蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)總論

蛋白質(zhì)分離純化2009-3-28蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團，在一定pH的溶液中都可解離成帶負電荷或正電荷的基團。蛋白質(zhì)的等電點(isoelectricpoint,pI)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時，蛋白質(zhì)解離成正、負離子的趨勢相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點。蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量范圍可達1萬至100萬之間，其分子的直徑在1~100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。

蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素顆粒表面電荷（雙電層）水化膜蛋白質(zhì)分離純化的一般原則總目標(biāo)：增加蛋白制品的純度或比活1.前處理(pretreatment)：因動/植物/細菌而異2.粗分級分離(roughfractionation)：采用鹽析/等電點沉淀/有機溶劑分級分離等方法3.細分級分離(finefrationation)：采用凝膠過濾、離子交換層析、吸附層析以及親和層析等4.結(jié)晶：分離純化的最后步驟蛋白質(zhì)的分離純化方法根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差異分離—透析和超濾根據(jù)蛋白質(zhì)的溶解度差異分離—沉淀、鹽析等根據(jù)蛋白質(zhì)的電荷差異分離—電泳、離子交換等根據(jù)蛋白質(zhì)與某些物質(zhì)的吸附差異—吸附分離利用生物分子專一性結(jié)合的特性—親和層析透析（dialysis）原理：利用蛋白質(zhì)分子不能通過半透而將其與小分子物質(zhì)分開常用的半透膜為玻璃紙或纖維素材料按照分子大小進行分離，分離取決于透析袋截留的分子量。透析——只用來除鹽類和小分子雜質(zhì)超過濾（ultrafiltration）加壓蛋白質(zhì)溶液半透膜支持膜的柵板超濾液原理:是利用壓力或離心力，強行使水和其他小分子溶質(zhì)通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在半透膜上，以達到濃縮和脫鹽的目的鹽析(saltprecipitation)原理：將硫酸銨、硫酸鈉或氯化鈉等加入蛋白質(zhì)溶液，使蛋白質(zhì)表面電荷被中和以及水化膜被破壞，導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀。

蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀鹽析－(NH4)2SO4分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中鹽溶等電點沉淀和pH控制

不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，利用蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低的原理，可以把蛋白質(zhì)混合物分開。這樣沉淀出的蛋白質(zhì)保持著天然構(gòu)象，能重新溶解于適當(dāng)?shù)膒H和一定濃度的鹽溶液中。

有機溶劑分級分離丙酮、甲醇、乙醇等沉淀:

能使蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度將低。低溫（零下40-60度）進行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。溫度對蛋白質(zhì)溶解度的影響

在一定溫度范圍內(nèi)，約0~40℃之間，大部分球狀蛋白質(zhì)的溶解度隨溫度升高而增加，但也有例外，如人的血紅蛋白從0~25℃，溶解度隨溫度上升而將低。在40~50℃以上，大部分蛋白質(zhì)變得不穩(wěn)定并開始變性，一般在中性pH介質(zhì)中即失去溶解力。

大多數(shù)蛋白質(zhì)在低溫下比較穩(wěn)定，因此蛋白質(zhì)的分級分離操作一般都在0℃或更低的溫度下進行。

層析也稱色譜，基本原理是待分離蛋白質(zhì)溶液在流動相的帶動下經(jīng)過一個固態(tài)物質(zhì)（固定相）時，根據(jù)溶液中待分離的蛋白質(zhì)顆粒大小、電荷多少及親和力等，使待分離的蛋白質(zhì)組分在兩相中反復(fù)分配，并以不同速度流經(jīng)固定相而達到分離蛋白質(zhì)的目的。層析因固相介質(zhì)不同又分為離子交換層析、凝膠層析和吸附層析等。層析(chromatography)技術(shù)層析的主要設(shè)備常見色譜柱自動分步收集器

將作為固相成分的不溶性基質(zhì)，例如葡聚糖凝膠、纖維素、樹脂等填充到柱子中，用平衡液平衡。然后加樣品，再用適當(dāng)?shù)娜軇┫疵?。樣品中各種成分通過柱子取決于與固相成分的相互作用，最后以不同速率被洗脫出來，達到將各個成分分離的目的。

