大學(xué)生創(chuàng)新試驗結(jié)題報告書2013.5.7

材料與方法新型乳清蛋白功能基料的開發(fā)1前言1.1乳清蛋白概述1.1.1乳清蛋白簡介乳清蛋白（wheyprotein）是一種營養(yǎng)豐富的全價蛋白質(zhì)，作為干酪、干酪素等乳制品加工副產(chǎn)物，來源廣泛、價格低廉，含有多種必需氨基酸。大約70%～80%的乳清蛋白是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白這兩種小球蛋白。其他的蛋白成分包括凝乳乳清(大糖肽)、牛乳血清白蛋白、乳鐵轉(zhuǎn)移蛋白、免疫球蛋白、磷脂蛋白以及大量的生物活性因子和酶等1.1.2乳清蛋白的主要功能特性[2-3]有以下幾個方面：（1）溶解性：主要是通過乳清蛋白與水的相互作用表現(xiàn)出來的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的溶解性非常重要，它往往影響著蛋白質(zhì)的其它的功能性質(zhì)，其中受影響較大有起泡性、乳化勝和凝膠性等。影響蛋白質(zhì)溶解性的因素可以分為內(nèi)因和外因兩個方面，內(nèi)因主要包括蛋白質(zhì)的分子量大小、形狀、柔性、疏水性和親水性之比、電荷的排布等；外因則主要指外在條件如：pH值，體系的溫度，蛋白質(zhì)的種類，加工工藝參數(shù)，溶劑的種類和蛋白質(zhì)濃度大小等。（2）起泡性：乳清蛋白形成泡沫時有良好的表面活性作用，其良好的起泡性使乳清蛋白可以成為雞蛋清有效的替代品。尤其是低脂肪的乳清濃縮蛋白，擁有很好的泡沫膨脹性能，因而可以延長起泡時間。（3）乳化性：乳清蛋白有優(yōu)良的乳化性。乳清蛋白的每個分子同時含有親水基團(tuán)和疏水基團(tuán)兩種集團(tuán)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶解于水中時，親水性的基團(tuán)大多分布在外側(cè)，表現(xiàn)為良好的水溶性質(zhì)。在均質(zhì)中,乳清蛋白往往可以吸附在脂肪球的表面,形成比較穩(wěn)定的蛋白質(zhì)和脂界面。從而起到防止脂肪球聚集的作用。（4）涂層性：乳清蛋白作為一種可食用性膜?？梢杂脕硖岣弋a(chǎn)品的穩(wěn)定性，美化外觀，還可改善口感以及保護(hù)其獨特的風(fēng)味和香味。乳清蛋白膜還可以較好阻隔氧氣和水分，具有良好的香味隔絕性和釋放性能。（5）膠凝：乳清蛋白受熱能形成熱誘導(dǎo)性凝膠，并且可以保持大量的水分。在成膠作用的過程中，乳清蛋白還可以形成一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而將水分保留在其微小的空隙中。1.1.3乳清蛋白在食品中的應(yīng)用乳清蛋白豐富的營養(yǎng)組成及良好的功能特性，使其在食品加工中有廣泛的應(yīng)用：（1）乳制品中的應(yīng)用：在酸奶中添加一定量的乳清濃縮蛋白，能最大限度地防止益生菌在胃中遭到破壞，另外在腸道中還可以提高酶的活力。在脫脂和低脂的飲用型酸奶中，則往往會遇到風(fēng)味方面產(chǎn)生的問題，特別是當(dāng)產(chǎn)品含有水果時更易出現(xiàn)。乳清蛋白的膠凝性質(zhì)在干酪生產(chǎn)中具有廣泛的應(yīng)用。WPC的最大用途是在冰淇淋的生產(chǎn)中，它作為廉價的蛋白質(zhì)來源，還可用于替代脫脂乳粉降低產(chǎn)品的成本，賦予冰淇淋清新的乳香味。（2）在肉制品中的應(yīng)用：各種植物類蛋白是肉制品加工中的主要配料之一，現(xiàn)在面臨消費者需求的多元化選擇。在食品中添加乳清濃縮蛋白、乳清分離蛋白等乳源蛋白配料，可以賦予肉制品健康的形象和營養(yǎng)標(biāo)簽，引起了許多生產(chǎn)者和消費者的關(guān)注。把乳清蛋白用在肉制品行業(yè)，可以很好地發(fā)揮應(yīng)有的作用，體現(xiàn)良好的效果。（3）在運動類保健食品中的應(yīng)用：乳清蛋白具有易于消化的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，能提供額外能量，節(jié)約體內(nèi)蛋白質(zhì)，亮氨酸及異亮氨酸等支鏈氨基酸含量豐富。