細(xì)胞培養(yǎng)培訓(xùn)

細(xì)胞培育培訓(xùn)2021-6-12.常用設(shè)備

液氮罐、儲(chǔ)品柜〔存放雜物〕、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱〔-80℃〕、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺(tái)〔書寫實(shí)驗(yàn)記錄〕。離心機(jī)〔搜集細(xì)胞〕、超凈任務(wù)臺(tái)、倒置顯微鏡、CO2孵箱、水浴鍋、4℃冰箱.無(wú)菌室的滅菌

1.定期清掃無(wú)菌室：每周清掃一次，先用自來(lái)水拖地、擦桌子、超凈任務(wù)臺(tái)等，然后用3‰來(lái)蘇水或者新潔爾滅或者0.5％過(guò)氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱〔培育箱〕滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％過(guò)氧乙酸，再用紫外燈照射.無(wú)菌室的滅菌

3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：翻開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75％酒精〔3‰新潔爾滅〕擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。.實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌預(yù)備1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩。3.用75％酒精棉球擦凈雙手。.無(wú)菌操作的演示1.凡是帶入超凈任務(wù)臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培育基的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外外表2.接近酒精燈火焰操作。3.器皿運(yùn)用前必需過(guò)火滅菌.無(wú)菌操作的演示4.繼續(xù)運(yùn)用的器皿〔如瓶蓋、滴管〕要放在高處，運(yùn)用時(shí)仍要過(guò)火。5.各種操作要接近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.汲取兩種以上的運(yùn)用液時(shí)要留意改換吸管，防止交叉污染。.細(xì)胞培育用液的配制與消毒

細(xì)胞培育用水必需非常純真，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需求用新穎的雙蒸水、三蒸水或純真水.青、鏈霉素溶液的配制與消毒

1.

所用純真水〔雙蒸水〕需求15磅高壓20分鐘滅菌。2.詳細(xì)操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。3.運(yùn)用時(shí)溶入培育液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克？.RPMI1640的制備與消毒1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培育基粉劑參與培育液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并參與培育基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙?并按照包裝闡明添加一定的藥品.然后用注射器向培育基中參與配制好的青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000ml，搖勻。.RPMI1640的制備與消毒2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架銜接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。3.抽濾：配制好的培育液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈任務(wù)臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。4.分裝：將過(guò)濾好的培育液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。5.運(yùn)用前要向100ml培育液中參與1ml谷氨酰胺溶液〔4℃時(shí)兩周有效〕。.血清的滅活

細(xì)胞培育常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過(guò)過(guò)濾方可參與培育基中運(yùn)用。.谷氨酰胺合成培育基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需求谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培育液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保管，用前參與培育液。加有谷氨酰胺的培育液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新參與原來(lái)的谷氨酰胺。.谷氨酰胺普通培育液中谷氨酰胺的含量為1～4mol/L?？梢耘渲?00mol/L谷氨酰胺液儲(chǔ)存，用時(shí)參與培育液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，過(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保管，運(yùn)用時(shí)可向100ml培育液中參與1ml谷氨酰胺溶液。.細(xì)胞傳代培育〔消化法〕一.

傳代前預(yù)備：1.預(yù)熱培育用液：把曾經(jīng)配制好的裝有培育液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。2.用75％酒精擦拭經(jīng)過(guò)紫外線照射的超凈任務(wù)臺(tái)和雙手。3.正確擺放運(yùn)用的器械：保證足夠的操作空間，不僅便于操作而且可減少污染。4.點(diǎn)燃酒精燈：留意火焰不能太小。.細(xì)胞傳代培育〔消化法〕

5.預(yù)備好將要運(yùn)用的消毒后的空培育瓶，放入微波爐內(nèi)高火，8分鐘再次消毒。6.取出預(yù)熱好的培育用液：取出曾經(jīng)預(yù)熱好的培育用液，用酒精棉球擦拭好后方能放入超凈臺(tái)內(nèi)。