凝膠層析亦稱凝膠過濾、排阻色譜或分子篩層析等。其機理是分子篩效應(yīng)，主要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的大小進行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質(zhì)，凝膠顆粒在合適的溶劑中浸泡，充分吸脹后裝入色譜柱內(nèi)，加入欲分離的混合物后，再以同一溶劑洗脫。因此，混合樣品如同“過篩”一樣，因分子大小的不同得以彼此分開。凝膠（gelchromatography

）層析?單個凝膠珠本身象“篩子”。不同類型凝膠的篩孔的大小不同。?分子量大的物質(zhì)不能進入凝膠粒子內(nèi)部，隨洗脫液從凝膠粒子之間的空隙擠落下來，所以大分子物質(zhì)遷移速度快；?小分子物質(zhì)要通過凝膠網(wǎng)孔進入凝膠粒子內(nèi)部，所以小分子物質(zhì)遷移速度慢。凝膠過濾層析過程示意圖凝膠過濾層析過程示意圖優(yōu)點

1.凝膠是一種不帶電荷的惰性載體。其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，所以凝膠本身不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。

2.凝膠層析的操作條件較溫和，不易引起生物物質(zhì)的變性，即使用來分離一些理化性質(zhì)不穩(wěn)定的物質(zhì)也很少被破壞。

3.樣品得率高，重復(fù)性好。如果按比例擴大柱的體積和高度，可進行大量樣品的分離純化。缺點1.要求樣品和洗脫液的粘度很低。2.凝膠顆粒網(wǎng)絡(luò)孔徑大小非常有限，所以可被純化的物質(zhì)的分子量范圍受到限制。3.凝膠結(jié)構(gòu)對某些溶質(zhì)分子具有吸附作用，如芳香族化合物與脂蛋白等。凝膠的結(jié)構(gòu)與性能凝膠也稱分子篩，是具有三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，有天然的，也可人工合成。根據(jù)網(wǎng)孔不同可制成不同規(guī)格。常用分子篩：1、葡聚糖凝膠（Sephadex）型號：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15

分離大蛋白質(zhì)小蛋白質(zhì)除鹽

2、瓊脂糖凝膠（瑞典Sepharose、美國Bio-GelA）孔徑大，用于分離大分子物質(zhì)

3、聚丙烯酰胺凝膠（Bio-GelP）結(jié)構(gòu)：葡聚糖用交聯(lián)劑1-氯-2,3-環(huán)丙烷使葡聚糖之間通過醚鍵(C-O-CH2-CH-CH2-O-)交聯(lián)聚合而成的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。OH葡聚糖凝膠（商品名為Sephadex）Sephadex的三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的網(wǎng)孔大小取決于交聯(lián)度，交聯(lián)度的大小可在合成Sephadex時控制加入交聯(lián)劑的百分比決定。交聯(lián)劑的百分比高，交聯(lián)度大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)愈緊密，孔隙愈小，吸水后膨脹也愈小，機械強度高，分離物質(zhì)的分子量也小。反之,交聯(lián)劑的百分比低，分離物質(zhì)的分子量大。G類Sephadex的型號表示每克干凝膠吸水量，如G-50表示每克干凝膠吸水量為5ml。Sephadex的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，不溶于水、鹽、弱酸和堿，耐熱耐堿不耐酸。葡聚糖凝膠特點

它是一種大孔凝膠，其工作范圍的下限幾乎是Sephadex的上限，可分離MW40萬以上的物質(zhì)，因此可用來分離核酸及病毒。

瓊脂糖凝膠不帶電荷，不受微生物作用而降解，但對熱不穩(wěn)定，易受pH影響(只在pH4.5-9.0范圍內(nèi)穩(wěn)定。瓊脂糖凝膠（商品名為Sepharose)

使用范圍及效果同葡聚糖凝膠相似，但化學(xué)性質(zhì)較葡聚糖穩(wěn)定，可在pH2-11范圍內(nèi)使用.聚丙烯酰胺凝膠的商品為生物膠-P（Bio-GelP），由美國Bio-Rod廠生產(chǎn)，型號很多，從P-2至P-300共10種，P后面的數(shù)字再乘1000就相當(dāng)于該凝膠的排阻限度。