這對于運動員骨骸肌的能量供應(yīng)、肌肉合成以及延緩中樞疲勞均有極大的幫助。富含半膚氨酸和蛋氨酸。含谷氨酸，有助于肌糖元更新并防止因過度訓(xùn)練導(dǎo)致的免疫功能下降。是生物可利用鈣的良好來源，能減少運動期間發(fā)生骨折并防止雌性激素不足的女運動員發(fā)生骨質(zhì)流失。（4）在焙烤食品中的應(yīng)用：在面包、糕點等焙烤食品中，乳清蛋白可作為完全或部分替代品。在焙烤食品(面包、蛋糕和曲奇)生產(chǎn)中，乳清蛋白可以增大面包的體積、提高水分的含量，使面包芯更加柔軟。特別是添加鈣含量較低的乳清濃縮蛋白，這一效果則更為明顯。在蛋糕加工中，可用乳清濃縮蛋白代替雞蛋，能夠提高蛋白糊的硬度和粘度，從而有效地防止由膨松劑產(chǎn)生的CO2的逸出。在曲奇和軟質(zhì)曲奇加工中WPC除可作為雞蛋的替代物外，還可用于改善全脂和低脂曲奇的顏色和咀嚼性。另外乳清蛋白與乳糖混合可賦予食品均勻的狀態(tài)和較好的口味。（5）化妝品行業(yè)中的應(yīng)用：乳清蛋白營養(yǎng)物質(zhì)豐富，營養(yǎng)因子分布均衡，對美容有很大好處。β-Lg對黑色素產(chǎn)生的抑制作用和提高細(xì)胞膜抗氧化性的能力，使其在化妝品領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用前景。綜上可知，雖然乳清蛋白已在食品行業(yè)多個方面有所應(yīng)用，但多數(shù)是作為食品輔料在食品工業(yè)中應(yīng)用，其抗氧化功能在食品及其它行業(yè)應(yīng)用不多。因此，加強(qiáng)和改善乳清蛋白的功能特性，擴(kuò)大其作為添加劑及在其他領(lǐng)域的應(yīng)用將會大大提高乳清蛋白的應(yīng)用價值。1.2常見的蛋白質(zhì)改性方法及特點目前，國內(nèi)外已采用很多方法改善蛋白質(zhì)的功能特性，主要有酶法改性、化學(xué)改性、物理改性和基因工程改性等[4]，均是通過改變?nèi)榍宓鞍椎姆肿哟笮?、結(jié)構(gòu)、氨基酸組成和順序、表面靜電荷的分布和疏水基團(tuán)等，從而達(dá)到增強(qiáng)或改善其功能特性的目的。1.2.1酶法改性酶法改性是指通過將特定的酶作用于蛋白質(zhì)，使其發(fā)生水解或交聯(lián)來改變蛋白結(jié)構(gòu)，從而起到改善蛋白質(zhì)功能特性的作用。乳清蛋白的酶法改性通常采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶和堿性蛋白酶等對蛋白質(zhì)進(jìn)行水解，還可以利用轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對蛋白質(zhì)進(jìn)行酶法交聯(lián)。對蛋白質(zhì)進(jìn)行有限酶解，能夠改善其功能性質(zhì)(溶解性，乳化性和起泡性)。酶可以部分降解乳清蛋白的多肽骨架，增加其分子內(nèi)或分子間交聯(lián)，從而改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。Asselin研究發(fā)現(xiàn)用胃蛋白酶以及堿性蛋白酶水解乳清蛋白，酶解產(chǎn)物的抗原性降低[5]。沈浥使用胰蛋白酶水解乳清蛋白，水解后的產(chǎn)物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，這是由于在水解過程中抗氧化肽的生成[6]。蛋白酶通過類蛋白反應(yīng)(Plasteilireaction)可使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，產(chǎn)生具有良好流變學(xué)性質(zhì)的聚合物，這在質(zhì)構(gòu)化食品中非常有用。酶法改性過程中采用蛋白酶處理乳清蛋白，酶解產(chǎn)物雖然也具有較強(qiáng)的抗氧化活性[7]，但同時會導(dǎo)致大量苦味物質(zhì)的生成，嚴(yán)重影響產(chǎn)品風(fēng)味，給生產(chǎn)加工帶來不便。