèn)題發(fā)揮重要的作用，并展現(xiàn)了極其誘人的前景。生物工程包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等。（1）基因工程（geneengineering）又稱基因操作（genemanipulation）、重組DNA（recombinantDNA）?；蚬こ淌且苑肿舆z傳學(xué)理論為基礎(chǔ)，以分子生物學(xué)和微生物學(xué)的現(xiàn)代方法為手段，將不同來(lái)源的基因（DNA分子），按預(yù)先設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，在體外構(gòu)建雜種DNA分子，然后導(dǎo)入活細(xì)胞，以改變生物原有的遺傳特性，獲得新品種，生產(chǎn)新產(chǎn)品，或是研究基因的結(jié)構(gòu)和功能。

（2）細(xì)胞工程（cellengineering）應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的原理和方法，結(jié)合工程學(xué)的技術(shù)手段，按照人們預(yù)先的設(shè)計(jì)，有計(jì)劃地改變或創(chuàng)造細(xì)胞遺傳特性的技術(shù)，以及在體外大量培養(yǎng)和繁殖細(xì)胞，或獲得細(xì)胞產(chǎn)品，或利用細(xì)胞體本身的技術(shù)領(lǐng)域。是在細(xì)胞水平上進(jìn)行遺傳操作.主要內(nèi)容包括細(xì)胞融合、細(xì)胞拆合、染色體轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)移、細(xì)胞或組織培養(yǎng)等。由于所用細(xì)胞的來(lái)源不同，細(xì)胞工程又分為微生物工程、植物細(xì)胞工程、動(dòng)物細(xì)胞工程等。（3）細(xì)胞分泌工程是根據(jù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成和運(yùn)輸理論而發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新的細(xì)胞工程技術(shù)，主要是通過(guò)對(duì)基因改造，如基因缺失、多效分泌突變、周質(zhì)泄漏突變或拼接信號(hào)肽基因等措施，促進(jìn)基因產(chǎn)物分泌的技術(shù)。

（4）酶工程（enzymeengineering）又稱為酶技術(shù)。它是圍繞著酶所特有的生化催化特性，結(jié)合現(xiàn)代化的技術(shù)手段，在體外模擬或在常溫常壓下生成酶反應(yīng)的產(chǎn)品；以及利用重組DNA技術(shù)定向改變酶，進(jìn)行酶的修飾，或酶的全人工合成。其主要內(nèi)容包括酶的化學(xué)修飾、酶的固定化、酶反應(yīng)器等。

（5）蛋白質(zhì)工程（proteinengineering）是更廣義上的包括酶工程在內(nèi)的蛋白質(zhì)修飾操作，通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)及酶的化學(xué)修飾及基因改造獲得具有特殊功能的非自然蛋白質(zhì)的技術(shù)。主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能間的相互關(guān)系，利用基因工程技術(shù)，或用化學(xué)方法合成基因、改造基因，以便合成新的蛋白質(zhì)，或改變蛋白質(zhì)的活性、功能以及溶解性等。（6）發(fā)酵工程（fermentationengineering）又稱微生物工程，微生物發(fā)酵工程。利用生物，主要是微生物的某種特定功能，通過(guò)現(xiàn)代化工程技術(shù)手段，生產(chǎn)有用物質(zhì)，或把微生物直接用于某種工業(yè)化生產(chǎn)的一種技術(shù)體系。主要內(nèi)容包括菌種選育，發(fā)酵生產(chǎn)微生物，或植物細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，生產(chǎn)微生物菌體，最佳培養(yǎng)條件的優(yōu)化組合等。（7）干細(xì)胞工程（Stemcellengineering）

重點(diǎn)介紹基因工程與干細(xì)胞工程

作為現(xiàn)代生物工程的關(guān)鍵技術(shù)，基因工程的主體戰(zhàn)略思想是外源基因的穩(wěn)定高效表達(dá)。為達(dá)到此目的，可從以下四個(gè)方面考慮。（1）利用載體DNA在受體細(xì)胞中獨(dú)立于染色體DNA而自主復(fù)制的特性，將外源基因與載體分子重組，通過(guò)載體分子的擴(kuò)增提高外源基因在受體細(xì)胞中的劑量，借此提高其宏觀表達(dá)水平。這里涉及到DNA分子高拷貝復(fù)制以及穩(wěn)定遺傳的分子遺傳學(xué)原理。二、基因工程的基本原理（2）篩選、修飾和重組啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、操作子、終止子等基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，并將這些元件與外源基因精細(xì)拼接，通過(guò)強(qiáng)化外源基因的轉(zhuǎn)錄提高其表達(dá)水平。

