第七章微生物的遺傳變異和育種

遺傳：親代與子代相似變異：親代與子代、子代間不同個體不完全相同遺傳和變異是生命的最本質(zhì)特性之一遺傳型：表型（表現(xiàn)型）：生物的全部遺傳因子及基因具有一定遺傳型的個體，在特定環(huán)境條件下通過生長發(fā)育所表現(xiàn)出來的形態(tài)等生物學(xué)特征的總和。表型是由遺傳型所決定，但也和環(huán)境有關(guān)。表型飾變：表型的差異只與環(huán)境有關(guān)特點：暫時性、不可遺傳性、表現(xiàn)為全部個體的行為橘生淮南則為橘，生于淮北則為枳。遺傳型變異（基因變異、基因突變）：遺傳物質(zhì)改變，導(dǎo)致表型改變特點：遺傳性、群體中極少數(shù)個體的行為（自發(fā)突變頻率通常為10-6-10-9）微生物是遺傳學(xué)研究中的明星：微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)簡單，營養(yǎng)體一般為單倍體，方便建立純系。很多常見微生物都易于人工培養(yǎng)，快速、大量生長繁殖。對環(huán)境因素的作用敏感，易于獲得各類突變株，操作性強(qiáng)。第六章微生物的遺傳變異和育種

第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第二節(jié)基因突變和微生物育種第三節(jié)基因重組和雜交育種第四節(jié)基因工程第五節(jié)菌種的衰退、復(fù)壯和保藏第六章微生物的遺傳變異和育種一、三個經(jīng)典實驗二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)1、經(jīng)典轉(zhuǎn)化實驗2、更有說服力的噬菌體感染實驗3、植物病毒的拆分和重建試驗

第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)第六章微生物的遺傳變異和育種一、三個經(jīng)典實驗1928年，英國GriffithS型肺炎球菌：有莢膜，菌落表面光滑,有毒性R型肺炎球菌：沒有莢膜，菌落表面粗糙，無毒性

著名的肺炎球菌轉(zhuǎn)化實驗

結(jié)果說明？結(jié)果說明：加熱殺死的S型肺炎球菌中一定有某種特殊的生物分子或遺傳物質(zhì)，可以使無害的R型肺炎球菌轉(zhuǎn)化為有害的S型肺炎球菌。這種生物分子或遺傳物質(zhì)是什么呢？

著名的肺炎球菌實驗

紐約洛克非勒研究所Avery從加熱殺死的S型肺炎球菌將蛋白質(zhì)、核酸、多糖、脂類分離出來，分別加入到無害的R型肺炎球菌中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，惟獨只有核酸可以使無害的R型肺炎球菌轉(zhuǎn)化為有害的S型肺炎球菌。1944年結(jié)論：DNA是生命的遺傳物質(zhì)1952年，Hershey和Chase病毒（噬菌體）放射性同位素35S標(biāo)記病毒的蛋白質(zhì)外殼，32P標(biāo)記病毒的DNA內(nèi)核，感染細(xì)菌。新復(fù)制的病毒，檢測到了32P標(biāo)記的DNA，沒有檢測到35S標(biāo)記的蛋白質(zhì)，DNA在病毒和生物體復(fù)制或繁殖中的關(guān)鍵作用。8年的時間2、更有說服力的噬菌體感染實驗

3、植物病毒的拆分和重建試驗煙草花葉病毒感染試驗二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式（一）、七個水平（1）細(xì)胞水平（2）細(xì)胞核水平（3）染色體水平（4）核酸水平（5）基因水平（6）密碼子水平（7）核苷酸水平1.定義和特點：定義：游離并獨立存在于染色體以外的能進(jìn)行自主復(fù)制的細(xì)胞質(zhì)遺傳因子，通常以小型共價閉合環(huán)狀的超螺旋雙鏈DNA分子，即cccDNA存在于各種微生物細(xì)胞中。大小：1～1000kb

構(gòu)型：超螺旋、線狀、環(huán)狀特點：（1）質(zhì)粒攜帶某些核基因組中所缺少的對宿主生存不必需基因，在特殊條件下使宿主得到生長優(yōu)勢。（2）嚴(yán)緊型復(fù)制控制：質(zhì)粒的復(fù)制行為與核染色體的復(fù)制同步。松弛型復(fù)制控制：質(zhì)粒的復(fù)制與核染色體的復(fù)制不同步。（3）質(zhì)粒消除。