具有反應(yīng)條件溫和、速度快、反應(yīng)完全、副產(chǎn)物少和專一性強(qiáng)等特點，是當(dāng)今研究蛋白質(zhì)改性最為重要的改性技術(shù)之一。1.2.2化學(xué)改性化學(xué)改性是指在蛋白質(zhì)中添加化學(xué)試劑，從而使一部分肽鍵斷開，或者引入其它功能基團(tuán)。利用蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的化學(xué)活性不同，可以選擇性地將某些基團(tuán)轉(zhuǎn)化成相關(guān)衍生物，從而改善其功能特性，如溶解性、乳化性、疏水性、凝膠性及其他性質(zhì)等?；瘜W(xué)改性的實質(zhì)是改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、靜電荷、疏水基團(tuán)來影響其功能特性。需要使用化學(xué)試劑，這樣會產(chǎn)生一些毒副作用，目前普遍不采用。乳清蛋白的化學(xué)改性主要是通過對蛋白分子中氨基酸殘基的側(cè)鏈基團(tuán)(例如賴氨酸殘基的εWoo通過磷酸化得到的β-乳球蛋白凝膠，比同樣條件下的天然β-乳球蛋白形成的凝膠穩(wěn)定性提高了30%[8]。乳清蛋白的磺化是通過亞硫酸鹽與二硫鍵發(fā)生反應(yīng)來改變蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，提高其乳化性和消化性。該方法能裂解二硫鍵，對二硫鍵和或半胱氨酸殘基具有很高的特異性，因此對其它氨基酸的生物利用率影響不大，對肽和蛋白質(zhì)不存在副反應(yīng)[9]。Medrano將葡萄糖和乳糖引入β-乳球蛋白后得到的產(chǎn)物，起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有提高[10]。化學(xué)改性由于徹底改變了分子的結(jié)構(gòu)，改性后的產(chǎn)物性質(zhì)通常有較大程度的改善，但是在此過程中除糖基化作用是在加熱條件下不添加其它化學(xué)試劑發(fā)生外，其它方法均需添加一定的化學(xué)試劑，反應(yīng)過程中往往產(chǎn)生毒副作用，不適合作為食品輔料使用。因此，糖基化將是蛋白質(zhì)化學(xué)改性的一個重要方向。1.2.3物理改性蛋白質(zhì)的物理改性主要是指通過加熱、冷凍、高壓、電場、聲場、機(jī)械作用、低劑量輻射及添加小分子雙親物質(zhì)等物理手段來改善蛋白質(zhì)的功能特性方法[11]。加熱會導(dǎo)致乳清蛋白變性，可影響它的天然狀態(tài)和穩(wěn)定性。溫和熱處理可以在一定范圍提高乳清蛋白的起泡性，而高溫處理反而使其起泡性有所降低[12]。這是因為低溫加熱時，部分乳清蛋白分子展開，而導(dǎo)致疏水性氨基酸殘基的暴露，使其能在水氣界面很好的定位[13]。Anet采用不同強(qiáng)度的超聲處理乳清蛋白，發(fā)現(xiàn)高強(qiáng)度的超聲通過改變蛋白的溫度和導(dǎo)電性而影響蛋白的溶解性及泡沫性質(zhì)等功能特性，而低強(qiáng)度的超聲對其溶解性及泡沫性質(zhì)影響不大[14]。Meza研究發(fā)現(xiàn)冷凍處理使未加熱的乳清蛋白凝膠的粘性范圍變大，但是同樣條件下加熱的的乳清蛋凝膠的粘性范圍反而變小，可能是由于冷凍處理對凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化[15]。物理改性一般只改變蛋白的高級結(jié)構(gòu)，具有加工費用低、耗時少、無毒副作用、對蛋白營養(yǎng)價值破壞小的優(yōu)點，缺點是改性范圍窄，大多集中在表面性質(zhì)上，同時可能會造成蛋白的溶解性等功能特性降低。1.3蛋白質(zhì)糖基化的原理及方法1.3.1蛋白質(zhì)糖基化的原理基于Maillard反應(yīng)機(jī)理的蛋白質(zhì)糖基化，是指通過糖與蛋白質(zhì)的α或ε-氨基共價連接而形成糖基化蛋白的過程，屬于蛋白質(zhì)的化學(xué)改性范疇。