第一章 中藥化學(xué)-提取分離方法

§1-3第三節(jié)

提取分離方法

本節(jié)主要內(nèi)容一.中藥有效成分的提取二、中藥有效成分的分離與精制（一）根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離（二）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的分配系數(shù)不同進(jìn)行分離（三）色譜分離法

一、中藥有效成分的提取提取前的準(zhǔn)備

1、考查藥材的學(xué)名、產(chǎn)地、藥用部位、采集時(shí)間和方法2、查閱文獻(xiàn)——

利用前人的提取分離經(jīng)驗(yàn)3、未知成分——

化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試驗(yàn)中藥有效成分的提取方法

提取法

溶劑法——相似相溶原理（重點(diǎn)）水蒸氣蒸餾法——適于揮發(fā)性成分超臨界流體萃取法——適于多種物質(zhì)，尤其是低級性、揮發(fā)性成分。（一）溶劑法

1、溶劑類型水親水性溶劑—MeOHEtOHMe2CO中等極性溶劑——n-BuOHEtOAC親脂性溶劑——Et2OpetCHCL3C6H62提取范圍pet——油脂、蠟、葉綠素、游離甾體及三萜類CHCL3EtOAC——游離生物堿、有機(jī)酸、黃酮和香豆素苷元MeOHEtOHMe2CO——苷類、生物堿鹽、及鞣質(zhì)類水——氨基酸、糖類（黏液質(zhì)、果膠）無機(jī)鹽等3常用提取方法（1）浸漬法——適于對熱不穩(wěn)定成分（提取率不高）（2）滲濾法——優(yōu)于（1）法，但溶劑用量大（3）煎煮法——水提，不適于對熱不穩(wěn)定的成分及揮發(fā)油成分（4）回流提取法——適于用有機(jī)溶劑提（5）連續(xù)回流提取法——用索氏提取器提，溶劑用量少，提取率高（二）水蒸汽蒸餾法此法適于揮發(fā)性成分的提取。（三）超臨界流體萃取法（SFE）是一種集提取與分離于一體，又基本上不用有機(jī)溶劑的新技術(shù)。超臨界流體是一種處于臨界溫度和臨界壓力以上，介于氣體和液體之間的流體，具有很強(qiáng)的溶解能力，適于對很多物質(zhì)的提取。二、中藥有效成分的分離與精制

（一）根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離1、結(jié)晶、重結(jié)晶法原理——利用溫度不同引起溶解度的改變進(jìn)行分離（1）溶劑選擇

對純化成分——熱溶，冷不溶對雜質(zhì)——冷熱都不溶或冷熱都溶沸點(diǎn)不可太高，易于回收（n-BuOH不適合b.p太高）對純化成分不反應(yīng)（2）結(jié)晶純度的檢查

1、外觀：顏色、晶型2、mp檢查溶點(diǎn)、溶距3、TLC——三種不同溶劑系統(tǒng)均為一個(gè)斑點(diǎn)

4、HPLC——基線穩(wěn)定的單峰

（3）結(jié)晶制備

去雜制備過飽和溶液析晶操作關(guān)鍵：溶解趁熱抽濾沉淀（熱不溶型雜質(zhì)）濾液放冷析晶（冷熱都不溶雜質(zhì)）母液結(jié)晶2、沉淀法（溶劑沉淀）原理——改變混合溶劑極性使一部分成分沉淀分類

:1.水提醇沉法——去除多糖、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)2.醇提水沉法——除去樹脂、葉綠素等親脂性雜質(zhì)3.醇提醚（丙酮）沉淀法——可沉淀皂苷3、酸溶堿沉法堿溶酸沉法

酸溶堿沉法——提取生物堿堿溶酸沉法——提取酚酸性成分：黃酮、蒽醌等原理——離子態(tài)溶解，分子態(tài)難溶而沉淀析出4、金屬鹽沉淀法酸性物——可用Ca++Ba++Pb++等沉淀堿性物——苦味酸鹽沉淀雷氏銨鹽沉淀中性Pb(AC)2——可沉淀COOH，鄰二酚羥基Pb++↓堿性Pb(OH)AC——(除以上可沉淀外)

再加使單酚羥基或多元醇沉淀

（二）根據(jù)物質(zhì)在兩相溶劑中的

分配系數(shù)不同進(jìn)行分離

1）、液—液萃取與分配系數(shù)KD值原理——利用混合物中各成分在兩種互不相溶的溶劑中分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離的方法

Cu（有機(jī)溶劑）上相

KD

=CL(水層)下相例如：AB兩物質(zhì)