（二）、原核生物的質(zhì)粒

質(zhì)粒的檢測

提取所有胞內(nèi)DNA后電鏡觀察；

超速離心或瓊脂糖凝膠電泳后觀察；對于實驗室常用菌，可用質(zhì)粒所帶的某些特點，如抗藥性初步判斷。特定的質(zhì)粒提取方法和后處理使染色體和RNA均被除掉。對于由于三種構(gòu)型同時存在時造成的多帶現(xiàn)象（提取質(zhì)粒時造成或自然存在），可以進(jìn)行特異性單酶切，使其成為一條帶。第六章微生物的遺傳變異和育種（2）質(zhì)粒的種類

根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)，分為以下幾類：①F質(zhì)粒;②抗性因子;③Col質(zhì)粒;④Ti質(zhì)粒;⑤代謝質(zhì)粒;⑥Ri質(zhì)粒;⑦固氮質(zhì)粒;⑧隱秘質(zhì)粒。

其中研究較多的細(xì)菌質(zhì)粒有：F質(zhì)粒決定大腸桿菌的致育性；抗性因子決定細(xì)菌的耐藥性；Col質(zhì)粒決定產(chǎn)生大腸桿菌素。第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒第六章微生物的遺傳變異和育種①F質(zhì)粒（接合質(zhì)粒、F因子、致育因子或性因子）大?。簝H100kb，為cccDNA。功能：決定細(xì)菌的性別和轉(zhuǎn)移能力。F質(zhì)粒在大腸桿菌的有性接合作用中起主要作用。第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類F′因子：Hfr菌株上的F因子變成自由狀態(tài)時攜帶某一染色體基因的F因子。分類：F+菌株：攜帶F質(zhì)粒的菌株。(相當(dāng)于雄性)F―菌株：無F質(zhì)粒的菌株。(相當(dāng)于雌性)高頻重組菌株：F質(zhì)粒整合到宿主細(xì)胞染色體上的菌株(Hfr)。（相當(dāng)于附加體）。第六章微生物的遺傳變異和育種第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類F因子能以游離狀態(tài)(F+)和以與染色體相結(jié)合的狀態(tài)(Hfr)存在于細(xì)胞中，所以又稱之為附加體(episome)。第六章微生物的遺傳變異和育種②抗性因子(R因子）第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類分類：抗藥性抗重金屬例如R1質(zhì)粒(94kb)可使宿主對下列五種藥物具有抗性：氯霉素、鏈霉素、磺胺、氨芐青霉素和卡那霉素，并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于R1抗性質(zhì)粒上。許多R質(zhì)粒能使宿主細(xì)胞對許多金屬離子呈現(xiàn)抗性，包括砷、汞、鎳、鈷、銀、鎘等。在腸道細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的R質(zhì)粒，約有25％為抗汞離子，而銅綠假單胞菌中約占75％。R100質(zhì)粒(89kb)可使宿主對下列藥物及重金屬具有抗性：汞、四環(huán)素、鏈霉素、磺胺、氯霉素、夫西地酸并且負(fù)責(zé)這些抗性的基因是成簇地存在于抗性質(zhì)粒上。抗性質(zhì)粒在細(xì)菌間的傳遞是細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的重要原因之一。第六章微生物的遺傳變異和育種③Col質(zhì)粒（細(xì)菌素質(zhì)粒）含有編碼大腸桿菌素的基因，故而得名。大腸桿菌素是一種細(xì)菌蛋白，只抑制或殺死其他近緣腸道細(xì)菌或同種不含Col質(zhì)粒的不同品系的菌株。應(yīng)用：例如乳酸乳球菌(舊稱乳酸鏈球菌)產(chǎn)生的乳酸鏈球菌素(Nisin)能強(qiáng)烈抑制某些G+細(xì)菌的生長，而被用于食品的防腐保鮮。第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類細(xì)菌素結(jié)構(gòu)基因、涉及細(xì)菌素運輸及發(fā)揮作用（processing）的蛋白質(zhì)的基因、賦予宿主對該細(xì)菌素具有“免疫力”的相關(guān)產(chǎn)物的基因一般都位于質(zhì)粒或轉(zhuǎn)座子上，因此，細(xì)菌素可以殺死同種但不攜帶該質(zhì)粒的菌株。③Col質(zhì)粒（細(xì)菌素質(zhì)粒）