（3）選擇、修飾和重組核糖體結(jié)合位點(diǎn)及密碼子等mRNA的翻譯調(diào)控元件，強(qiáng)化受體細(xì)胞中蛋白質(zhì)的生物合成過(guò)程。上述兩點(diǎn)均涉及到基因表達(dá)調(diào)控的分子生物學(xué)原理。（4）基因工程菌（細(xì)胞）是現(xiàn)代生物工程中的微型生物反應(yīng)器，在強(qiáng)化并維持其最佳生產(chǎn)效能的基礎(chǔ)上，從工程菌（細(xì)胞）大規(guī)模培養(yǎng)的工程和工藝角度切入，合理控制微型生物反應(yīng)器的增殖速度和最終數(shù)量，也是提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的主要環(huán)節(jié)，這里涉及的是生物化學(xué)工程學(xué)的基本理論體系。因此，分子遺傳學(xué)、分子生物學(xué)以及生化工程學(xué)是基因工程原理的三大基石。（一）工具酶基因工程中的許多工作都涉及到對(duì)DNA進(jìn)行切割和重組，或?qū)NA進(jìn)行修飾或合成。這些工作都是通過(guò)酶的作用來(lái)完成的。切割、合成、連接、修飾等各種工具酶都是必不可少的。三、基因工程所需材料(元件)

限制酶（restrictionenzyme）是一類內(nèi)切核酸酶，因而又稱為限制性內(nèi)切核酸酶。這類酶能識(shí)別雙鏈DNA內(nèi)部特異位點(diǎn)并且裂解磷酸二脂鍵。（1）限制酶的種類根據(jù)酶結(jié)構(gòu)、作用及與DNA結(jié)合和裂解的特異性，將限制酶分為三型.Ⅰ型酶具有限制和DNA修飾作用，這種酶通常在識(shí)別位點(diǎn)下游100～1000bp處切割DNA。1、限制酶

Ⅱ型酶是DNA重組技術(shù)中最重要的工具酶，它能在DNA分子內(nèi)部的特異位點(diǎn)識(shí)別和切割雙鏈DNA，其切割位點(diǎn)的序列可知、固定。通常所說(shuō)的限制酶就是指這一類酶。Ⅲ型酶與Ⅰ型酶一樣，具有限制與修飾活性，能在識(shí)別位點(diǎn)附近切割DNA，切割位點(diǎn)很難預(yù)測(cè)。所以,在基因克隆中,Ⅰ型和Ⅲ型酶都沒(méi)有多大的實(shí)用價(jià)值。

（2）限制酶的命名a.第一個(gè)字母為該酶的細(xì)菌屬名,大寫;b.第二、三個(gè)字母為該細(xì)菌的種名，小寫；c.第四個(gè)字母代表株;d.用羅馬數(shù)字表示酶的編號(hào)（現(xiàn)常用來(lái)表示發(fā)現(xiàn)的先后次序）例：EcoRⅠE代表Escherichia屬，co代表coli種，R代表RY13株，Ⅰ代表該菌株中首次分離到的內(nèi)切核酸酶。

HindⅢ（3）限制酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)通常是4～6堿基對(duì)，具有回文序列（palindrom）的DNA片段，大多數(shù)酶是錯(cuò)位切割雙鏈DNA，產(chǎn)生5＇或3＇粘性未端（stickyend）。如EcoRⅠ切割后產(chǎn)生5＇粘性未端：5′-GAATTC-3′3′-CTTAAG-5′5′-G3′-CTTAAAATTC-3′G-5′（4）同功異源酶（isoschizomers）來(lái)源不同，識(shí)別和切割位點(diǎn)相同?？苫ハ啻谩Ｈ纾築amHⅠ和BstⅠ(G↓GATCC)（5）同尾酶（isoaudamers）產(chǎn)生相同的粘性末斷如：BamHⅠ(G↓GATCC)和Sau3AⅠ(N↓GATCN)

