實(shí)驗(yàn)一-堿裂解法提取質(zhì)粒DNA

實(shí)驗(yàn)一、堿裂解法提取質(zhì)粒DNA及檢測(cè)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理簡(jiǎn)介實(shí)驗(yàn)背景：質(zhì)粒DNA的提取是基因工程操作中常用的基本技術(shù)。質(zhì)粒作為載體應(yīng)具備下列四個(gè)特點(diǎn)：有足夠的容納目的基因的幅度,并且對(duì)于攜帶的目的基因能夠借助載體的復(fù)制和調(diào)控系統(tǒng)得到忠實(shí)的復(fù)制與增殖。在非必要的DNA克隆區(qū)有多種限制性核酸內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，易于基因片段與載體的連接、重組與篩選。與宿主細(xì)胞有相同一個(gè)或多個(gè)遺傳表型（如抗藥性、營(yíng)養(yǎng)缺陷型或顯色表型反應(yīng)等）.拷貝數(shù)多，易于宿主細(xì)胞的DNA分開(kāi)，便于分離提純。分離質(zhì)粒DNA的方法包括三個(gè)基本步驟:培養(yǎng)細(xì)胞使質(zhì)粒擴(kuò)增；收集和裂解細(xì)菌；分離和純化質(zhì)粒DNA。實(shí)驗(yàn)原理：堿裂解法質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的的。在強(qiáng)堿性pH時(shí)，染色體線性DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，調(diào)節(jié)pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)到原來(lái)的構(gòu)型,而染色體DNA不能復(fù)性糾纏形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，經(jīng)過(guò)離心,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一直沉淀下來(lái)而被除去。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模禾崛』蚬こ讨羞\(yùn)載基因的載體，掌握最常用的提取質(zhì)粒DNA的方法。二．實(shí)驗(yàn)試劑SolI100ml:lMTris-HCL（pH8。0）2.5ml,0.5MEDTA2ml，DDW91ml，20%葡萄糖4。5ml（葡萄糖單獨(dú)滅，滅完后加入SolI中），高壓滅菌，4°保存。2,SolII100ml：（新鮮配制，常溫使用）10%SDS50ml，2MNaOH50ml。使用前將兩種溶液混合。3，Sollll500ml：KAc147g，HAc57。5ml，加300mlDDW攪拌，定容至500ml。高壓滅菌，4°保存。4，70%乙醇無(wú)菌水DDW5，苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）氯仿可使蛋白變性并有助于液相與有機(jī)相的分開(kāi)，異戊醇則可起消除抽提過(guò)程中出現(xiàn)的泡沫.酚和氯仿均有很強(qiáng)的腐蝕性，操作時(shí)應(yīng)戴手套.三、實(shí)驗(yàn)步驟按1/100的比例接種保存的9K質(zhì)粒大腸桿菌克隆菌種到3mL的含有適當(dāng)抗生素LB培養(yǎng)基，37°C、180rpm培養(yǎng)過(guò)夜或培養(yǎng)12小時(shí)以上，活化菌種（至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。將活化的菌種按1/100接種至200ml的LB培養(yǎng)基，37C、250rpm劇烈震蕩培養(yǎng)過(guò)夜。1、離心管（10mL）分裝菌10ml，離心去上清（10000rpm，5min，4C）；棄上清,將離心管倒置于衛(wèi)生紙上幾分鐘，使液體盡可能流盡.2、重懸于800M冰冷的SolI中；劇烈震蕩重懸菌體。3、加入1.6mLSolII輕輕顛倒數(shù)次（動(dòng)作要輕柔，防止斷裂DNA形成碎片），徹底混勻，室溫放置lOmin（SolII為裂解液，故離心管中菌液逐漸變清）。4、加入1.2mL冰冷的SolIII立即輕輕顛倒完全徹底混勻，冰上放置lOmin。5、4°C,12000rpm離心lOmin。SolIII為中和溶液，此時(shí)質(zhì)粒DNA復(fù)性，染色體和蛋白質(zhì)不可逆變性，形成不可溶復(fù)合物，同時(shí)K+使SDS-蛋白復(fù)合物沉淀。6、收集上清至新的離心管，加入等體積的酚/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，沉淀核酸，室溫放置大于lOmin。12000rpm離心5min，小心移出上清于一新離心管中。7、加入2倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，混勻，室溫放置2-5min，離心12000rmpX10min.8、棄上清，將管口敞開(kāi)倒置于衛(wèi)生紙上使所有液體流出，加入lml70%乙醇洗沉淀一次，12000rmp離心5min。9、吸除上清液，將管倒置于衛(wèi)生紙上使液體流盡，室溫干燥。10、將沉淀溶于50口lDDW中，儲(chǔ)于-20C冰箱中.思考題：1、加入酚/氯仿/異戊醇的作用？2、沉淀DNA時(shí)為什么用無(wú)水乙醇？A組（請(qǐng)大家詳細(xì)討論自己組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果）maker123456p