第四章 高效液相色譜

補(bǔ)充：儀器分析新聞1：今年2月4日，青島市民林某從菜市場(chǎng)買回3公斤葉子豐茂、色澤青綠的韭菜。晚上，一家人飽食了一頓自己包的韭菜餃子。誰(shuí)知，食后時(shí)間不長(zhǎng)，夫妻倆及2歲的女兒相繼出現(xiàn)腹痛、腹瀉、惡心嘔吐等癥狀，體質(zhì)虛弱的林妻渾身乏力、視物不清。經(jīng)醫(yī)護(hù)人員及時(shí)輸液、解毒處理，三人終于脫險(xiǎn)。據(jù)查，此為因食用含有大量殘留農(nóng)藥的韭菜而中毒。新聞2：家住成都跳蹬河南路小區(qū)的張雪梅女士元旦期間遇上了麻煩：新年第一天，她到跳蹬河農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)買回白菜燒湯喝，飯后全家人都出現(xiàn)不同程度的頭痛、嘔吐現(xiàn)象。疑云重重的她把沒(méi)吃完的菜拿到成華區(qū)農(nóng)技站去檢驗(yàn)，結(jié)果嚇了一大跳：原來(lái)殘留的甲胺磷農(nóng)藥每公斤小白菜高達(dá)35.12毫克，含量超出國(guó)家規(guī)定最大允許殘留量的3倍多！咱們討論一下：看到這篇報(bào)道有什么想法，應(yīng)該做些什么，如何避免這種情況的發(fā)生？討論結(jié)果：對(duì)蔬菜的殘留農(nóng)藥量進(jìn)行分析檢測(cè)再討論：那用什么方法呢？化學(xué)分析法行嗎？不能用化學(xué)分析法，為什么？蔬菜中農(nóng)藥的殘留量比較低；蔬菜中農(nóng)藥的種類比較多，定性定量困難通常使用儀器分析，借助特殊的儀器，比如色譜儀定義與區(qū)別儀器分析法是以測(cè)量物質(zhì)的物理或物理化學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)的分析方法。比化學(xué)分析方法：檢驗(yàn)速度快靈敏度高涉及領(lǐng)域興奮劑的英文詞是doping,源于非洲某部落的一種方言，原意是指使人興奮的高度。最早是在1963年由歐洲體育聯(lián)合會(huì)提出的。早在古希臘奧林匹克運(yùn)動(dòng)會(huì)時(shí)，人們就知道通過(guò)服用草藥、蘑菇及其他植物性飲料能發(fā)揮更大的運(yùn)動(dòng)潛能。一、體育（興奮劑）1.為什么運(yùn)動(dòng)員比賽時(shí)不能服用興奮劑?

食用興奮劑可以使自己不疲乏、累，保證了運(yùn)動(dòng)員在比賽時(shí)減少了體力的消耗。2.服用興奮劑對(duì)運(yùn)動(dòng)員在比賽時(shí)取得成績(jī)有多大的幫助?為什么?

興奮劑可以使人變的興奮，從而對(duì)運(yùn)動(dòng)員有減少體力消耗的作用。3.興奮劑是一和什么樣的藥物?它的真正名稱是什么?

有興奮作用的就叫興奮劑,大多都含氯安酮的,其中大麻也有興奮的作用.

4.服用興奮劑會(huì)不會(huì)有什么負(fù)作用?會(huì)不會(huì)產(chǎn)生依賴?

負(fù)作用一定會(huì)有的,例如虛脫疲勞過(guò)度等

5.興奮劑可不可以在藥店里買到?

大型的藥店能買到的,大多為精神科處方藥6.興奮劑對(duì)快速恢復(fù)體能有幫助嗎?

沒(méi)有7.是不是任何人都可以服用興奮劑?可以，可樂(lè)中也含有一定的興奮劑。

(1)刺激劑共計(jì)51種，是禁用藥物最多的一類。由于考慮到許多抗感冒、治鼻炎的藥物中都含有麻黃堿類物質(zhì)，因此現(xiàn)在對(duì)麻黃堿一類藥物作了量的限制。(2）麻醉劑9種。此外，對(duì)嗎啡增加了定量的要求，在尿液中超過(guò)1mg/L為陽(yáng)性。(3)阻斷劑20種(4）利尿劑14種。(5）蛋白同化制劑31種。(6)掩蔽劑指能夠破壞禁用物質(zhì)的排泄或能掩蓋尿樣中其他禁用物質(zhì)的藥物。