第六章微生物的遺傳變異和育種④

Ti質(zhì)粒（誘瘤質(zhì)粒）存在于根癌土壤桿菌中引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子。200kb的環(huán)狀質(zhì)粒，包括毒性區(qū)、接合轉(zhuǎn)移區(qū)、復(fù)制起始區(qū)和T-DNA區(qū)4部分。其中的毒性區(qū)和T-DNA區(qū)與冠癭瘤生成有關(guān)。致病機(jī)制：Ti質(zhì)粒上的T-DNA可攜帶外源基因整合到植物細(xì)胞的核染色體上，合成正常植株所沒有的冠癭堿類化合物，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，導(dǎo)致細(xì)胞無控制的瘤狀增生廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物載體的是一種經(jīng)過人工改造后的Ti質(zhì)粒。已有200多種轉(zhuǎn)基因植物中，約有80％由Ti質(zhì)粒介導(dǎo)。第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類根癌土壤桿菌所含Ti質(zhì)粒是引起雙子葉植物冠癭瘤的致病因子許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具有編碼毒素的基因，其產(chǎn)物對宿主（動物、植物）造成傷害。第六章微生物的遺傳變異和育種⑤代謝質(zhì)粒(降解性質(zhì)粒)

這類質(zhì)粒含有編碼降解一系列復(fù)雜有機(jī)物的酶的基因。如假單胞菌能將復(fù)雜有機(jī)化合物，尤其是有毒化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式，故在污水處理、環(huán)境保護(hù)等方面發(fā)揮特殊作用。每一種具體的質(zhì)粒常以其降解的底物而命名。如CAM(樟腦)質(zhì)粒，OCT(辛烷)質(zhì)粒，XYL(二甲苯)質(zhì)粒，SAL(水楊酸)質(zhì)粒，MDL(扁桃酸)質(zhì)粒，NAP(萘)質(zhì)粒和TOL(甲苯)質(zhì)粒等。曾有人通過遺傳工程手段構(gòu)建具有數(shù)種代謝質(zhì)粒的菌株，此種具有廣譜降解能力的工程菌被稱為“超級菌”。此外，代謝質(zhì)粒中還包括一些能編碼固氮功能的基因。例如根瘤菌中與結(jié)瘤和固氮有關(guān)的基因均位于代謝質(zhì)粒中.第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類第六章微生物的遺傳變異和育種⑥Ri質(zhì)粒發(fā)根土壤桿菌可侵染雙子葉植物的根部誘生大量毛根瘤。Ri質(zhì)粒一段T-DNA整合到寄主根部細(xì)胞的核基因組中，根部并不形成瘤，僅生出可再生新植株的毛狀根。若將毛狀根離體培養(yǎng)，還能合成次生代謝物。Ri質(zhì)粒在功能上與Ti質(zhì)粒有廣泛的同源性，發(fā)生轉(zhuǎn)化的T-DNA在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳。在實踐上，Ri質(zhì)粒已成為外源基因的良好載體，也可用于次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類第六章微生物的遺傳變異和育種

⑦固氮質(zhì)粒該質(zhì)粒存在于根瘤菌屬(Rhizobium)中含有編碼一系列與共生固氮相關(guān)的基因。因其相對分子質(zhì)量比一般質(zhì)粒大幾十倍至幾百倍，故又名巨大質(zhì)粒。它與根瘤菌屬細(xì)菌的固氮作用有關(guān)。⑧隱秘質(zhì)粒

不顯示任何表型效應(yīng)，它們的存在只有通過物理方法，例如用凝膠電泳檢測細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。目前對其生物學(xué)意義尚不甚了解。

第一節(jié)微生物遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)二、遺傳物質(zhì)在微生物細(xì)胞內(nèi)存在的部位和方式2、原核生物的質(zhì)粒（2）質(zhì)粒的種類第六章微生物的遺傳變異和育種一、基因突變二、自發(fā)突變與定向培育三、誘變育種第二節(jié)基因突變和微生物育種第六章微生物的遺傳變異和育種基因突變泛指細(xì)胞內(nèi)(或病毒粒子內(nèi))遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)或數(shù)量突然發(fā)生了可遺傳的變化。基因突變可自發(fā)或誘導(dǎo)產(chǎn)生。第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變廣義的突變包括基因突變和染色體畸變。染色體畸變又包括染色體的缺失、重復(fù)、插入、倒位和易位。狹義的突變指基因突變(點突變)，包括一對或幾對堿基的缺失、插入或置換；表型變化的突變類型的分類：

1，營養(yǎng)缺陷型野生型菌株的遺傳型應(yīng)是[A+B+]