KA=10KB=0.1CHCL3/H2O上層（H2O）

下層

（CHCL3）

體積比：1：1萃取平衡后

KA=10＝

101KB=1＝

0.110此萃取率說明如下：

A大部分在上層

（90％）

僅10％在下層——氯仿層

B大部分在下層（90％在氯仿層）僅10％在上層——水層因此一次萃取可基本分離開2）、分離難易與分離因子

β

分離因子

β——

表示分離的難易程度定義——

被分離兩物質(zhì)在同一溶劑系統(tǒng)中分配系數(shù)的比值

β＝Ka/kb(Ka>Kb)β＝10：0.1＝100（一次萃取可完成）β＝10：1＝10（10～12次萃取可完成）β=10:5＝2（100次以上萃取可完成）β＝10：9.5≈1（無法分離）3）、分配比與pH

對酸堿兩性化合物的影響

（1）酸性物質(zhì)（分子態(tài)）HA+H2OA-

＋

H3O+

（離子態(tài)）∴完全解離時(shí)PH＝Pka+2

完全游離時(shí)PH=Pka–2所以

酸性物PH>Pka-2(加堿)

（分子態(tài)；離子態(tài)（鹽）游離態(tài)）PH<Pka+2(加酸)

同理：堿性物

PH<Pka+2(加酸)（分子態(tài)；離子態(tài)（鹽）游離態(tài)）PH>Pka-2(加堿)

酸性物為HA一般情況PH<3時(shí)堿性物為BH+

酸性物為A-

PH>12時(shí)堿性物為B（PH=Pka+PKb）

酸性物質(zhì)

Pka小酸性強(qiáng)Pka大酸性弱堿性物質(zhì)

Pka小堿性弱Pka大堿性強(qiáng)4）、萃取操作注意問題

必須是互不相容的兩相溶劑注意溫度濃度對KD值的影響注意事項(xiàng)防止乳化破乳方法抽濾，加熱，冷凍長時(shí)間放置加入破乳劑5）可進(jìn)行兩相溶劑萃取的組合水——石油醚水——苯水——乙醚水——己烷水——氯仿水——乙酸乙酯水——正丁醇不可進(jìn)行萃取的溶劑組合水——乙醇水——甲醇水——丙酮乙醇——氯仿甲醇——乙酸乙酯6）液滴逆流色譜(DCCC)及高速逆流色譜(HSCCC)

1．分離度大大提高（無載體）特點(diǎn)2．可克服固體載體的吸附消耗

3．不會使樣品形變污染和色譜峰畸形拖尾

分離對象—皂苷，生物堿，蛋白質(zhì)，糖類，酸性化合物等難分離的成分

液滴逆流分配法4、其他方法（1）分餾法——利用被分離物各成分沸點(diǎn)的不同進(jìn)行分離。（2）膜分離法——小分子可通過生物膜，大分子通不過，適于多糖、肽及蛋白質(zhì)大分子的精制。（3）升華法——適于有升華性的成分的分離。（三）色譜分離法1、定義——利用混合物中各成分對固定相和移動相的親和力的差異使之相互分離的方法，又稱層析法或色層法。這是一種物理化學(xué)分離、分析技術(shù)。2、作用——可用于混合物的分離，又可用于化合物的定性檢識和定量分析。《一》色譜法分類

【1】按分離原理分：

1、極性吸附色譜法

2、分配色譜法

3、聚酰胺色譜法

4、大孔樹脂色譜法

5、凝膠色譜法

6、離子交換樹脂色譜法

【2】按操作方法分1、柱層析——用于樣品分離、精制2、薄層層析（TLC）——定性、定量3、紙色譜（PC）——定性、定量【3】按兩相狀態(tài)分1、液－固色譜2、液－液色譜3、氣－固色譜4、氣－液色譜【一】吸附色譜

極性吸附劑—硅膠，氧化鋁1、分類非極性吸附劑—活性炭

2、吸附規(guī)律—總原則為相似者易于吸附極性吸附層析—極性強(qiáng)者易吸附非極性吸附層析—對非極性物質(zhì)吸附牢

極性層析法分離規(guī)律1）吸附規(guī)律——被分離物極性越強(qiáng)，吸附越牢，極性越弱，吸附越弱。2）分離規(guī)律:TLC:極性強(qiáng)的吸附牢，展開距離短，Rf值小極性弱的吸附弱，展開距離長，Rf值大柱層析:極性強(qiáng)的吸附牢，洗脫速度慢，后洗下極性弱的吸附弱，洗脫速度快，先洗下3、極性強(qiáng)弱的判斷（1）極性的概念—表示分子中電荷不對稱程度

分子偶極矩—越大者，極性越強(qiáng)相關(guān)因素分子極化度—越強(qiáng)者，極性越強(qiáng)介電常數(shù)ε—ε越大，極性越強(qiáng)