7.從培育箱內(nèi)取出細(xì)胞：留意取出細(xì)胞時(shí)要旋緊瓶蓋，用酒精棉球擦拭顯微鏡的臺(tái)面，再在鏡下察看細(xì)胞。

8.翻開瓶口：將各瓶口一一翻開，同時(shí)要在酒精燈上燒口消毒。.細(xì)胞傳代培育〔消化法〕吹打分散細(xì)胞1.吹打制懸：用滴管將曾經(jīng)消化細(xì)胞吹打成細(xì)胞懸液。2.吸細(xì)胞懸液入離心管：將細(xì)胞懸液吸入10ml離心管中。3.平衡離心：平衡后將離心管放入臺(tái)式離心機(jī)中，以1000轉(zhuǎn)/分鐘離心6-8分鐘。4.棄上清液，參與新培育液：棄去上清液，參與2ml培育液，用滴管悄然吹打細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。.細(xì)胞傳代培育〔消化法〕繼續(xù)培育：

用酒精棉球擦拭培育瓶，適當(dāng)旋松瓶蓋，放入CO2培育箱中繼續(xù)培育。傳代細(xì)胞2小時(shí)后開場(chǎng)貼附在瓶壁上。當(dāng)生長(zhǎng)細(xì)胞鋪展面積占培育瓶底面積25％時(shí)為一個(gè)＋，占50％為＋＋，占75％時(shí)為＋＋＋。.細(xì)胞傳代培育〔消化法〕傳代細(xì)胞培育本卷須知：

1.嚴(yán)厲的無(wú)菌操作

2.適度消化：消化的時(shí)間受消化液的種類、配制時(shí)間、參與培育瓶中的量等諸多要素的影響，消化過(guò)程中應(yīng)該留意培育細(xì)胞形狀的變化，一旦胞質(zhì)回縮，銜接變松散，或有成片浮起的跡象就要立刻終止消化。.細(xì)胞的復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇的原那么－快速融化：必需將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化至37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，防止冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞構(gòu)成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞呵斥損害。.細(xì)胞的復(fù)蘇一.

實(shí)驗(yàn)前預(yù)備：1.將水浴鍋預(yù)熱至37℃2.用75％酒精擦拭紫外線照射30min的超凈任務(wù)臺(tái)臺(tái)面。

3.在超凈任務(wù)臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、吸管、培育瓶等等。

.細(xì)胞的復(fù)蘇二．取出凍存管：

1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。

2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。.細(xì)胞的復(fù)蘇三．迅速解凍：

1.迅速將凍存管投入到曾經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。

2.約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁，再拿入超凈臺(tái)內(nèi)。四.平衡離心：

用架盤天平平衡后，放入離心機(jī)中3000r/min離心3min.細(xì)胞的復(fù)蘇五.制備細(xì)胞懸液：

1.吸棄上清液。

2.向離心管內(nèi)參與10ml培育液，吹打制成細(xì)胞懸液。六.培育細(xì)胞

將復(fù)合細(xì)胞計(jì)數(shù)要求的細(xì)胞懸液分裝入培育瓶?jī)?nèi)，將培育瓶放入37℃和5％CO2的培育箱內(nèi)2-4小時(shí)〔或者24-48小時(shí)〕后換液繼續(xù)培育培育，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。.初學(xué)者易犯錯(cuò)誤

1水浴鍋未預(yù)熱或者未預(yù)熱到37℃。2.水浴鍋內(nèi)凍存管太多，導(dǎo)致傳熱不佳，使融化時(shí)間延伸。3.離心前忘記平衡，導(dǎo)致離心機(jī)損壞和細(xì)胞喪失。4.一次復(fù)蘇細(xì)胞過(guò)多，忘記改換吸頭和吸管，導(dǎo)致細(xì)胞交叉污染。.細(xì)胞的凍存1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。3.置于-80超低溫冰箱中放置過(guò)夜。4.置于液氮罐中長(zhǎng)期保管。5同時(shí)做好凍存記錄，在本人的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。.細(xì)胞的凍存本卷須知：1.運(yùn)用DMSO前，不需求進(jìn)