A營養(yǎng)缺陷型的遺傳型用[A-B+]表示，而B營養(yǎng)缺陷型的遺傳型用[A+B-]表示。(一）、基因突變的類型②抗性突變型③條件致死突變型④形態(tài)突變型⑤抗原突變型⑥產(chǎn)量突變型特點：在選擇培養(yǎng)基（一般為基本培養(yǎng)基）上不生長負(fù)選擇標(biāo)記突變株不能通過選擇平板直接獲得①營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)缺陷型影印平板（Replicaplating）法是Lederberg夫婦在1952年建立條件致死突變型在某一條件下具有致死效應(yīng)，而在另一條件下沒有致死效應(yīng)的突變型。負(fù)選擇標(biāo)記特點：這類突變型常被用來分離生長繁殖必需的突變基因常用的條件致死突變是溫度敏感突變，用ts表示，這類突變在高溫下（如42℃）是致死的，但可以在低溫（如25-30℃）下得到這種突變。形態(tài)突變型造成形態(tài)改變的突變型特點：非選擇性突變突變株和野生型菌株均可生長，但可從形態(tài)特征上進(jìn)行區(qū)分。舉例：產(chǎn)蛋白酶缺陷突變株的篩選菌落顏色變化形成芽孢缺陷菌株細(xì)胞水平上的形態(tài)突變，突變株的檢出更加困難。β半乳糖苷酶基因的插入失活，使重組子菌落為白色而與蘭色的非重組子分開。第六章微生物的遺傳變異和育種（1）堿基變化與遺傳信息的改變

不同堿基變化引起遺傳信息的改變不同，主要有以下四種類型。原序列5′—AUGCCUUCAAGAUGUGGG—3′MetProSerArgCysGly同義突變5′—AUGCCUUCAAGAUGUGGA—3′MetProSerArgCysGly錯義突變5′—AUGCCUUCAGGAUGUGGG—3′MetProSerGlyCysGly無義突變5′—AUGCCUUCAAGAUGAGGG—3′MetProSerArgstop缺失一個堿基A

移碼突變5′—AUGCCUUCAAG↑UGUGGG—3′MetProSerSerVal

第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變1、基因突變的類型第六章微生物的遺傳變異和育種定義：某一細(xì)胞(或病毒粒子)在每一世代中某一性狀發(fā)生突變的幾率，稱突變率。雙重或多重基因突變的幾率是各個基因突變幾率的乘積。檢出選擇性突變株的手段，尤其采用檢出營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株或抗藥性突變株的方法達(dá)到目的。據(jù)測定，一般基因的自發(fā)突變率為10-6，轉(zhuǎn)座突變率為10-4，無義突變或錯義突變的突變率約10-8。

第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變（二）、突變率第六章微生物的遺傳變異和育種①自發(fā)性。②不對應(yīng)性③稀有性④獨立性⑤誘變性⑥穩(wěn)定性⑦可逆性第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變（三）、基因突變的特點第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變（四）、基因突變自發(fā)性和不對應(yīng)性的實驗證明如何證明基因突變的非對應(yīng)性？三個經(jīng)典實驗變量實驗、涂布實驗、影印實驗證明突變的性狀與引起突變的原因間無直接對應(yīng)關(guān)系！變量實驗（fluctuationanalysis）SalvadorLuriaandMaxDelbruck（1943）SalvadorLuriaMaxDelbruckTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1969Newcombe的涂布實驗（1949）影印實驗（replicaplating）JoshuaLederbergandEstherLederberg（1952）JoshuaLederbergJ.LederbergisawardedtheNoblePrizeinMedicineandPhysiologyin1958突變真的與選擇壓力無關(guān)嗎？適應(yīng)性突變（adaptivemutability）和高頻突變（hypermutation）BensonS.Adaptivemutation:ageneralphenomenonorspecialcase?Bioessays.1997Jan;19(1):9-11.Review.GalitskiT,RothJR.

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Transposonstabilityandaroleforconjugationaltransferinadaptivemutability.ProcNatlAcadSciUSA.2000Jun20;97(13):7393-8.BullHJ,McKenzieGJ,HastingsPJ,RosenbergSM.Evidencethatstationary-phasehypermutationintheEscherichiacolichromosomeispromotedbyrecombination.Genetics.2000Apr;154(4):1427-37.第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變（五）、基因突變的機(jī)制（1）誘發(fā)突變的機(jī)制誘發(fā)突變：人為的理化因子的刺激使微生物的性狀發(fā)生了可遺傳的變化。誘變劑：能使突變率顯著高于自發(fā)突變頻率的物理、化學(xué)和生物因子。僅影響一對堿基影響一段染色體誘變劑與DNA堿基的原發(fā)反應(yīng)遺傳效應(yīng)堿基類似物摻入作用AT?GC轉(zhuǎn)換羥胺與胞嘧啶起反應(yīng)GC→AT轉(zhuǎn)換亞硝酸A、G、C氧化脫氨作用交聯(lián)AT?GC轉(zhuǎn)換缺失烷化劑烷化堿基(主要是G)烷化磷酸基團(tuán)脫去烷化的嘌呤糖-磷酸骨架斷裂AT?GC轉(zhuǎn)換AT→TA顛換