（2）常見有機(jī)官能團(tuán)極性順序:

-CH2-CH2-(R-)<-CH2=CH2<－OCH3

<-COOR<C=O(CHO)<-NH2<-OH<-COOH(3)常見有機(jī)溶劑極性順序與εpet<C6H6<Et2O<CHCl3<EtOAc<n-BuOH（ε=17.5)<Me2CO(ε=20.7）<EtOH<MeOH<H2O(4)比較原則

a）官能團(tuán)種類——母核相同按官能團(tuán)極性順序排列b）官能團(tuán)數(shù)目——極性官能團(tuán)多者，分子極性強(qiáng)

c）官能團(tuán)排列——易形成分子內(nèi)氫鍵者和有空間位阻者,極性官能團(tuán)的極性下降。d）母核不同，按C/O、N比值判斷，比值高者，極性小，比值小者，極性大。（經(jīng)驗(yàn)法）硅膠、氧化鋁與活性炭吸附規(guī)律的差異1、硅膠、氧化鋁對極性物質(zhì)吸附牢活性炭相反對非極性物質(zhì)吸附牢。（但對于芳香族吸附大于脂肪族）2、同系物：硅膠、氧化鋁——分子量小的吸附牢活性炭——分子量大的吸附牢3、溶劑介質(zhì)影響：硅膠、氧化鋁在水中活性下降活性炭在水中吸附性提高

GH

EF排列以上化合物的極性順序1、——A、B、C、D極性：A＞B＞C＞D2、——E、F、G、H極性：G＞H＞F＞E3、——A、B、C、D、E、F、G、H極性：G＞A＞H＞B＞F＞E＞C＞D排列以上化合物在硅膠G板的Rf

展開劑——pet：EtOAc（10：1）1、Rf：D＞C＞B＞A2、Rf：E＞F＞H＞G3、Rf：D＞C＞E＞F＞B＞H＞A＞G

RR’R’’

黃莢次苷ACHOHH

黃莢次苷BCH3HH

黃莢次苷CCH2OHHH

黃莢次苷DCOOHHH

黃莢苷ACHO（D－glc）2H

黃莢苷BCH3

（D－glc）H單乙酰黃莢次苷BCH3HCOCH3比較黃莢次苷——A、B、C、D的極性

A—CHO母核同B—CH3C—CH2OHD>C>A>BD—COOH

黃莢苷(A、B)多2個(gè)glc，極性>次苷（A，B，C，D）單乙酰黃莢苷B同次苷，但糖上－OHAC化，而極性下降。所以黃莢次苷>單乙酰黃莢苷B

氧化鋁，硅膠—分離極性小的親3．分離對象脂性成分。（應(yīng)用廣）活性炭—分離極性大的親水性成分

吸附柱層析法【二】液－液分配柱色譜法

(1)正相分配色譜—固定相極性>流動相分類反相分配色譜—固定相極性<流動相

正相分固定相（液）水配柱色流動相（液）水飽和有機(jī)溶劑譜支持劑－載體（2）常用載體－纖維素、硅藻土硅膠（含水>10％）（3）分離對象－親水性，或水溶性成分，如：苷類，糖類，生物堿類反相分配層析－分離親脂性成分硅膠表面－親油性表面（不同長度R取代）分離規(guī)律正相分配色譜：親脂性成分易溶于流動相，吸附弱，Rf值大（柱層析——先洗下）；親水性成分易溶于固定相，吸附牢，Rf值小（柱層析——后洗下）反相分配色譜：與以上結(jié)果相反【三】聚酰胺吸附色譜法

（1）吸附原理—形成分子間氫鍵

n

聚酰胺分離對象：（2）可形成氫鍵的官能團(tuán)：

Ar-OH，－NH2，－COOH，－C=O，－CHO,－NO2

（3）吸附規(guī)律：

[1]形成氫鍵基團(tuán)數(shù)目越多，則吸附能力越強(qiáng).[2]已形成分子內(nèi)氫鍵者吸附力減弱.[3]分子芳香化程度越高者，吸附越牢