(7）抗雌激素制劑包括氯米芬等。該類藥物僅男性禁用。(8)肽類激素及其模擬物和類似物。這也是新禁用的類別。二、生活產(chǎn)品質(zhì)量（魚新鮮度、食品添加劑、農(nóng)藥殘留量）添加劑包括：防腐劑、增稠劑、著色劑、調(diào)味劑、抗氧化劑、乳化劑常見(jiàn)：山梨酸鉀、苯甲酸鈉三、法庭化學(xué)（DNA技術(shù)）法醫(yī)學(xué)研究方法分四類:醫(yī)學(xué)類、生物學(xué)類、化學(xué)類、物理類ICP質(zhì)譜儀

分析絕大部分的金屬元素和部分非金屬元素

島津GC-2010

氣相色譜儀HP-1100液相色譜儀X射線光電子能譜儀X射線熒光儀UV光譜儀日立F-4500熒光光譜儀掃描俄歇微探針簡(jiǎn)介俄歇電子具有特征性能量，其能量與釋放俄歇電子的原子中的電子轉(zhuǎn)移有關(guān)。俄歇電子的釋放是釋放特征性x射線的替代形式。

電子順磁共振儀熒光光譜儀LS-50B第四章高效液相色譜法回顧：色譜法概述一、色譜法的由來(lái)1．1906年由俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet創(chuàng)立

植物色素分離見(jiàn)圖示

2．現(xiàn)在：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析

固定相——除了固體，還可以是液體

流動(dòng)相——液體或氣體被分離組分——不再僅局限于有色物質(zhì)圖示固定相——CaCO3顆粒流動(dòng)相——石油醚

色帶二、色譜法定義、實(shí)質(zhì)和目的

定義：利用物質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)建立的分離、分析方法實(shí)質(zhì)：分離目的：定性分析或定量分析三、分類：1．按兩相分子的聚集狀態(tài)分：流動(dòng)相固定相類型液相色譜液體固體液-固色譜液體液體液-液色譜氣體固體氣-固色譜氣體液體氣-液色譜氣相色譜續(xù)前2．按操作形式分類：3．按分離機(jī)制分：

紙色譜薄層色譜柱色譜

分配色譜：利用分配系數(shù)的不同

吸附色譜：利用物理吸附性能的差異

離子交換色譜：利用離子交換原理

空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同三、色譜過(guò)程、分離原理及特點(diǎn)（一）色譜過(guò)程指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過(guò)程以吸附色譜為例見(jiàn)圖示

吸附→解吸→再吸附→再解吸→反復(fù)多次洗脫→被測(cè)組分分配系數(shù)不同→差速遷移→分離圖示吸附能力的差異→吸附能力弱的組分先流出；吸附能力強(qiáng)的組分后流出續(xù)前（二）色譜分離原理色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異，平衡分配可以用分配系數(shù)和分配比來(lái)衡量四、基本類型色譜法的分離機(jī)制基本概念：固定相（s）；流動(dòng)相（m）（一）吸附色譜法（二）分配色譜法（三）離子交換色譜法（四）空間排阻色譜法（一）吸附色譜法要求：固定相→吸附劑（硅膠或AL2O3）

具表面活性吸附中心分離機(jī)制：見(jiàn)圖示分離機(jī)制：各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心利用吸附劑對(duì)不同組分的吸附能力差異而實(shí)現(xiàn)分離圖示吸附→解吸→再吸附→再解吸→無(wú)數(shù)次洗脫→分開(kāi)（二）分配色譜法要求：固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶載體→惰性，性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)分離機(jī)制見(jiàn)圖示

分離機(jī)制利用組分在流動(dòng)相和固定相間溶解度差別實(shí)現(xiàn)分離圖示（三）離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹(shù)脂流動(dòng)相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物分離機(jī)制見(jiàn)圖示分離機(jī)制：

依據(jù)溶質(zhì)與離子交換劑親和力不同而實(shí)現(xiàn)分離圖示（四）空間排阻色譜法要求：固定相→多孔性凝膠流動(dòng)相→水或有機(jī)溶劑分離機(jī)制見(jiàn)圖示分離機(jī)制：利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性滲透實(shí)現(xiàn)分離圖示結(jié)論：四種色譜的分離機(jī)制各不相同，分別形成吸附平衡、分配平衡、離子交換平衡和滲透平衡K分別為吸附系數(shù)，分配系數(shù)，選擇性系數(shù)和滲透系數(shù)圖示第一節(jié)概述1、高效液相色譜高效在哪兒？2、給你一個(gè)色譜圖，你能標(biāo)出圖中所有的術(shù)語(yǔ)嗎3、色譜柱參數(shù)很重要，都包括了什么呢4、什么是分離度，怎樣能有理想的色譜分離效果1、高效液相色譜與經(jīng)典液相色譜方法的比較

高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時(shí)數(shù)小時(shí)。高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，柱效很高。可以在數(shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離。高靈敏度：檢測(cè)器靈敏度極高

UV—10-9g,熒光檢測(cè)器—10-11g。2、HPLC與GC差別相同：兼具分離和分析功能，均可以在線檢測(cè)主要差別：分析對(duì)象的差別和流動(dòng)相的差別（1）操作條件差別