GC→CG顛換染色體畸變吖啶類堿基對間的插入作用移碼突變紫外線形成嘧啶水合物

形成胸腺嘧啶二聚體GC→AT轉(zhuǎn)換

移碼突變X射線、γ射線等堿基的羥基化與降解DNA降解糖-磷酸骨架斷裂

AT?GC轉(zhuǎn)換移碼突變?nèi)旧w畸變E.coliMu溫和噬菌體結(jié)合到一個基因中間移碼突變第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種一、基因突變5、基因突變的機(jī)制（1）誘發(fā)突變的機(jī)制①堿基的置換（點突變）置換：轉(zhuǎn)換（相同堿基之間）；顛換（不同堿基）化學(xué)誘變劑發(fā)生置換的機(jī)制：A直接引起置換

誘變劑直接與核酸的堿基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。此類誘變劑有：亞硝酸、羥胺和烷化劑。

B間接引起置換

堿基類似物，通過代謝摻入到DNA分子中。此類誘變劑有：5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、5、基因突變的機(jī)制（1）誘發(fā)突變的機(jī)制②移碼突變定義：誘變劑引起DNA分子中的一個或少數(shù)幾個核苷酸堿基的增加(插入)或缺失，造成突變點以后的全部遺傳密碼的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯發(fā)生錯誤，從而引起微生物遺傳性狀的改變。此類誘變劑:吖啶類染料(原黃素、吖啶黃、吖啶橙、α-氨基吖啶等)和一系列稱為ICR類化合物。

③染色體畸變定義：某些理化因子使DNA鏈上發(fā)生較大的損傷。此類誘變劑：X射線、亞硝酸和烷化劑等。一條染色體內(nèi)的畸變有缺失、重復(fù)、插入、倒位和易位。5、基因突變的機(jī)制（2）自發(fā)突變的機(jī)制自發(fā)突變：沒有人工參與下的微生物所發(fā)生的突變。自發(fā)突變的機(jī)制有下面三種原因：①射線和環(huán)境因素的誘變效應(yīng)②微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變效應(yīng)③互變異構(gòu)效應(yīng)（六）紫外線對DNA的損傷與修復(fù)自學(xué)！三、誘變育種誘變育種：是指利用物理、化學(xué)等各種誘變劑處理均勻而分散的微生物細(xì)胞，顯著提高基因的隨機(jī)突變頻率，而后采用簡便、快速、高效的篩選方法，從中挑選出少數(shù)符合育種目的的優(yōu)良突變株，以供科學(xué)實驗或生產(chǎn)實踐使用。在誘變育種過程中，誘變和篩選是兩個主要環(huán)節(jié)，由于誘變是隨機(jī)的，而篩選則是定向的，相比之下，篩選更為重要。二、突變與育種1、從生產(chǎn)實踐中育種10-6左右的突變率的自發(fā)突變，正突變，也有負(fù)突變，例如上海酒精二廠的糖化菌種宇佐美曲霉3758號的變種“上酒白種”。2、定向培育優(yōu)良菌株定向培育：利用微生物的自發(fā)突變，采用特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的古老方法。19世紀(jì)巴斯德培育低毒力的炭疽芽孢桿菌卡介苗二、突變與育種

（一）自發(fā)突變與育種

（breedingbyspontaneousmutation）

1.從生產(chǎn)中育種在生產(chǎn)第一線易獲得較優(yōu)良的生產(chǎn)菌株。2.定向培育優(yōu)良菌株定向培育是一種利用微生物自發(fā)突變，并采用特定的選擇條件，通過對微生物群體不斷移植以選育出較優(yōu)良菌株的古老方法。篩選誘變誘變育種定向的——更重要隨機(jī)的（二）誘變育種（breedingbyinducedmutation）可獲得供工業(yè)和實驗室應(yīng)用的各種菌株；提高有用代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量；減少雜質(zhì)、提高產(chǎn)品質(zhì)量、擴(kuò)大品種和簡化工藝等。誘變育種具有重大的實踐意義1.誘變育種的基本環(huán)節(jié)第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種1、誘變育種的基本程序原始菌株(出發(fā)菌株)↓純化—→出發(fā)菌株性能測定↓細(xì)胞或孢子懸浮液制備↓—→活細(xì)胞計數(shù)誘變預(yù)備實驗—→誘變劑處理↓—→活細(xì)胞計數(shù)中間培養(yǎng)↓涂布平板—→突變株分離↓—→形態(tài)變異觀察并計算其突變率挑變異菌落于斜面上培養(yǎng)↓初篩(性能粗測)↓復(fù)篩(性能精測)↓生產(chǎn)性能試驗