[4]糖一般不參與吸附

[5]與溶劑介質(zhì)有關(guān).形成氫鍵能力水中最強(qiáng)堿中最弱

水→MeOH→Me2CO→NaOH/H2O→甲酰胺→二甲基甲酰胺→尿素/H2O溶劑洗脫順序：【四】大孔樹脂

色譜法吸附原理——范德華引力＋分子篩分離規(guī)律——被分離物的極性越大，其Rf值越大被分離物的極性越小，其Rf值越小

分離對象——苷、糖類(多糖)、黃酮、三萜等分離和收集

【五】凝膠色譜法1.原理——根據(jù)物質(zhì)分子大小差別進(jìn)行分離，利用分子篩原理進(jìn)行分離

(又名:分子篩過濾、排阻色譜)2、分離規(guī)律分子量大的先洗下、分子量小的后洗下

凝膠色譜示意圖【六】離子交換色譜法

1、分離對象——酸性、堿性化合物分離

2.分類陽離子交換樹脂－SO3H

陰離子交換樹脂—N＋(CH3)3

3、吸附規(guī)律——離子化程度高者吸附牢陽離子樹脂——堿性強(qiáng)者吸附牢陰離子樹脂——酸性強(qiáng)者吸附牢色譜分離法小結(jié)一、分類吸附層析——吸附能力不同1、按原理分分配層析——分離系數(shù)不同凝膠層析——分子大小不同離子交換層析——分子解離程度不同柱層析LSC2、按操作分薄層層析TLC

紙層析PC二、吸附規(guī)律

硅膠AL2O3——極性大著吸附牢

1、吸附層析活性炭——極性弱著吸附牢聚酰胺——易形成分子間氫鍵的吸附牢

正相親水性強(qiáng)著吸附牢Rf小2、分配層析層析親脂性強(qiáng)者吸附弱Rf大反相層析與上相反

陰離子交換樹脂——酸性越強(qiáng)吸附越強(qiáng)，反之吸附越弱

4、離子交換陽離子交換樹脂——堿性越強(qiáng)吸附層析越牢，反之吸附越弱3、凝膠層析——分子量小的吸附牢，分子量大的位阻小，吸附弱，分子量大的先洗下，分子量小的后下三、分離對象吸附層析——分離親脂性成分如：游離生物堿、甾類和三萜等。分配層析——分離極性大的成分如各類苷類聚酰胺層析——分離香豆素、黃酮、蒽醌類含酚羥基的成分離子交換樹脂——分離生物堿和酸性成分凝膠層析——分離分子量差別大的成分THEEND§1－4結(jié)構(gòu)研究法

一、結(jié)構(gòu)研究的主要程序：

1、確定化合物純度——mpTLCPCHPLC法

2、測定分子量——MS法：M＋

3、確定分子式元素分析法——定性、定量分析高分辨MS法（HR－MS）——分子量可精確到小數(shù)點(diǎn)后3位數(shù)

4、計(jì)算分子不飽和度Ω

Ω＝Ⅳ－I/2＋I(xiàn)II/2＋1

I→1價(jià)原子（H、D）的數(shù)目Ⅲ→3價(jià)原子（N、P等）的數(shù)目Ⅵ→4價(jià)原子（C、S）的數(shù)目（O、S為二價(jià)原子，與不飽和度無關(guān)，不考慮）二、光譜測定和解析（MS、IR、UV、NMR）

（一）、MS（質(zhì)譜）

1、MS圖譜的表示方法

m/z（碎片峰）——推測分子結(jié)構(gòu)2、作用

M＋（分子離子峰）——確定分子量3、分類

EI－MS（電子轟擊）——適于M＋穩(wěn)定的化合物

FD－MS（場解吸）——適于難揮發(fā)，對熱不穩(wěn)定化合物，如肽、糖、氨基酸等

FAB－MS（快速原子轟擊）——適于高分子、對熱不穩(wěn)定、和強(qiáng)極性化合物如：肽、糖、苷、抗生素、維生素等

CI－MS（化學(xué)電離）——可解析碎片峰少

ESI——（電噴霧電離），激光質(zhì)譜

（二）IR（紅外光譜）——鑒定分子各官能團(tuán)

1、IR光譜圖示：

分子價(jià)鍵V（伸縮）在4000～625cm－1

測得圖譜1、特征頻率區(qū)（4000～1500cm－1）《1》VO－H（3200～3700cm－1）

游離OH：

3700～3500cm－1

締合OH：3450～3200cm－1VN－H（3500～3300cm－1）（弱）《2》VC－H（3000～2700cm－1）

V－CH3：2960～2870cm－1VCHCH：3300cm－1《3》VCC

：2400～2100cm－1《4》VC＝O（1900～1650cm－1）

1705～1725cm－1

1740～1725cm－12、指紋區(qū)特征

δ1500～650cm－1

（因各分子指紋區(qū)不同，IR光譜可代表分子整體結(jié)構(gòu)）《1》VC＝CH

RCH＝CH2990910強(qiáng)

RCH＝CHR（順）690中強(qiáng)

RCH＝CHR（反）970中強(qiáng)

RC＝CH2（末端）870中強(qiáng)

《2》VPh-H

單取代（5鄰氫）

700770強(qiáng)鄰位取代（4鄰氫）

700～735強(qiáng)間位取代（3鄰氫）

810～750