聚丙烯酰胺凝膠

選擇何種凝膠以及它的型號，這需要根據(jù)實驗條件，溶質(zhì)的分子量大小和分離工作的目的而定，每種型號凝膠都有一定分離溶質(zhì)分子量的范圍，選擇的型號凝膠要能滿足實驗要求。凝膠的選擇凝膠的排阻極限排阻極限是指不能進入凝膠顆?？籽▋?nèi)部的最小分子的分子量。所有大于排阻極限的分子都不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，直接從凝膠顆粒外流出，所以它們同時被最先洗脫出來。排阻極限代表一種凝膠能有效分離的最大分子量，大于這種凝膠的排阻極限的分子用這種凝膠不能得到有效分離。例如SephadexG-50的排阻極限為30,000，它表示分子量大于30,000的分子都將直接從凝膠顆粒之外被洗脫出來。2003年中科院考研題今有a、b、c、d四種蛋白質(zhì)，其分子體積由大到小的順序是a>b>c>d，在凝膠過濾柱層析中，最先洗脫出來的蛋白質(zhì)一般應(yīng)該是（）A、aB、bC、cD、d2000年中科院考研題

2003年上海師范大學(xué)考研題指出從分子排阻層析柱上洗脫下來下列蛋白質(zhì)時的洗脫順序，為什么？分離蛋白質(zhì)的范圍是5,000-400,000。肌紅蛋白（馬心?。?6900過氧化氫酶（馬肝）247500細胞色素c（牛心?。?3370肌球蛋白（鱈魚?。?24800糜蛋白酶原（牛胰）23240血清清蛋白（人）68500如果被分離的蛋白質(zhì)樣品中各個成分受溶液pH的影響，或帶正電荷或帶負電荷，因此可利用離子交換層析法進行分離。離子交換層析的固相是離子交換體，包括離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換葡聚糖。帶有SO3－或COO－基團，通常以SO3－Na＋或COO－H＋形式出現(xiàn)的叫做陽離子交換基；

帶有N＋(C2H5)基團通常以N＋(C2H5)Cl－出現(xiàn)的叫做陰離子交換基。離子交換層析(ionexchangechromatography)陽離子交換基強酸性，聚苯乙烯樹脂弱酸性，羧甲基纖維素弱酸性，螯合作用，聚苯乙烯樹脂陰離子交換基強堿性，聚苯乙烯樹脂弱堿性，二乙氨氨乙基纖維素陽離子交換層析過程離子交換樹脂蛋白質(zhì)高離子強度洗脫液洗高離子強度洗脫液洗加樣平衡液洗收集1998年上海交大考研題有一蛋白水解物，在pH6時，用陽離子交換柱層析，第一個被洗脫出來的氨基酸是：Val(pI=5.96),Lys(pI=9.74)Asp(pI=2.77),Arg(pI=10.76)Tyr(pI=5.66)是一種吸附層析，依賴于蛋白質(zhì)和它的配體（ligand）之間的相互作用來分離的。配體通常指的是能與另一個分子或原子結(jié)合（一般是非共價結(jié)合）的分子、基團、離子、或原子。但在親和層析中，配體是通過共價鍵先與基質(zhì)結(jié)合，配體可以是酶結(jié)合的一個反應(yīng)物或產(chǎn)物，或是一種可以識別靶蛋白的抗體。親和層析(Affinitychromatography)

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物通過裝有連接了配體的基質(zhì)的親和層析柱時，只有靶蛋白可以特異地與基質(zhì)結(jié)合，而其它沒有結(jié)合的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。特異結(jié)合在基質(zhì)上的靶蛋白最后可以用含有高濃度自由配體的溶劑洗下。所以有時只用親和層析就可使蛋白質(zhì)的純化提高1000至10000倍。原理親和層析過程吸附本質(zhì)：非共價連接常用吸附劑：結(jié)晶磷酸鈣、硅膠等脫附（洗脫）方式：1、改變蛋白質(zhì)帶電狀態(tài)；2、改變環(huán)境溶液的pH、離子強度等。含配體溶液收集目的蛋白洗下未結(jié)合的蛋白混合蛋白樣品平衡液帶有配體的樹脂珠（或膠粒）優(yōu)點