2.誘變育種幾個原則

（1）選擇簡便有效的誘變劑（2）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（3）處理單細(xì)胞或單孢子懸液（4）選用最適的誘變劑量（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)（7）設(shè)計高效篩選方案（8）創(chuàng)造新型篩選方法第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種2、誘變育種中的幾個原則(3)選擇簡便有效的誘變劑

(1)挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株(2)單孢子(或單細(xì)胞)懸浮液的制備(4)確定最適的誘變劑量(5)充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)(6)利用和創(chuàng)造形態(tài)變異、生理變異與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)(7)設(shè)計高效篩選方案(8)創(chuàng)造新型篩選方法化學(xué)誘變劑非電離輻射類引起電離輻射烷化劑堿基類似物吖啶類化合物物理因素（1）選擇簡便有效的誘變劑X射線γ射線快中子等紫外線激光離子束等

烷化劑可與巰基、氨基和羧基等直接發(fā)生反應(yīng)，更易引起基因突變。最常用的烷化劑N-甲基–N'-硝基-N-亞硝基胍（NTG）、甲基磺酸乙酯（EMS）、甲基亞硝基脲（NMU）、硫酸二乙酯（DES）、氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙烷等。擬輻射物質(zhì)氮芥、硫芥和環(huán)氧乙烷等各種點突變一般只有輻射才能誘發(fā)染色體畸變誘發(fā)第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種

（1）挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株

①選用經(jīng)過生產(chǎn)實踐中選育出來的自發(fā)突變菌株進(jìn)行誘變處理效果較好；②選用本身能少量積累所需產(chǎn)品或其前體的菌株；③選用已發(fā)生過其他突變，如代謝產(chǎn)物變化的菌株。例如在選育金霉素高產(chǎn)菌株時，發(fā)現(xiàn)用喪失黃色素合成能力的菌株作出發(fā)菌株比分泌黃色素者更有利于產(chǎn)量變異；④選用對誘變劑敏感性較高的增變變異株，對誘變劑的敏感性顯著高于原始菌株；⑤選用經(jīng)幾次誘變處理能提高產(chǎn)量或效價的菌株等等。2、誘變育種中的幾個原則第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種(2)單孢子(或單細(xì)胞)懸浮液的制備

用生理狀態(tài)一致的單細(xì)胞或單孢子懸浮液，使細(xì)胞均勻接觸誘變劑，減少分離性表型延遲現(xiàn)象的發(fā)生，并防止長出不純菌落。表型延遲:誘變劑通常僅作用于某一單鏈的某一序列。因此，突變后的性狀無法反映當(dāng)代的表型，而要通過DNA的復(fù)制和細(xì)胞分裂后才表現(xiàn)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落。這種遺傳型雖已突變，但表型卻要經(jīng)DNA復(fù)制、分離和細(xì)胞分裂后才表現(xiàn)出來的現(xiàn)象。懸浮液可以用生理鹽水(物理誘變)或緩沖液(化學(xué)誘變)制備，以減少pH值的變化造成的影響。為了確定懸浮液的濃度，一般真菌孢子或酵母菌細(xì)胞的濃度大約為106個/ml左右為宜。放線菌孢子或細(xì)菌不超過108個/ml。2、誘變育種中的幾個原則第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種2、誘變育種中的幾個原則(3)選擇簡便有效的誘變劑

(1)物理誘變劑

包括非電離輻射的紫外線、激光和離子束等，能夠引起電離輻射的X射線、γ射線和快中子等。紫外線(UV)操作最簡便，波長在250～270nm處誘變效果最好，在260nm左右的紫外線被核酸強(qiáng)烈吸收，引起DNA結(jié)構(gòu)變化。其作用機(jī)制：①DNA鏈或氫鍵的斷裂②DNA分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)。③核酸與蛋白質(zhì)的交聯(lián)；④胞嘧啶的水合物作用；⑤形成胸腺嘧啶二聚體：光復(fù)活作用暗修復(fù)作用第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種2、誘變育種中的幾個原則②化學(xué)誘變劑

常用的有甲基磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、氮芥、亞硝基胍、甲基亞硝基脲(NMU)等。后兩種因有顯著的誘變效應(yīng)，故稱之為“超誘變劑”。③艾姆氏試驗