Maillard反應(yīng)又稱非酶褐變（Non-enzymaticBrowning），是由法國生物化學(xué)家LouisCamilleMaillard在1912年發(fā)現(xiàn)，1953年JohnHodge等正式命名此反應(yīng)為Maillard反應(yīng)。反應(yīng)歷程可分為三個階段，即反應(yīng)初期、中期和末期[16-18]。(1)初期階段：碳水化合物的醛基與蛋白質(zhì)的氨基進(jìn)行縮合反應(yīng)形成糖基化產(chǎn)物（Shiff堿），再經(jīng)環(huán)化形成相應(yīng)的N-取代醛糖基胺，經(jīng)Amadori重排形成Amadori化合物。第一階段基本上沒有色素和風(fēng)味物質(zhì)的形成；(2)中期階段：Amadori化合物在中間階段進(jìn)行的反應(yīng)，主要取決于體系的pH值，當(dāng)pH≤7時，Amadori化合物發(fā)生1,2-烯醇化反應(yīng)而形成糠醛（Furfural）或羥甲基糠醛(Hydromethyl-furfural)，當(dāng)pH＞7，Amadori化合物發(fā)生2,3-烯醇化反應(yīng)，產(chǎn)生還原酮類和一類裂解產(chǎn)物。所有這些產(chǎn)物都具有較高的活性，進(jìn)一步參與反。此階段生成的雜環(huán)類化合物對己醛氧化有較強(qiáng)的抑制作用[19]，而還原酮則具有還原能力和鰲合作用[20(3)末期階段：在反應(yīng)末期，成環(huán)、脫水、重排、異構(gòu)等一系列反應(yīng)均在進(jìn)行，在最終反應(yīng)階段，高級Maillard反應(yīng)階段形成的眾多活性中間體，又可繼續(xù)與氨基酸反應(yīng)，最終都形成含氮的棕色聚合體，統(tǒng)稱為類黑素(Mlanoidin)。類黑素分為分子量低于1000Da和達(dá)100000Da兩類有色物質(zhì)。在食品加工特別是熱處理工藝中，形成的類黑素不僅直接影響著食品的風(fēng)味、色澤和質(zhì)地，而且具有較強(qiáng)的抗氧化作用[21-221.3.2蛋白質(zhì)糖基化的方法制備方法主要有兩種，包括干熱方法和濕熱方法。近年來還出現(xiàn)了有機(jī)溶劑濕熱法、微波輔助濕熱法等其他糖基化方法。1.3.2.1干熱制備方法干熱糖基化方法首先由日本Yamaguchi大學(xué)的Kato教授[提出[23]，通過控制自發(fā)的美拉德反應(yīng)來實現(xiàn)，多用于蛋白質(zhì)和多糖之間的反應(yīng)。主要包括以下幾個步驟：（1）將蛋白質(zhì)和多糖按一定的比例溶解在選定pH值的緩沖溶液里（或去離子水中）；（2）分散均勻后進(jìn)行冷凍干燥；（3）冷凍干燥好的樣品在一定的溫度（一般50-60℃）和相對濕度（一般用飽和KBr維持在79%或飽和KI維持在65%的相對濕度）下反應(yīng)。干熱方法需要進(jìn)行前處理，反應(yīng)時間相對相對較長，對反應(yīng)條件的控制較為嚴(yán)格，，在反應(yīng)過程中可能會產(chǎn)生不溶性的大分子物質(zhì)，在反應(yīng)過程中很難進(jìn)行過程化控制；但反應(yīng)后測定方便，且由于溫度適中，反應(yīng)前后顏色變化不是特別大，在食品工業(yè)中應(yīng)用范圍較廣。1.3.2.2濕熱方法相對簡單，將蛋白質(zhì)和多糖按一定的比例溶解在選定pH值的緩沖溶液里（或去離子水中），取一定量配好的溶液置于密閉的設(shè)備中，在一定溫度下油?。ɑ蛩。┘訜岱磻?yīng)。濕熱方法主要用于蛋白質(zhì)與單糖或雙糖之間的反應(yīng)，在較短時間內(nèi)即可發(fā)生程度較深的反應(yīng)，反應(yīng)周期短，但是褐變嚴(yán)重，生成的產(chǎn)物顏色較深，可能會限制其在食品中的應(yīng)用。1.3.2.3近幾年來，對于糖基化方法的改進(jìn)研究較多。