親和層析純化過程簡單、迅速，且分離效率高。對分離含量極少又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)尤為有效。但本法必須針對某一分離對象，制備專一的配基和尋求層析的穩(wěn)定條件，因此親和層析的應(yīng)用范圍受到了一定的限制。分配層析柱層析紙層析薄層層析氣相色譜(gaschromatograph,GC)是利用樣品中個組分在色譜柱中的氣相和固定相間的分配系數(shù)不同達到分離的目的。當(dāng)汽化后的樣品被載氣帶入色譜柱中運行時，組分就在其中的兩相間進行反復(fù)多次的分配（吸附－脫附－放出）由于固定相對各種組分的吸附能力不同，各組份在色譜柱中的運行速度就不同，經(jīng)過一定的柱長后，便彼此分離，按順序離開色譜柱進入檢測器，產(chǎn)生的離子流信號經(jīng)放大后，在記錄器上描繪出各組分的色譜峰。氣相色譜分類GC根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法(GSC)和氣液色譜法(GLC)，其中以GLC應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。當(dāng)層析系統(tǒng)的流動相為氣體如氫、氦、氮，固相為涂漬在固體顆粒表面的液體時，此層析技術(shù)稱為氣液層析或氣液色譜氣相色譜法的特點應(yīng)用范圍廣：氣象色譜法可以分析氣體和易揮發(fā)的物質(zhì)高效：可以分析沸點十分相近的組分，和極為復(fù)雜的多組份混合物。例如，用毛細管，可以分析輕油中150個組份。高選擇性：是指固定相對性質(zhì)極為相似的組份，如同位素，烴類的異構(gòu)體等有較強的分離能力。主要通過選用高選擇性的固定液。高靈敏度：指用高靈敏度的檢測器可檢測出10-11－10-13克的物質(zhì)。因此可用于痕量分析。高速：一般分析一次用幾分鐘到十幾分鐘。某些快速分析中，一秒鐘可以分析若干份。色譜法易于自動化．操作與處理都自動化，速度很快。液相色譜(liquidchromatograph,LC)LC同樣可分為液固色譜法(LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法(SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動相（常用CO2），因其擴散系數(shù)大，能很快達到平衡，故分析時間短，特別適用于手性化合物的拆分。高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)也稱高壓液相層析（highpressureliquidchromatography）。這是近二十年內(nèi)發(fā)展起來的一項快速、靈敏、高效的分離技術(shù)。它是在經(jīng)典液相層析法基礎(chǔ)上，引進了氣相層析的理論，利用高壓輸送流動相，擁有高效固定相及高靈敏度檢測器，具有氣相層析的全部優(yōu)點。原理

混合物中各組分在固定相和流動相之間會發(fā)生吸附、溶解或其他親和作用，這種作用存在差異，從而使各組分在色譜柱中的遷移速度不同得到分離高效液相色譜的主要類型

按分離機制的不同分為四類：液液分配色譜法（partitionchromatography）液固吸附色譜法（adsorptionchromatography）離子交換色譜法（IEC）空間排阻色譜法（SEC）液固吸附色譜法固定相：吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5-10μm流動相：有機溶劑適用于分離分子量200-1000的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物的分離，常用于分離同分異構(gòu)體。各組分的出峰順序極性較小組分，吸附力較弱，容易解吸，先流出。極性較大組分滯留作用大，后流出。

飽和烴<烯<芳烴<醚<醛酮<酸液固吸附色譜分離機理分離過程是一個吸附——脫附的平衡過程。固定相將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的有機鍵合層，如C18（十八烷基硅烷）、C8（辛烷基）、氨基鍵合硅膠——常用固定相類型極性固定相：正相色譜非極性固定相：反相色譜液液分配色譜正相色譜法反相色譜法1.極性固定相

聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相2.相對非極性流動相

正已烷、環(huán)已烷3.極性調(diào)節(jié)劑

乙醇、四氫呋喃、三氯甲烷4.分離中等極性和極性較強化合物.