由于生物的遺傳物質(zhì)都是核酸，故凡能使核酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的因素都可影響生物學(xué)功能。艾姆氏試驗(Amestest)是一種利用細(xì)菌營養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變來檢測環(huán)境或食品中是否存在化學(xué)致癌劑的簡便有效方法。(3)選擇簡便有效的誘變劑Ames試驗第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種2、誘變育種中的幾個原則艾姆氏試驗測定潛在化學(xué)致癌物的方法如下：①將不同濃度的試驗藥品與在肝臟中與酶接觸，經(jīng)代謝變化后才有誘變作用。②將上述混合物適當(dāng)保溫，以圓濾紙片吸取不同濃度的試樣制成試驗濾紙片。③以基本培養(yǎng)基倒成平板，將鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸缺陷型突變株涂布于平板上，再將不同濃度的濾紙放入平板中央，同時做一空白對照。④在基本培養(yǎng)基上濾紙片周圍長出的菌落即為養(yǎng)缺陷型的回復(fù)突變株，而營養(yǎng)缺陷型突變株在空白對照平板上濾紙片周圍未長菌落。分析計算試驗藥品是否具有誘變作用，以及最有效的誘變濃度。(3)選擇簡便有效的誘變劑③艾姆氏試驗證明Ames試驗重要性的應(yīng)用實例：國外曾開發(fā)了一種降低婦女妊娠反應(yīng)的藥物“反應(yīng)?！保捎谄渌幮э@著，在60-70年代十分流行，但隨后人們就發(fā)現(xiàn)畸形兒的出生率明顯增高，而且生產(chǎn)畸形兒的婦女大多曾服用“反應(yīng)?！保髞聿捎肁mes試驗發(fā)現(xiàn)這種物質(zhì)的確具有很強(qiáng)的致突變作用，因此這種藥物被禁止使用但如果能在這種藥物上市之前就進(jìn)行Ames試驗檢測，那么這種大量出生畸形兒的悲劇完全可以避免。第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種2、誘變育種中的幾個原則在育種工作中，常以殺菌率表示誘變劑的相對劑量。殺菌率的計算：取等量被處理菌體與未被處理菌體分別在完全培養(yǎng)基上培養(yǎng)，計數(shù)各自長出的菌落按下式計算：(4)確定最適的誘變劑量殺菌率=未被處理的菌落數(shù)-被處理的菌落數(shù)未被處理的菌落數(shù)×100%第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種2、誘變育種中的幾個原則（5）充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（6）利用和創(chuàng)造形態(tài)變異、生理變異與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo)

（7）設(shè)計高效篩選方案（8）創(chuàng)造新型篩選方法第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種3、突變株的篩選方法（1）抗藥性突變株的篩選

抗藥性基因為遺傳研究和育種工作重要的選擇性遺傳標(biāo)記，同時，有些抗藥菌株還是重要的生產(chǎn)菌種。梯度平板法是定向篩選抗藥性突變株的一種有效方法，通過制備瓊脂表面存在藥物濃度梯度的平板，在其上涂布誘變處理后的細(xì)胞懸液，經(jīng)培養(yǎng)后再從其上選取抗藥性菌落等步驟，就可定向篩選到相應(yīng)抗藥性突變株。在篩選抗代謝藥物的抗性菌株以取得相應(yīng)代謝物的高產(chǎn)菌株方面，此法能達(dá)到定向培育的效果。例如，異煙肼(商品名為雷米封)是吡哆醇的結(jié)構(gòu)類似物或代謝拮抗物，第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種圖6-4用梯度平板法定向篩選抗性突變株3、突變株的篩選方法第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種（2）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選