齊軍茹研究了有機(jī)溶劑濕熱法對大豆分離蛋白和葡聚糖的糖基化改性，產(chǎn)物的功能特性（如乳化性、溶解性、熱穩(wěn)定性）與大豆分離蛋白相比得到了明顯的提高[24]；管軍軍利用了微波輔助濕熱法進(jìn)行了大豆分離蛋白和乳糖、可溶性淀粉改性的可行性研究，對反應(yīng)的工藝條件、機(jī)理、接枝物的理化性質(zhì)、機(jī)構(gòu)及功能特性等方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[25]；王金水運用超聲波輔助濕熱法研究了小麥蛋白分別和阿拉伯膠、麥芽糊精的糖基化反應(yīng)[26]。利用改進(jìn)后的糖基化方法、反應(yīng)時間和產(chǎn)物的功能特性都有相應(yīng)提高，但是這些新的糖基化方法和傳統(tǒng)的方法一樣仍舊難以實現(xiàn)大分子的蛋白質(zhì)和多糖的過程化控制，并且所利用的微波、有機(jī)溶劑、超聲波等條件對于實現(xiàn)工業(yè)化、規(guī)?；纳a(chǎn)實踐均有一定難度。1.4.乳清蛋白的糖基化研究進(jìn)展近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，糖基化作用可以有效的改善乳清蛋白的功能特性。國外在利用糖基化共價修飾技術(shù)改善乳清蛋白功能特性方面的研究較早，Kitabatake等以葡萄糖酸和6-O--半乳糖-D-葡萄糖酸作為糖基供體，對-乳球蛋白進(jìn)行糖基化反應(yīng)，結(jié)果表明合成的糖基化蛋白在天然-乳球蛋白的等電點pH值時，其溶解度有明顯的提高，而且隨著糖基化程度的提高，糖基化蛋白的熱穩(wěn)定性逐漸提高[27]，但未對其它的功能特性（如乳化、凝膠特性等）進(jìn)行深入研究。Hattori分別將氨基葡聚糖、殼聚糖等陽離子低聚糖引入β-乳球蛋白，研究結(jié)果表明β-乳球蛋白-多糖共價復(fù)合物的乳化活性較β-乳球蛋白有所提高，抗原性和免疫原性均比β-乳球蛋白低[28]。Akhtar等人研究發(fā)現(xiàn)，在酸性條件下，乳清蛋白-葡聚糖共價復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性和乳清蛋白相比，有一定提高[29]。Yuanxia等人研究在一定條件下阿洛糖以及兩種食用糖（葡萄糖和果糖）對a-乳白蛋白性質(zhì)的影響。對三種α-乳白蛋白糖基化產(chǎn)物進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過阿洛糖修飾的糖基化產(chǎn)物具有較強(qiáng)的四唑鹽（XTT）還原能力和ABTS自由基清除能力，但并未對其它糖類的糖基化產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)進(jìn)行研究[30]。Beatriz等研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)殼聚糖修飾的β-乳球蛋白在干熱反應(yīng)的前2天，pH值為4條件下的乳化活性和抗菌性均有提高，之后下降[31]。Bongkosh等研究了β-乳球蛋白和硫酸葡聚糖的復(fù)合物在中性條件下的熱穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)在pH5.6–6.2之間，較低濃度硫酸葡聚糖的條件下，β-乳球蛋白的熱穩(wěn)定性得到改善[32]。Medrano將葡萄糖和乳糖引入β-乳球蛋白后得到的產(chǎn)物，起泡性和泡沫穩(wěn)定性均有提高，但并未對其它性質(zhì)進(jìn)行研究[10]。國內(nèi)也有一些學(xué)者對乳清蛋白的糖基化產(chǎn)物進(jìn)行了研究。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院蘆晶，布冠好等人對乳清蛋白-殼聚糖復(fù)合物的功能特性進(jìn)行了一系列的研究，指出復(fù)合物的溶解性，熱穩(wěn)定性及乳化性質(zhì)在一定的H離子濃度下，一定的鹽離子濃度下和乳清蛋白相比有一定程度的提高[33]。鄭喆等研究表明乳清蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物的溶解性和熱穩(wěn)定性明顯改善[34]。