GC：加溫操作

HPLC：室溫；高壓（液體粘度大，峰展寬?。?）流動(dòng)相差別GC：流動(dòng)相為惰性氣體組分與流動(dòng)相無(wú)親合作用力，只與固定相作用

HPLC：流動(dòng)相為液體流動(dòng)相與組分間有親合作用力，為提高柱的選擇性、改善分離度增加了因素，對(duì)分離起很大作用3、高效液相色譜儀流程圖1．貯液罐（濾棒，可濾去顆粒狀物質(zhì)）2．高壓泵（輸液泵）3．進(jìn)樣裝置4．色譜柱——分離5．檢測(cè)器——分析6．廢液出口或組分收集器7．記錄裝置4、HPLC的特點(diǎn)和應(yīng)用

“三高”“一快”“一廣”

高柱效——n=104片/米，柱效高高靈敏度高選擇性分析速度快應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）二、高效液相色譜儀簡(jiǎn)介

1.貯液瓶2.高壓輸液泵3.進(jìn)樣器4.色譜柱

5.檢測(cè)器6.記錄裝置基本構(gòu)造簡(jiǎn)介1貯液器

要求：（1）必須有足夠容積，以備重復(fù)分析使用（2）脫氣方便，能耐一定壓力（3）所用材質(zhì)對(duì)所用的溶劑是惰性的溶劑脫氣系統(tǒng)：為什么需要脫氣？防止在檢測(cè)器中產(chǎn)生氣泡，引起噪音。除去氧氣的影響?？刹捎茫撼暡摎庹婵占訜崦摎?輸液泵A、恒壓泵：氣動(dòng)放大泵B、恒流泵：目前普遍采用往復(fù)式恒流泵3梯度洗脫裝置低壓梯度裝置：混合后進(jìn)高壓泵高壓梯度裝置：進(jìn)高壓泵后再混合梯度洗脫裝置：

在分離過(guò)程中逐漸改變流動(dòng)相組成（溶劑極性、離子強(qiáng)度、pH等）或改變流動(dòng)相濃度的裝置。4進(jìn)樣裝置：六通進(jìn)樣閥是目前多采用的進(jìn)樣方式1）手動(dòng)進(jìn)樣器：目前最常用的為六通閥。由于進(jìn)樣量可由樣品管控制，因此進(jìn)樣準(zhǔn)確，重復(fù)性好，如圖。裝入樣品出口進(jìn)樣采樣環(huán)泵入溶劑進(jìn)色譜柱2）自動(dòng)進(jìn)樣器5色譜柱（區(qū)別體現(xiàn)在柱長(zhǎng)和內(nèi)徑）柱管材料：耐腐蝕耐壓，常用不銹鋼管內(nèi)徑：2.0、3.0、4.1、4.6mm長(zhǎng)度：5、10、15、25cm等固定相：顆粒細(xì)、圓、均一、剛性強(qiáng)

6控溫系統(tǒng)7檢測(cè)器要求：高靈敏、快響應(yīng)、寬線性、低噪音、小體積類型：A、通用檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器（RID）、蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）B、非通用型檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器（UVD）、熒光檢測(cè)器（FD）、電化學(xué)檢測(cè)器（ECD,如電導(dǎo)檢測(cè)器是離子色譜的通用型檢測(cè)器）紫外吸收檢測(cè)器(ultravioletdetector,UVD)：固定波長(zhǎng)紫外吸收檢測(cè)器：低壓汞燈提供固定254nm或280nm紫外光?？勺兌嗖ㄩL(zhǎng)檢測(cè)器：氘燈做光源，光柵分光光二極管陣列檢測(cè)器：鎢燈和氘燈組合光源，進(jìn)入檢測(cè)池的不是單色光，而是一段紫外波長(zhǎng)上的光。。折光指數(shù)檢測(cè)器（refractiveindexdetector,RID）：也稱為示差折光檢測(cè)器。溶液的折射率等于溶劑及其中所含各組分溶質(zhì)的折射率與其各自的摩爾分?jǐn)?shù)的乘積之和。RID是通用型的檢測(cè)器，但是靈敏度不高。RID不能用于梯度洗脫，必須在恒溫條件下使用。蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporativelight-scatteringdector,ELSD)恒定流速的色譜儀洗脫液——被高壓氣流霧化——進(jìn)入蒸發(fā)室（流動(dòng)相及低沸點(diǎn)的組分被蒸發(fā)）——剩下的高沸點(diǎn)組分的小液滴進(jìn)入散射池——光束穿過(guò)被散射——散射光被光電管接收形成電信號(hào)——電信號(hào)通過(guò)放大電路、模數(shù)轉(zhuǎn)換電路、計(jì)算機(jī)成為色譜工作站的數(shù)字信號(hào)——色譜圖。