酚類、胺類、羰基類及氨基酸類

5.組分流出順序

極性小先洗出1.非極性固定相

C18（簡稱ODS）、C8

2.極性流動相

水或緩沖液3.極性調(diào)節(jié)劑

甲醇、乙腈、四氫呋喃4.分離非極性和極性較弱化合物

占整個HPLC應(yīng)用的80%左右

5.組分流出順序

極性大先洗出

液液分配色譜離子交換色譜法固定相：離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基構(gòu)成陽離子交換樹脂在表面未端芳環(huán)上接上季胺基構(gòu)成陰離子交換樹脂流動相：電解質(zhì)溶液、有機弱酸或有機弱酸鹽溶液分離原理樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換而分離。應(yīng)用離子交換色譜法主要用于分析陰，陽離子，凡是在溶劑中能夠電離的物質(zhì)通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。分析物質(zhì)

有機酸、氨基酸、多肽及核酸。離子交換色譜法分離機理以凝膠(gel)為固定相。它類似于分子篩，但凝膠的孔徑比分子篩要大得多。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。常用于分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質(zhì)、核酸等。凝膠色譜：（分子排阻色譜法）凝膠色譜分離機理HPLC的特點具有氣相層析的全部優(yōu)點。由于HPLC分離能力強，測定靈敏度高，選擇性高，分析速度快，可在室溫下進行，故應(yīng)用范圍極廣，無論是極性還是非極性，小分子還是大分子，熱穩(wěn)定還是不穩(wěn)定的化合物均可用此法測定。對蛋白質(zhì)、核酸、氨基酸、生物堿、類固醇和類脂等尤為有利。電泳蛋白質(zhì)在高于或低于其pI的溶液中為帶電的顆粒，在電場中能向正極或負極移動。這種通過蛋白質(zhì)在電場中泳動而達到分離各種蛋白質(zhì)的技術(shù),稱為電泳(electrophoresis)。pH>pI蛋白質(zhì)帶負電荷，電泳中向正極移動pH<pI蛋白質(zhì)帶正電荷，電泳中向負極移動pH=pI蛋白質(zhì)凈電荷為零，電泳中不動聚丙烯酰胺凝膠電泳

支持物:單體丙稀酰胺(Acr)交聯(lián)劑:甲叉(or亞甲)雙丙稀酰胺(Bis)聚合1、光聚合:核黃素為催化劑(陽光,日光)制大孔膠2、化學(xué)聚合:

過硫酸銨(NH4)2S2O3，縮寫為APS為催化劑N,N,N’,N’,--四甲基乙二胺縮寫為TEMED是加速劑用來制小孔膠聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠網(wǎng)孔大?。?/p>

聚合鏈長度:由Acr濃度決定交聯(lián)程度:由Acr與Bis相對比例決定Bis的濃度低，孔徑大，可在聚合前調(diào)節(jié)單體與Bis的濃度比如:AcrBisT(%)小孔28.0g0.735g7%大孔10.0g2.5g2.5%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis，SDS）：常用于蛋白質(zhì)分子量的測定。SDS（十二烷基磺酸鈉）SDS（十二烷基磺酸鈉）是一種陰離子型表面活性劑，它能夠與蛋白質(zhì)多肽鏈中的氨基酸殘基按大約1

1.4比例結(jié)合。每一個蛋白質(zhì)分子都因為結(jié)合了許多的SDS而帶有大量的負電荷，而蛋白質(zhì)分子原有的電荷則可以忽略。該法主要利用了蛋白質(zhì)分子量大小不同而分離蛋白質(zhì)。用已知分子量的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)，則可以估算出不同蛋白質(zhì)的分子量。作業(yè)：1997年清華大學(xué)考研題有兩個純的蛋白質(zhì)a和b，相對分子質(zhì)量都是100000的近似球形的蛋白質(zhì)。其中，蛋白質(zhì)a：由2個相對分子質(zhì)量為40000的亞基和2個相對分子質(zhì)量為10000的亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點pI=6.0。蛋白質(zhì)b：由相對分子質(zhì)量為25000的單一亞基組成的四聚體，該蛋白質(zhì)的等電點也是pI=6.0。試預(yù)測這兩種蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)和SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳系統(tǒng)中的電泳結(jié)果。等電聚焦電泳（isoelectricfocusingelectrophoresis,IEFE）

利用具有pH梯度的支持介質(zhì)分離等點電不同的蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。pH梯度是以兩性電解質(zhì)在外電場作用下自然形成。原理等電聚焦就是在電泳介質(zhì)中放入載體兩性電解質(zhì)，當(dāng)通以直流電時，兩性電解質(zhì)即形成一個由陽極到陰極逐步增加的pH梯度，在此體系中，不同的蛋白質(zhì)即移動到或聚焦于其相當(dāng)?shù)牡入婞c位置上，也就是說被聚焦于一個狹的區(qū)帶中，電泳技術(shù)中的等電點聚焦也稱為聚焦電泳。pH梯度的建立

