第七章 電泳技術(shù)

第七章電泳技術(shù)

Electrophoresis7.1概述7.1.1電泳的定義在電場作用下，帶電顆粒向著與其電性相反的電極移動的現(xiàn)象

蛋白質(zhì)研究方面：用于蛋白質(zhì)分離、純化、分析、小量制備，分子量、等電點的測定7.1.2蛋白質(zhì)電泳的分離蛋白質(zhì)的依據(jù)

不同的蛋白質(zhì)分子，由于其側(cè)鏈可解離基團(tuán)的種類和數(shù)量、分子質(zhì)量、空間三維結(jié)構(gòu)都有所不同，所以：等電點（pI）不同同一pH條件，所帶電荷種類、數(shù)量不同大小、形狀不同蛋白質(zhì)分子在電場中的泳動速度常常用遷移率來表示定義：蛋白質(zhì)分子在單位電場強(qiáng)度下的泳動速度m==

V=遷移速度；E=電場強(qiáng)度；η=介質(zhì)粘度在同一介質(zhì)中電泳，m只與蛋白分子自身大小和形狀（r）、所帶電荷數(shù)量（Q）相關(guān)利用蛋白質(zhì)混合物中各蛋白的遷移率不同（蛋白性質(zhì)差異造成），而達(dá)到分離的效果V—E6πrη_____

Q7.1.3

遷移率（mobility,m）6種蛋白質(zhì)混合物的電泳結(jié)果圖7.1.4影響蛋白質(zhì)電泳速度的內(nèi)在因素蛋白質(zhì)分子所帶電荷的電性和電量電性決定電泳方向；電量越大，遷移速度越快蛋白質(zhì)分子的大小和形狀分子質(zhì)量越小、形狀越接近球形，在電場中遷移速度越快7.1.5影響蛋白質(zhì)電泳速度的外在因素溶液pH

決定蛋白質(zhì)所帶電荷的電性和電量

溶液的離子強(qiáng)度

越低，遷移越快；一般應(yīng)在0.01~0.2mol/L之間電場強(qiáng)度電滲現(xiàn)象電泳支持介質(zhì)溫度7.1.6蛋白質(zhì)電泳的分類按分離原理的不同

①移界電泳在自由溶液中遷移，引起界面移動。最早，已被取代②區(qū)帶電泳在介質(zhì)中遷移，分離成獨立區(qū)帶。目前最常用③穩(wěn)態(tài)電泳遷移到一定時間后達(dá)到穩(wěn)態(tài)。如等電聚焦電泳按有無固體支持物

①自由電泳無支持物，如移界電泳、某些等速電泳、柱電泳②支持物電泳有支持物，如聚丙烯酰胺凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳、等電聚焦電泳等常用的電泳技術(shù)

①常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（常規(guī)PAGE）②十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳

（SDS）

③等電聚焦（isoelectrofocusing，IEF）④雙向電泳（2-Delectrophoresis，2-DE）⑤轉(zhuǎn)移電泳（westerningblotting，Wb）

⑥免疫電泳（immunoelectrophoresis，IE）⑦毛細(xì)管電泳（capillaryelectrophoresis，CE）7.1.7電泳儀器基本設(shè)備：電泳儀、電泳槽、制膠模具配套設(shè)備：冷卻裝置、凝膠掃描儀、凝膠干燥器等電泳按設(shè)備形式的不同分為：①垂直板式電泳②平板式電泳③轉(zhuǎn)移電泳④雙向電泳⑤垂直柱式電泳（盤狀電泳）

電泳儀

垂直板式電泳槽平板式電泳槽轉(zhuǎn)移電泳槽雙向電泳槽垂直柱式電泳槽（盤狀電泳槽）凝膠成像系統(tǒng)凝膠干燥器PAGE（polyacrylamidegelelectrophoresis）是以聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質(zhì)的一種電泳方法聚丙烯酰胺凝膠是一種以丙烯酰胺單體為材料，甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，在催化劑作用下，把丙烯酰胺單體聚合成三維網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)的高分子聚合物7.2

聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

一、基本原理（一）聚丙烯酰胺凝膠的合成1.丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)量的確定凝膠的孔徑大小由Acr和Bis在凝膠中的總濃度(T)及Bis占兩者的百分含量(C，即交聯(lián)度)決定