熱學(xué)性質(zhì)：光聲檢測(cè)器熱透鏡和光熱偏轉(zhuǎn)檢測(cè)器8、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三、HPLC的特點(diǎn)速度快分辨率高靈敏度高柱子可反復(fù)使用第二節(jié)基本理論（一）色譜流出曲線和相關(guān)術(shù)語(yǔ)1、死時(shí)間t0流動(dòng)相通過(guò)色譜柱時(shí)間2、死體積V0柱中溶劑總體積（二）保留值3．保留時(shí)間tR：從進(jìn)樣開(kāi)始到某組分色譜峰頂（濃度極大點(diǎn)）的時(shí)間

即溶質(zhì)在色譜柱中的停留時(shí)間或溶質(zhì)流經(jīng)色譜柱所需要的時(shí)間。

4、保留體積

VR(ml)=tR(min)*Fc(ml/min)VR=Vm+KVs

K--平衡分配系數(shù),Vs--固定相體積,Vm=流動(dòng)相所占體積

溶質(zhì)在固定相中的濃度(ns/Vs)nsVmK=----------------------------------=----*----

溶質(zhì)在流動(dòng)相中的濃度(nm/Vm)nmVs

ns,nm溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的量(3)調(diào)整保留時(shí)間

tR′=tR-toVR’=VR–V0（三）色譜柱參數(shù)分配系數(shù)k1、相平衡參數(shù)容量因子k’2、柱選擇性參數(shù)（α）3、柱效參數(shù)分配系數(shù)K相平衡常數(shù)：指在一定溫度和壓力下，組分在色譜柱中達(dá)分配平衡后，在固定相與流動(dòng)相中的濃度比容量因子(k’)

固定相中的量(Ms)k′=------------------------流動(dòng)相中的量(Mm)

K=k′(Vo/Vs)VR=Vo+KVs=Vo+k′(Vo/Vs)Vs=Vo+k′Vo=Vo(1+k′)

tr=to(1+k′)k′=tR/to-1

k′越小，保留時(shí)間越短.相對(duì)保留值()

=tR'(2)/tR'(1)=k′(2)/k′(1)樣品中各組分分配系數(shù)和容量因子不等，也就是α≠1，是色譜分離的前提越大，分離效果越好柱效參數(shù)：塔板理論-色譜柱長(zhǎng)：L，虛擬的塔板間距離：H，色譜柱的理論塔板數(shù)：n，則三者的關(guān)系為：

n=L/H理論塔板數(shù)與色譜參數(shù)之間的關(guān)系為：有效塔板數(shù)和有效塔板高度

單位柱長(zhǎng)的塔板數(shù)越多，表明柱效越高。組分在tM時(shí)間內(nèi)不參與柱內(nèi)分配。需引入有效塔板數(shù)和有效塔板高度：三、分離度（五）分離度R(分辨率)相臨兩組分間峰頂間距離是峰底寬平均值的幾倍,衡量色譜分離條件優(yōu)劣的參數(shù)討論：例題1：

在一定條件下，兩個(gè)組分的調(diào)整保留時(shí)間分別為85秒和100秒，要達(dá)到完全分離，即R=1.5。計(jì)算需要多少塊有效塔板。若填充柱的塔板高度為0.1cm，柱長(zhǎng)是多少？解：α=100/85=1.18

n有效=16R2[α/(α—1)]2

=16×1.52×(1.18/0.18)2

=1547（塊）L有效=n有效·H有效

=1547×0.1=155cm

即柱長(zhǎng)為1.55米時(shí)，兩組分可以得到完全分離。例題2：

在塔板數(shù)為3600塊/米條件下，兩個(gè)組分的保留時(shí)間分別為12.2s和12.8s，計(jì)算分離度。要達(dá)到完全分離，即R=1.5，所需要的柱長(zhǎng)。解：分離度：塔板數(shù)增加一倍，分離度增加多少？［例3］有一根lm長(zhǎng)的柱子，分離組分1和2得到如圖18d5的色譜圖。圖中橫坐標(biāo)l為記錄筆走紙距離。若欲得到R=1．2的分離度，有效塔板數(shù)應(yīng)為多少？色譜柱要加到多長(zhǎng)？什么是速率理論速率理論有哪些重要參數(shù)什么是內(nèi)標(biāo)法，什么是外標(biāo)法四、速率理論-影響柱效的因素速率方程（也稱范.弟姆特方程式）:

H=A+B/u+C·u

H：理論塔板高度，u：載氣的線速度(cm/s)

減小A、B、C三項(xiàng)可提高柱效；存在著最佳流速；

A、B、C三項(xiàng)各與哪些因素有關(guān)？1.渦流擴(kuò)散項(xiàng)－A同種組分分子