商品化的限制酶已有100多種（其切割序列明確）

基因工程中常用的工具酶有許多是對(duì)DNA和RNA分子未端進(jìn)行剪切、補(bǔ)平、連接及化學(xué)修飾的酶，常見的有以下幾種：（1）DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶Ⅰ是從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)DNA聚合酶，分子量為109kD。它能以DNA為模板，以4種脫氧核苷酸為底物以及Mg2+的參與下，在引物的游離3＇-OH上，形成3＇，5＇-磷酸二酯鍵。該酶除有聚合酶活性外，尚有3＇→5＇及5＇→3＇核酸外切酶活性。由于它具有5＇→3＇核酸外切酶活性，當(dāng)用缺口平移法（nicktranslation）標(biāo)記DNA探針時(shí)，常用DNA聚合酶Ⅰ。2、修飾酶

用枯草桿菌蛋白酶可將DNA聚合酶Ⅰ裂解為大小兩個(gè)片段，大片段的分子量為76kD，這個(gè)片段也稱為Klenow片段（Klenowfragment）。它具有5＇→3＇聚合酶活性及3＇→5＇外切酶活性，而失去了5＇→3＇外切酶活性。它具有的3＇→5＇外切酶活性能保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性，把DNA合成過(guò)程中錯(cuò)誤配對(duì)的核苷酸去除，再把正確的核苷酸接上去。Klenow片段的主要用途有：①補(bǔ)齊雙鏈DNA的3＇末端。②通過(guò)補(bǔ)齊3＇端使3＇末端標(biāo)記。③在cDNA克隆中，第二股鏈的合成。④DNA序列分析。

（2）逆轉(zhuǎn)錄酶（reversetranscriptase）常用的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種，a.禽類成骨細(xì)胞性白血病病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶b.Moloney小鼠白血病病毒（MMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板合成DNA，合成時(shí)需要4種脫氧核苷酸及引物，合成方向?yàn)?＇→3＇延伸，無(wú)3＇→5＇外切酶活性。廣泛用于以mRNA為模板合成cDNA，構(gòu)建cDNA文庫(kù)。

（3）T4DNA連接酶（T4DNAligase）T4DNA連接酶催化雙鏈DNA一端3＇-OH與另一雙鏈DNA的5＇端磷酸根形成3＇，5＇-磷酸二酯鍵，使具有相同粘性末端或平端的DNA末端連接起來(lái)。（4）堿性磷酸酶堿性磷酸酶（alkalinephosphatase）能去除DNA或RNA5＇端的磷酸根。制備載體時(shí)，用堿性磷酸酶處理后，可防止載體自身連接，提高重組效率。（5）末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶（terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT）簡(jiǎn)稱末端轉(zhuǎn)移酶。它的作用是將脫氧核苷酸加到DNA的3＇-OH上，主要用于探針標(biāo)記；或者在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于進(jìn)行連接。（6）TaqDNA聚合酶和其他耐熱DNA聚合酶見PCR反應(yīng)。

除此之外，還有T4多聚核苷酸激酶，RNA聚合酶，核酸酶等。1.克隆載體：應(yīng)用重組DNA技術(shù)克隆DNA片段時(shí)，通常采用大腸桿菌作為宿主細(xì)胞（hostcell）。所要克隆的目的DNA沒(méi)有明顯的遺傳標(biāo)志，如果將其直接導(dǎo)入宿主細(xì)胞，沒(méi)有有效的方法將導(dǎo)入外源DNA片段的細(xì)胞和沒(méi)有導(dǎo)入外源DNA的細(xì)胞區(qū)分開來(lái)。此外，外源DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞后，本身不能隨宿主細(xì)胞的繁殖而自制，即沒(méi)有自主復(fù)制能力，達(dá)不到使外源DNA片段擴(kuò)增的目的。（二）載體如果要將外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)，就需要有一個(gè)能在該宿主細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制和表達(dá)的載體（vector）來(lái)攜帶，載體實(shí)際上也是DNA。外源DNA片段與載體在體外連接，構(gòu)成DNA重組體,然后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，使之進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)。以大腸桿菌為宿主細(xì)胞的載體主要有:質(zhì)粒、λ噬菌體、粘粒質(zhì)粒和M13噬菌體.A.質(zhì)粒(plasmid)