用途：遺傳重組的基因標(biāo)記菌種；氨基酸、維生素或堿基等物質(zhì)的生物測定試驗菌種；生物體內(nèi)合成氨基酸和核苷酸等物質(zhì)的代謝途徑①篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的三類培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基(MM)：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長所要的最低營養(yǎng)成分的組合培養(yǎng)基。完全培養(yǎng)基(CM)：凡可滿足一切營養(yǎng)缺陷型菌株營養(yǎng)需要的天然或半組合培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基(SM)：凡只能滿足相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型突變株生長需要的組合或半組合培養(yǎng)基。3、突變株的篩選方法第六章微生物的遺傳變異和育種第二節(jié)基因突變和微生物育種三、誘變育種3、突變株的篩選方法②篩選營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選方法一般要經(jīng)過4個環(huán)節(jié)：誘變、淘汰野生型(濃縮)、檢出(分離)和鑒定營養(yǎng)缺陷型檢出營養(yǎng)缺陷型：常用的有以下四種方法。（2）營養(yǎng)缺陷型突變株的篩選①夾層培養(yǎng)法②限量補(bǔ)充培養(yǎng)法③逐個檢出法④影印平板法第六章微生物的遺傳變異和育種一、原核生物的基因重組二、原核生物的基因重組第三節(jié)基因重組和雜交育種第六章微生物的遺傳變異和育種兩個不同性狀個體內(nèi)獨立基因組的遺傳基因，通過一定途徑轉(zhuǎn)移到一起，經(jīng)過遺傳分子間的重新組合，形成新的穩(wěn)定基因組的過程，稱為基因重組或遺傳重組，簡稱重組。與一般在細(xì)胞水平上進(jìn)行的雜交區(qū)別。真核微生物基因重組可通過有性雜交、準(zhǔn)性雜交來實現(xiàn)；原核微生物基因重組必須在特殊條件下進(jìn)行，即通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合、原生質(zhì)體融合和溶源轉(zhuǎn)變實現(xiàn)基因重組。第三節(jié)基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組第六章微生物的遺傳變異和育種微生物的遺傳基因可以通過以下5種途徑重組：①兩個不同性細(xì)胞或體細(xì)胞結(jié)合，促使整套染色體交換的基因重組，如真菌的有性雜交或準(zhǔn)性雜交。②細(xì)胞間不接觸，僅涉及到個別或少數(shù)基因的重組。例如受體細(xì)胞接受供體細(xì)胞內(nèi)抽提的DNA而進(jìn)行的基因重組(轉(zhuǎn)化)，以及供體細(xì)胞的基因通過噬菌體的攜帶轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞中進(jìn)行的基因重組(轉(zhuǎn)導(dǎo))。③細(xì)胞間暫時溝通，使供體菌的核基因組片段傳遞給受體菌④由噬菌體提供遺傳物質(zhì)，使寄主細(xì)胞獲得完整噬菌體的核酸的基因重組(溶源轉(zhuǎn)變)；⑤雙親細(xì)胞的原生質(zhì)體融合，促使部分染色體基因重組，如細(xì)菌、酵母菌、霉菌的原生質(zhì)體融合。第三節(jié)基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組第六章微生物的遺傳變異和育種原核微生物的基因重組方式主要有轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合。共同特點為：①片段性，僅一小段DNA序列參與重組；②單向性，即從供體菌向受體菌(或從供體基因組向受體基因組)作單方向轉(zhuǎn)移；③轉(zhuǎn)移機(jī)制獨特而多樣，如接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)等。第三節(jié)基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組(1)定義：處于自然或人工感受態(tài)的受體菌細(xì)胞直接吸收供體

菌的同源或異源的游離DNA片段，而獲得后者部分

遺傳性狀的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化子：通過轉(zhuǎn)化方式而形成的雜種后代。(2)轉(zhuǎn)化微生物的種類

原核微生物：肺炎鏈球菌、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、奈瑟氏球菌屬、根瘤菌屬、葡萄球菌屬、假單胞菌屬和黃單胞菌屬等；真核微生物：釀酒酵母、粗糙脈孢霉和黑曲霉等。在實驗室中常用的一些屬于腸道菌科的細(xì)菌，如E.coli等。（一）、轉(zhuǎn)化第六章微生物的遺傳變異和育種(3)感受態(tài)感受態(tài)：受體細(xì)胞最易接受外源DNA片段并能實現(xiàn)轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)。出現(xiàn)時間及感受態(tài)細(xì)胞所占比例和維持時間也不同。調(diào)節(jié)感受態(tài)的一類特異蛋白稱感受態(tài)因子。它是一種胞外蛋白，主要包括3種成分，即膜相關(guān)DNA結(jié)合蛋白、細(xì)胞壁自溶素和幾種核酸酶。(4)轉(zhuǎn)化因子轉(zhuǎn)化因子的本質(zhì)是離體的DNA片段。只有15kb左右的片段。第三節(jié)基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組第六章微生物的遺傳變異和育種（5）轉(zhuǎn)化過程

肺炎鏈球菌第三節(jié)基因重組和雜交育種一、原核生物的基因重組第六章微生物的遺傳變異和育種（6）轉(zhuǎn)染定義：用提純的病毒核酸(DNA或RNA)去感染其宿主細(xì)胞或其原生質(zhì)體，可增殖出一群正常病毒后代的現(xiàn)象。作為轉(zhuǎn)染的病毒核酸，不是作為供體基因的功能，被感染的宿主也決不是能