T＝Acr+Bis/v×100%（v：溶液的體積）C＝Bis/Acr+Bis×100%實驗表明，當(dāng)C＝5%時，凝膠篩孔直徑最??；大于或小于5%，篩孔直徑均變大目前常采用固定值C＝2.6%或5%，再通過選擇不同的T值制備不同濃度的凝膠來分離各種蛋白質(zhì)混合物2.凝膠濃度的選擇根據(jù)樣品中大部分蛋白質(zhì)的分子量范圍

C=2.6%C=5%凝膠濃度/T%分子量范圍/kDa凝膠濃度/T%分子量范圍/kDa530~200560~7001015~1001022~2801510~501510~200202~15205~150聚丙烯酰胺凝膠濃度與蛋白質(zhì)分子量的關(guān)系3.Acr單體的催化聚合原理兩種催化反應(yīng)類型:化學(xué)催化和光催化

①化學(xué)催化（最常用）過硫酸銨（AP）作為催化劑

N,N,N’,N’,-四甲基乙二胺（TEMED）作為增速劑②光催化核黃素作催化劑，TEMED作增速劑，需光照和氧分子的參與PAGE可分為（按是否加入SDS和強(qiáng)還原劑）：

常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)常規(guī)PAGE對于蛋白質(zhì)混合物的分離是基于①不同蛋白質(zhì)分子量大小的不同；②不同蛋白質(zhì)分子形狀的不同；③不同蛋白質(zhì)所帶凈電荷的不同。電泳過程中蛋白質(zhì)能保持天然構(gòu)象及生物學(xué)活性SDS由于加入了SDS和強(qiáng)還原劑（DTT、β-巰基乙醇），對于蛋白質(zhì)混合物的分離只基于不同蛋白質(zhì)分子量大小的不同。電泳過程中蛋白質(zhì)天然構(gòu)象被破壞，生物學(xué)活性喪失（一）常規(guī)PAGE的類型按蛋白質(zhì)所帶電荷的電性分類陽極電泳：蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，向陽極遷移；緩沖液pH8.0~9.5，常用于分離酸性蛋白質(zhì)陰極電泳：蛋白質(zhì)帶正電荷，向陰極遷移；緩沖液pH4.0左右，常用于分離堿性蛋白質(zhì)二、常規(guī)PAGE按電泳系統(tǒng)的連續(xù)性分類

連續(xù)電泳：一般只有分離膠。電泳體系的緩沖液pH及凝膠濃度保持不變不連續(xù)電泳：包括濃縮膠和分離膠。濃縮膠和分離膠的緩沖液pH、凝膠濃度都不同

濃縮膠：孔徑較大，pH6.8；作用：防止對流，濃縮樣品

分離膠：孔徑較小，pH8.8；作用：根據(jù)蛋白質(zhì)的大小、形狀、所帶電荷的種類和數(shù)量的不同進(jìn)行分離

（二）常規(guī)PAGE的三大分離效應(yīng)①濃縮效應(yīng)蛋白質(zhì)樣品在濃縮膠中被高度濃縮，最終集聚成一條狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)②電荷效應(yīng)不同蛋白質(zhì)所帶電荷的數(shù)量不同，因此遷移率不相同③分子篩效應(yīng)凝膠對不同分子量的蛋白分子具有的篩分效應(yīng)。分子質(zhì)量越小，遷移率越大（三）常規(guī)PAGE凝膠濃度的選擇應(yīng)根據(jù)樣品中大部分蛋白質(zhì)的分子量范圍來選擇

如果對樣品中蛋白質(zhì)分子量未知，可先選濃度為7.5%的均一膠進(jìn)行分離，再根據(jù)分離效果做調(diào)整和優(yōu)化一般來說，理想的蛋白質(zhì)相對遷移率mR范圍應(yīng)在0.25～0.85之間（四）常規(guī)PAGE的實驗方法制備凝膠原料：丙烯酰胺（Acr）交聯(lián)劑：甲叉雙丙烯酰胺（Bis）化學(xué)催化聚合法催化劑：過硫酸銨（AP）加速劑：N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)凝膠的孔徑、機(jī)械性能、彈性、透明度、粘著度及聚合程度取決于濃度T和交聯(lián)度CT=Acr+Bis/v

100%C=Bis/(Acr+Bis)