特點(diǎn)：a.分子量小，穩(wěn)定，高拷貝數(shù)；b.有遺傳標(biāo)志，便于選擇；c.有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)——多克隆位點(diǎn)，便于外源基因插入。主要用作亞克隆載體（只能容納10kb外源DNA片段）B.λ噬菌體(λbacteriophage,λphage)

細(xì)菌病毒可容納9-23kb外源DNA片段C.粘粒質(zhì)粒(cosmid)

是λDNA的cos區(qū)與質(zhì)粒重新構(gòu)建的載體，為雙鏈環(huán)狀DNA;克隆容量可達(dá)40-50kbD.M13噬菌體(M13phage)是一種大腸桿菌噬菌體另外，在人類基因組計(jì)劃中，還使用下面幾種載體：E.酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)容量為：0.5-2MBF.細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)容量為：0.1-0.4MBG.噬菌體人工染色體(phageartificialchromosome,PAC)2.表達(dá)載體（expressingvector）：將常用克隆載體中加入一些與表達(dá)調(diào)控有關(guān)的元件（DNA序列），即成為表達(dá)載體，不僅可以將外源基因片段攜帶進(jìn)入宿主細(xì)胞，而且可以在宿主細(xì)胞（受體細(xì)胞）中表達(dá)（轉(zhuǎn)錄和翻譯）外源基因的載體。這類載體除具有克隆載體所具備的性質(zhì)以外，還帶有表達(dá)構(gòu)件——轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的DNA序列。表達(dá)載體的種類

根據(jù)受體細(xì)胞不同，從而產(chǎn)生多種多樣的表達(dá)載體:

A.大腸桿菌表達(dá)載體

B.分枝桿菌表達(dá)載體C.放線菌表達(dá)載體D.酵母表達(dá)載體E.哺乳動(dòng)物表達(dá)載體

哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體是從克隆載體上發(fā)展起來(lái)的,含有必不可少的原核序列。

依據(jù)定義，基因工程的整個(gè)過(guò)程由工程菌（細(xì)胞）的設(shè)計(jì)構(gòu)建和基因產(chǎn)物的生產(chǎn)兩大部分組成（如圖）。但這之前，必須作好各方面的準(zhǔn)備工作，包括：目的基因的制備（克隆或表達(dá)的基因）、載體的選擇和制備、受體（表達(dá)系統(tǒng)：大腸桿菌、酵母、昆蟲、哺乳動(dòng)物）的準(zhǔn)備等等。四、基因工程的基本過(guò)程其主要操作過(guò)程如下：（1）從供體細(xì)胞中分離出基因組DNA，用限制性核酸內(nèi)切酶分別將外源DNA（包括外源基因或目的基因）和載體分子切開（簡(jiǎn)稱切）；（2）用DNA連接酶將含有外源基因的DNA片段連接到載體分子上，形成DNA重組分子（簡(jiǎn)稱接）；（3）借助于細(xì)胞轉(zhuǎn)化手段將DNA重組分子導(dǎo)入受體細(xì)胞中（簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)）；（4）短時(shí)間培養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞，以擴(kuò)增DNA重組分子或使其整合到受體細(xì)胞的基因組中（簡(jiǎn)稱增）；（5）篩選和鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的基因工程菌或細(xì)胞（簡(jiǎn)稱檢）。由此可見，基因工程的上游操作過(guò)程可簡(jiǎn)化為：

切、接、轉(zhuǎn)、增、檢。

供體細(xì)胞分離外源DNA酶切外源基因載體分子連接受體細(xì)胞DNA重組分子基因工程基本流程示意圖轉(zhuǎn)化與擴(kuò)增重組轉(zhuǎn)化子鑒定與表達(dá)工程菌或細(xì)胞蛋白表達(dá)產(chǎn)物工程菌或細(xì)胞培養(yǎng)重組產(chǎn)物分離純化

從上面的基本流程來(lái)看，基因工程的操作是很簡(jiǎn)單的，但其中涉及到許多關(guān)鍵性技術(shù)，如不同生物來(lái)源的DNA分子的切割與連接、DNA拼接反應(yīng)的檢測(cè)方法以及重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法等。有趣的是，這三項(xiàng)基本技術(shù)幾乎是同時(shí)于20世紀(jì)70年代初發(fā)展起來(lái)的，并迅速導(dǎo)致了第一個(gè)DNA體外重組實(shí)驗(yàn)的誕生。