劉春波等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)糖基化反應(yīng)能夠明顯改善乳清蛋白-乳糖復(fù)合物的乳化性和乳化穩(wěn)定性[35]。以上研究表明，糖基化反應(yīng)可以改善乳清蛋白的一些功能特性，如：溶解性、乳化性、熱穩(wěn)定性等性質(zhì)。但對于糖基化產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)研究較少，且不同種類糖的乳清蛋白糖基化產(chǎn)物的抗氧化性質(zhì)并未有系統(tǒng)的研究。1.5抗氧化能力的檢測方法檢測物質(zhì)的抗氧化活性強(qiáng)弱有多種測定方法，本文主要介紹下面幾種。1.5.1自由基清除能力的檢測方法1.5.1.11,1-二苯基-2-三硝基苯肼DPPH法是一種簡單，方便，易于操作，靈敏，可靠的方法。DPPH是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，含有一個單電子，在517nm處有特征吸收峰，其乙醇水溶液呈深紫色。加入被測樣品后，被測樣品清除DPPH自由基而引起吸光值的減少，根據(jù)清除程度反映其抗氧化能力的強(qiáng)弱。另外，因為該自由基只有一個單電子，也可以應(yīng)用電子自旋共振法來檢測。對于不同的抗氧化劑，其抗氧化能力可根據(jù)清除50%原始DPPH濃度所需抗氧化劑量(IC50)1.5.1.2ABTS（2,2'-Azinobis-ABTS（2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽)與過氧化物酶(例如高鐵肌紅蛋白)和氫過氧化物在一起時形成藍(lán)綠色ABTS+?陽離子自由基，該法是以ABTS這種水溶性的自由基引發(fā)劑為顯色劑。向溶液加入被測物質(zhì)，如果該物質(zhì)中存在抗氧化成分，則該物質(zhì)會與ABTS+?發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色，從而通過光吸收值的下降程度反映抗氧化能力，結(jié)果多表示為達(dá)到一定濃度測試物質(zhì)相當(dāng)?shù)目寡趸芰λ枰腡rolox的濃度，所以也把該方法稱為TEAC(Troloxequivalentantioxidantcapacity)法[42]。1.5.1羥自由基清除能力的測定，可以采取多種方法[43]，主要包括：電子自旋共振法外、比色法（水楊酸法、鐵氧化鄰二氮菲法、脫氧核糖法、萃取—催化氧化光度法）、化學(xué)發(fā)光法、熒光法（羥－對苯二甲酸熒光法、Ce3+熒光法）等。1.5.1基本原理：由于自由基帶有未成對電子特點，使它具有很多正常分子所不具備特性，如自由基都具有吸磁性，這是自由基最大特點之一。由此，產(chǎn)生研究自由基一種特殊儀器一電子自旋共振譜儀，簡稱ESR儀。利用ESR儀能很容易區(qū)別測定出多種不同自由基，對于反應(yīng)活性高、壽命短的自由基的直接測定法，目前就可用ESR法[44]。1.5.2FRAP(Ferricreducingabilityofplasma)測定FRAP方法即三價鐵離子還原法，由Benzie提出，該方法的原理是基于氧化還原反應(yīng)的比色法?？梢园逊敲缚寡趸瘎┛醋鬟€原劑，它能將氧化物質(zhì)還原來達(dá)到抗氧化的目的。在較低pH值環(huán)境下，三價復(fù)合物Fe3+-二吡啶三亞嗪(ferric-tripyridyl-triazine,Fe3+-TPTZ)可被抗氧化劑還原成二價鐵的形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并于593nm處產(chǎn)生最大的光吸收，在Fe3+-TPTZ過量的時，藍(lán)色物質(zhì)的生成量就可以反映待測樣品的還原能力，即物質(zhì)總抗氧化能力[451.5.3脂質(zhì)過氧化檢測方法1.5.3脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物有丙二醛(malondialdehyde，MDA)，MDA可破壞蛋白質(zhì)等生物大分子，造成機(jī)體老化和多種疾病的發(fā)生，其含量與多種疾病的發(fā)生及年齡的增長呈正相關(guān)，性質(zhì)比較穩(wěn)定，便于檢測。