100%C不變，T變大：凝膠孔徑變小，膠變硬、脆C不變，T變?。耗z孔徑變大，膠變軟T不變，C變大：凝膠變不透明，彈性變小

制膠過程（包括配膠、脫氣、灌膠、封水）：先配制各種所需成份的儲液，再根據(jù)所需T值按比例混合（具體的配方見課本）組裝模具，灌制凝膠，防止漏膠對于不連續(xù)電泳體系：先制備分離膠，再制備濃縮膠對于垂直平板電泳，在濃縮膠上端插入“梳子”以形成加樣孔注意事項：⑴兩種單體在固體狀態(tài)相對穩(wěn)定，但溶液狀態(tài)不穩(wěn)定（4℃保存一個月），丙烯酰胺在儲存期間會逐漸水解成丙烯酸而影響凝膠聚合及降低電泳遷移率⑵單體未聚合前是一種對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有毒的試劑，應(yīng)避免直接接觸⑶催化劑和加速劑濃度增加可縮短凝膠的聚合時間，但過量會引起蛋白電泳條帶的畸變；一般聚合反應(yīng)能在40~60分鐘完成②

加樣樣品中不應(yīng)包含顆粒狀不溶物樣品應(yīng)溶于樣品緩沖液中，常溶于如下樣品緩沖緩沖液：pH6.8,0.3125mol/LTris-HCl，甘油25%，溴酚藍(lán)0.05%上樣量的控制（與染色方法有關(guān)）

考馬斯亮藍(lán)染色法：50~150

g銀染法：1~3

g用微量注射器在加樣孔中加樣，樣品加至加樣孔底部凝膠面上③電泳恒壓下進(jìn)行電泳（如200V）確保電泳緩沖液和凝膠保持良好的接觸，防止短路和斷路防止凝膠過熱指示劑—溴酚藍(lán)的前沿到達(dá)凝膠底部時，電泳結(jié)束，應(yīng)關(guān)閉電源后取出凝膠檢測(1)考馬斯亮藍(lán)染色法考馬斯亮藍(lán)R-250和G-250，常用R-250原理：在酸性條件下，蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭R-250結(jié)合形成藍(lán)色復(fù)合物（595nm處最大吸收峰），藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比關(guān)系染色靈敏度達(dá)0.2~0.5

g/條帶(2)銀染法原理：銀染時蛋白條帶上的AgNO3被還原成金屬Ag，沉積在蛋白條帶上而顯色顯色方法分為化學(xué)顯色和光顯色靈敏度達(dá)2ng/條帶(3)其他染色方法熒光染料及苯胺黑、氨基黑、麗春紅S、快綠FCF、2,4-DNFB等染料電泳結(jié)果的保存采用凝膠成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描拍照；采用凝膠圖像處理軟件進(jìn)行圖譜分析凝膠的保存短期保存：浸泡在7%醋酸溶液中長期保存：采用凝膠干燥器進(jìn)行干燥后保存7.3SDS7.3.1原理去垢劑SDS—十二烷基硫酸鈉，CH3(CH2)11OSO3Na，破壞蛋白質(zhì)分子的氫鍵和疏水鍵，并與之結(jié)合形成SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物強(qiáng)還原劑β-巰基乙醇或二硫蘇糖醇（DTT），破壞蛋白分子二硫鍵結(jié)果導(dǎo)致：SDS-蛋白復(fù)合物帶上大量負(fù)電荷，且不同蛋白質(zhì)有著相同的荷質(zhì)比（SDS與多數(shù)蛋白質(zhì)的結(jié)合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)）蛋白分子變成橢圓棒狀，不同的蛋白分子無形狀差別，棒的長度與其分子量成正比

因此對于SDS，蛋白質(zhì)的遷移率僅與分子量有關(guān)7.3.2實驗方法SDS中，由于蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合后帶負(fù)電荷，因此屬于陽極電泳；方法與常規(guī)PAGE類似凝膠緩沖液中加入0.1%SDS樣品緩沖液中加1%~2%SDS和1%~6%β-巰基乙醇（或3%DTT）電泳緩沖液中加0.1%SDS一般采用不連續(xù)系統(tǒng)（凝膠由濃縮膠和分離膠組成）樣品處理：蛋白質(zhì)溶于樣品緩沖液，在100℃水浴中加熱3~5min，使蛋白質(zhì)充分變性染色方法多用考馬斯亮藍(lán)法和銀染法常應(yīng)用蛋白質(zhì)的分離及其分子量的分析7.4等電聚焦電泳（IEF）7.4.1原理利用不同蛋白質(zhì)的等電點的不同而使其在pH梯度中相互分離的一種電泳技術(shù)等電聚焦過程中，蛋白質(zhì)分子在一個連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳，結(jié)果導(dǎo)致每種蛋白質(zhì)分子遷移到等于其pI的pH處（此時蛋白質(zhì)分子的凈電荷為零），最終聚集形成一個很窄的蛋白區(qū)帶