五、基因工程的發(fā)展歷史

1972年美國(guó)Berg和Jackson等人將猿猴病毒基因組SV40DNA、λ噬菌體基因以及大腸桿菌半乳糖操縱子在體外重組獲得成功。翌年，美國(guó)斯坦福大學(xué)的Cohen和Boyer等人在體外構(gòu)建出含有四環(huán)素和鏈霉素兩個(gè)抗性基因的重組質(zhì)粒分子，將之導(dǎo)入大腸桿菌后，該重組質(zhì)粒得以穩(wěn)定復(fù)制，并賦予受體細(xì)胞相應(yīng)的抗生素抗性，由此宣告了基因工程的誕生。正如Cohen在評(píng)價(jià)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)指出的那樣，基因工程技術(shù)完全有可能使大腸桿菌具備其他生物種類所固有的特殊生物代謝途徑與功能，如光合作用和抗生素合成等。

1.基因工程的誕生

出人意料的是，當(dāng)時(shí)科學(xué)界對(duì)這項(xiàng)新技術(shù)誕生的第一個(gè)反應(yīng)便是應(yīng)當(dāng)禁止有關(guān)實(shí)驗(yàn)的繼續(xù)開展，其嚴(yán)厲程度遠(yuǎn)大于今天人們對(duì)人體克隆的關(guān)注。包括Cohen本人在內(nèi)的分子生物學(xué)家們都擔(dān)心，兩種不同生物的基因重組有可能為自然界創(chuàng)造出一個(gè)不可預(yù)知的危險(xiǎn)物種，致使人類遭受滅頂之災(zāi)。于是，1975年西歐幾個(gè)國(guó)家簽署公約，限制基因重組的實(shí)驗(yàn)規(guī)模。第二年美國(guó)政府也制訂了相應(yīng)的法規(guī)。至今世界上仍有少數(shù)國(guó)家堅(jiān)持對(duì)基因重組技術(shù)的應(yīng)用范圍進(jìn)行嚴(yán)格的限制。

然而，分子生物學(xué)家們畢竟不愿看到先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)葬送在自己手中。從1972年到1976年短短的四年里，人們對(duì)DNA重組所涉及的載體和受體系統(tǒng)進(jìn)行了有效的安全性改造，包括噬菌體DNA載體的有條件包裝以及受體細(xì)胞遺傳重組和感染寄生缺陷突變株的篩選，同時(shí)還建立了一套嚴(yán)格的DNA重組實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)與操作規(guī)范。眾多安全可靠的相關(guān)技術(shù)支撐以及巨大的潛在誘惑力，終于使DNA重組技術(shù)走出困境并迅速發(fā)展起來(lái)。2.基因工程的成熟早在基因工程發(fā)展的初期，人們就已開始探討將該技術(shù)應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)與人類健康水平密切相關(guān)的生物大分子，這些物質(zhì)在人體內(nèi)含量極小，但卻具有非常重要的生理功能。1977年，日本的Tfahura及其同事首次在大腸桿菌中克隆并表達(dá)了人的生長(zhǎng)激素釋放抑制素基因。幾個(gè)月后，美國(guó)的Ullvich隨即克隆表達(dá)了人的胰島素基因。1978年，美國(guó)Genentech公司開發(fā)出利用重組大腸桿菌合成人胰島素的先進(jìn)生產(chǎn)工藝，從而揭開了基因工程產(chǎn)業(yè)化的序幕。

這一時(shí)期主要基因工程產(chǎn)品的研制開發(fā)生產(chǎn)簡(jiǎn)況如下表。

產(chǎn)品首次克隆國(guó)家用途首次進(jìn)入國(guó)家表達(dá)時(shí)間市場(chǎng)時(shí)間

/地區(qū)人生長(zhǎng)激素釋放抑制素1977日本治療巨人癥人胰島素1978美國(guó)治療糖尿病1982歐洲人生長(zhǎng)激素1979美國(guó)治療侏儒癥，延防衰老1985美國(guó)人α-干擾素1980美國(guó)/瑞士治療病毒感染癥1985歐洲乙肝疫苗1983美國(guó)預(yù)防乙型肝炎1986歐洲人白細(xì)胞介素-21984日本治療腫瘤1989歐洲人促紅細(xì)胞生成素治療貧血1988歐洲人粒細(xì)胞集落刺激因子