用多種兩性電解質(zhì)混合物建立穩(wěn)定良好的pH梯度

本質(zhì)：一系列脂肪族多氨基、多羧酸同系物和異構(gòu)體，具有很多既不相同又十分接近相互連接的pI值。

pH范圍：pH3~10pH梯度的形成

載體兩性電解質(zhì)是一系列不同分子的兩性電解質(zhì)的混合物，在通電后，它們各自遷移到適當(dāng)位置形成一個連續(xù)的pH梯度。所有的載體兩性電解質(zhì)分子都帶電荷，只是溶液中正電荷和負電荷的基團數(shù)目相等，凈電荷為零。沒通電時的變化引入電場時的變化

載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，等電點最低的分子（負電荷最多的）將最快地向陽極遷移。當(dāng)它達到凈電荷是零的位置時才停止。其次一些低pI的載體兩性電解質(zhì)分子（負電荷比較多的）也將向陽極移動，直到它的凈電荷被減少到零才停止。電泳結(jié)束后的變化所有的載體兩性電解質(zhì)分子以增加pI級數(shù)的辦法將分別在陽、陰極之間到達它們自己的位置而給出一個pI梯度。載體兩性電解質(zhì)（ampholyte，商品名為ampholine）

早期的IFE方法用的是載體兩性電解質(zhì)pH梯度聚丙烯酰胺管狀膠。載體兩性電解質(zhì)是兩性小分子，當(dāng)電壓通過含有這些分子的混合物時，載體兩性電解質(zhì)按照其pI排成一線，可使凝膠形成連續(xù)的pH梯度。理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，保證pH梯度的穩(wěn)定和允許一定的電流通過。

載體兩性電解質(zhì)的局限性1、不是明確定義上的分子混合物。在生產(chǎn)加工方面，不同批次之間產(chǎn)品有很大變化，影響分離的重復(fù)性。2、pH梯度不穩(wěn)定，隨時間的推移有向陰極漂移的趨勢。過酸過堿的蛋白質(zhì)較難分離。3、軟的丙烯酰胺管膠的操作非常困難，因為膠容易被伸長或斷裂，引起分離結(jié)果之間的變化。IEFE的改進1982年，Bjellqvist等提出了固相化pH梯度（immobilizedpHgradients,IPG）方法：通過在灌膠時將丙烯酰胺緩沖液中加到聚丙烯酰胺凝膠中來產(chǎn)生pH梯度。在聚合過程中，緩沖液中的丙烯酰胺部分和丙烯酰胺及亞甲基雙丙烯酰胺單體一起共聚合形成聚丙烯酰胺凝膠。固相化pH梯度凝膠(IPG)的優(yōu)點1、避免陰極漂移：因pH梯度是共價固定于凝膠內(nèi)部的，具有更寬的pH分離范圍，使過酸過堿的蛋白質(zhì)得到分離2、具有更高的負載蛋白質(zhì)的能力3、生產(chǎn)上重復(fù)性好雙向電泳(two-dimensionalelectrophoresis,2DE)最早是由Smithies和Poulik提出，蛋白質(zhì)第一向根據(jù)其自由遷移率，在濾紙條上進行的；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進行。隨著聚丙烯酰胺凝膠的發(fā)明，雙向電泳支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠，即雙向凝膠電泳。

雙向凝膠電泳雙向凝膠電泳是一種由任意兩個單向凝膠電泳組合而成的，即在第一向電泳后再在與第一向垂直的方向上進行第二向電泳。該技術(shù)結(jié)合了根據(jù)蛋白質(zhì)等電點進行分離的等電聚焦技術(shù)以及根據(jù)蛋白質(zhì)的大小進行分離的SDS電泳技術(shù)。這兩項技術(shù)結(jié)合形成的二維電泳是分離分析蛋白質(zhì)最有效的一種電泳手段。

2DE儀器系統(tǒng)恒溫水浴垂直板電泳儀（第二向）電源等電聚焦儀（第一向）目前，第一向等電聚焦電泳普遍采用預(yù)制的固定pH梯度膠條(immobilizedpHgradientstrips,IPGstrips)。商品化的IPGstrips可以從AmershamPharmacia公司或Bi