在pH梯度中，某蛋白質(zhì)處于非pI時，由于帶凈電荷，將向異性電極方向遷移，即向其等電點方向遷移；一旦抵達(dá)其等電點位置，因凈電荷為零而將停止遷移，所以具有相同pI的蛋白在其pI位置聚焦成一條窄的蛋白帶

7.4.2pH梯度的形成方法7.4.2.1載體兩性電解質(zhì)pH梯度

載體兩性電解質(zhì)是一系列多氨基多羧基的混合物，具有相近但不同的pKa和pI值，其pI分布在2.5~10之間，在外電場的作用下，能自然形成pH梯度Ampholyte化學(xué)結(jié)構(gòu)式Pharmalyte化學(xué)結(jié)構(gòu)式常用的兩種載體兩性電解質(zhì)7.4.2.2固相pH梯度

使用一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，它們除與甲叉雙丙烯酰胺形成凝膠外，還在滴定終點附近形成pH梯度固相pH梯度與載體兩性電解質(zhì)pH梯度的區(qū)別在于前者的分子不是兩性分子，在凝膠聚合時便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變；后者是兩性分子，在電場中遷移到pI后才形成pH梯度固相pH梯度IEF比載體兩性電解質(zhì)pH梯度IEF具有更高的分辨率和更大的上樣量，其分辨率可達(dá)到0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一7.4.3實驗方法IEF分為聚丙烯酰胺凝膠IEF和瓊脂糖凝膠IEF。聚丙烯酰胺凝膠用于分析分子量小于300kDa的蛋白質(zhì)，使用濃度約為5%~8%，交聯(lián)度約為3%；瓊脂糖凝膠可分析分子量大至2000kDa的大分子，使用濃度為1%，能用于制備型分離上樣時，樣品可加到凝膠的任何位置IEF一般采用高電壓（上限可至2000V），用以提高分辨率。但維持高電壓必須具有良好的凝膠冷卻系統(tǒng)，以防止凝膠過熱而燒膠主要用于蛋白質(zhì)等電點（pI）的測定和作為雙向電泳中的第一向電泳7.4.4等電聚焦電泳的用途7.5雙向電泳7.5.1原理雙向電泳（2-dimensionElectrophoresis，2-DE）是樣品經(jīng)第一向電泳后，再在垂直方向上進(jìn)行第二向其他類型電泳的電泳方式。目前的雙向電泳一般是：第一向為等電聚焦（IEF），第二向為SDS2-DE使得分離分辨率大大提高，獲得的信息也明顯增多，是目前電泳技術(shù)中分辨率最高、信息獲得最多的技術(shù)，常用于分析復(fù)雜樣品及繪制蛋白質(zhì)組圖譜，是蛋白質(zhì)組學(xué)研究的核心技術(shù)雙向電泳的示意圖及電泳結(jié)果效果圖7.5.2基于固相pH梯度IEF的雙向電泳

步驟:1、樣品的制備2、IPG干膠條的再水化3、等點聚焦電泳（IEF）4、IPG膠條進(jìn)行平衡5、SDS6、染色7、結(jié)果分析7.5.3雙向電泳的用途利用雙向電泳技術(shù)不僅能了解樣品中各蛋白的等電點、分子量、豐度等信息，更重要的是還可利用比較雙向電泳的方法用于了解樣品中各蛋白的動態(tài)變化情況進(jìn)一步，還可利用質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)庫檢索對感興趣的蛋白點進(jìn)行種類鑒定，因此目前是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的核心技術(shù)7.6熒光差異雙向電泳熒光差異雙向電泳（2D-FluorescentDifferenceGelElectrophoresis,簡稱2D-DIGE）是近幾年發(fā)展起