治療中性白細(xì)胞減少癥1991美國(guó)人組織纖維溶酶原激活劑治療血栓癥1987美國(guó)

除此之外，最近10年來(lái)又有數(shù)以百計(jì)的新型基因工程藥物問(wèn)世，另有400余種藥物正處于研制開發(fā)中。DNA重組技術(shù)已逐漸取代經(jīng)典的微生物誘變育種程序，大大推進(jìn)了微生物種群的非自然有益進(jìn)化的進(jìn)程。

3.基因工程的騰飛

20世紀(jì)80年代以來(lái)，基因工程已開始朝著高等動(dòng)植物物種的遺傳特征改良以及人體基因治療等方向發(fā)展。1982年，美國(guó)科學(xué)家將大鼠的生長(zhǎng)激素基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，培育出具有大鼠雄健體魄的轉(zhuǎn)基因小鼠及其子代。1983年，攜帶有細(xì)菌新霉素抗性基因的重組Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞獲得成功，高等植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)問(wèn)世。1990年美國(guó)政府首次批準(zhǔn)一項(xiàng)人體基因治療臨床研究計(jì)劃，對(duì)一名因腺苷脫氨酶基因缺陷而患有重度聯(lián)合免疫缺陷癥的兒童進(jìn)行基因治療獲得成功，從而開創(chuàng)了分子醫(yī)學(xué)的新紀(jì)元。1990年，美國(guó)倡導(dǎo)在全球范圍內(nèi)實(shí)施雄心勃勃的人類基因組計(jì)劃，用15年時(shí)間斥資30億美元（測(cè)一個(gè)核苷酸一美元），完成人類24條染色體（22+x,y）基因的全部測(cè)序工作。1993年，美國(guó)HGP研究中心對(duì)HGP的內(nèi)容作了修訂。2000年公布了第一張基因組工作草圖。2001年公布人類基因組圖譜及初步分析結(jié)果整個(gè)計(jì)劃將在2003年完成。1997年，英國(guó)科學(xué)家利用體細(xì)胞克隆技術(shù)復(fù)制出“多利”綿羊，如果借助于某種限制巧妙地避開論理道德方面的社會(huì)學(xué)問(wèn)題，那么人類在實(shí)驗(yàn)室里復(fù)制自身的嘗試必將會(huì)產(chǎn)生無(wú)法估量的社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

近半個(gè)世紀(jì)的分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)研究結(jié)果表明，基因是控制一切生命運(yùn)動(dòng)的物質(zhì)形式?；蚬こ痰谋举|(zhì)是按照人們的設(shè)計(jì)藍(lán)圖，將生物體內(nèi)控制性狀的基因進(jìn)行優(yōu)化重組，并使其穩(wěn)定遺傳和表達(dá)。這一技術(shù)在超越生物王國(guó)種屬界限的同時(shí)，簡(jiǎn)化了生物物種的進(jìn)化程序，大大加快了生物物種的進(jìn)化速度，最終卓有成效地將人類生活品質(zhì)提高到一個(gè)嶄新的水平。因此，基因工程誕生的意義毫不遜色于有史以來(lái)的任何一次技術(shù)革命。

六、基因工程研究的意義

概括地講，基因工程研究與發(fā)展的意義體現(xiàn)在以下三個(gè)方面：第一，大規(guī)模生產(chǎn)生物分子。利用細(xì)菌（如大腸桿菌和酵母等）基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制相對(duì)簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)速度較快等特點(diǎn)，令其超量合成其他生物體內(nèi)含量極微但卻是較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的系列化物質(zhì)。第二，設(shè)計(jì)構(gòu)建新物種。借助于基因重組、基因定向誘變甚至基因人工合成技術(shù)，創(chuàng)造出自然界中不存在的生物新性狀乃至全新物種。第三，搜尋、分離和鑒定生物體尤其是人體內(nèi)的遺傳信息資源。目前，日趨成熟的DNA重組技術(shù)已能使人們獲得全部生物的