因此，測定MDA的含量，在一定程度上反映了脂質(zhì)過氧化損傷的程度，是目前比較認(rèn)可的反映脂質(zhì)過氧化的指標(biāo)。硫代巴比妥酸試驗是將2-硫代巴比妥酸和脂類的氧化產(chǎn)物丙二醛作用，能夠生成一種粉紅色的化合物，該化合物在532nm處有最大吸光值，即為TBA值。丙二醛被稱為硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thriobarbituricacidreactivesubstances，TBARS)，TBA值與其含量呈化學(xué)計量關(guān)系，由于抗氧化劑能夠抑制TBARS的生成，故其抑制率可以用來衡量抗氧化劑對脂質(zhì)過氧化的抑制作用，TBA法常用于檢測被測樣品是否對生物體系(如紅細(xì)胞、脂蛋白、組織勻漿、肝微粒體、肝線粒體、肝細(xì)胞等)1.5.3油脂中含有多種不飽和脂肪酸類。油脂受熱時，就會發(fā)生氧化反應(yīng)等一系列得化學(xué)變化，從而使油脂產(chǎn)生變質(zhì)。所以測定氧化反應(yīng)中過氧化物的含量，可以間接地反應(yīng)抗氧化劑的活性強(qiáng)弱。油脂穩(wěn)定性的常用測定方法是檢測油脂在氧化過程中的過氧化值的大小。過氧化值的測定通常采用傳統(tǒng)的化學(xué)分析法：用淀粉作為指示劑，采用硫代硫酸鈉滴定被氧化的碘化鉀的量作為指標(biāo)。1.5.3不飽和脂肪酸在其氧化過程中可以形成共軛雙鍵，共軛雙鍵能夠吸收波長處在230～235nm的紫外光，具有抗氧化作用的物質(zhì)能夠延長形成共扼雙鍵的時間。利用抗氧化劑的這種性質(zhì)可以測定抗氧化劑的活性大小。該法適用于對純脂的過氧化研究，非脂質(zhì)過氧化會干擾檢測[46]。1.6課題研究的意義及研究內(nèi)容1.6.1立題意義乳清蛋白是一種營養(yǎng)豐富的全價蛋白質(zhì)，適合作為食品加工的基料，但是其某些不良的理化特性限制了其應(yīng)用范圍，因此，加強(qiáng)和改善乳清蛋白的功能特性，擴(kuò)大其在食品及其他領(lǐng)域的應(yīng)用，成為國內(nèi)外科學(xué)家們研究的熱點。目前，國內(nèi)外已采用很多方法改善蛋白質(zhì)的功能特性，主要有酶法、化學(xué)法、物理法和基因工程法?；瘜W(xué)法主要應(yīng)用琥珀?；?、磷酸化，脫氨基等作用，需要使用化學(xué)試劑，這樣會產(chǎn)生一些毒副作用，目前普遍不采用；酶法采用蛋白酶處理乳清蛋白，酶解反應(yīng)會導(dǎo)致大量苦味物質(zhì)的生成，嚴(yán)重影響產(chǎn)品風(fēng)味；物理法主要研究集中在蛋白質(zhì)的熱處理、擠壓、蒸煮等方面，可導(dǎo)致乳清蛋白的溶解性等功能特性降低；基因工程法是通過重組蛋白質(zhì)的合成基因來改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)，可能存在潛在的安全危害。糖基化反應(yīng)修飾技術(shù)可改善乳清蛋白的功能特性，與化學(xué)和酶法改性等方法相比，糖基化反應(yīng)修飾技術(shù)不需化學(xué)試劑，安全性較高，可極大改善乳清蛋白的乳化性、溶解性及熱穩(wěn)定性等功能特性。但是，利用糖基化反應(yīng)修飾技術(shù)，提高乳清蛋白抗氧化活性的研究相對較少，缺少相應(yīng)的基礎(chǔ)理論研究，亟待闡明乳清蛋白糖基化反應(yīng)的抗氧化機(jī)制。本課題擬以乳清分離蛋白為研究對象，利用不同類型的還原糖與乳清蛋白發(fā)生糖基化反應(yīng)，制備出具有強(qiáng)抗氧化活性的乳清蛋白糖基化產(chǎn)物。利用熒光光譜以及電泳等分析技術(shù)，研究乳清蛋白糖基化反應(yīng)特性，闡明糖基化反應(yīng)修飾后的乳清蛋白的結(jié)構(gòu)與抗氧化活性的相關(guān)性，為新型、天然抗氧化劑在食品中應(yīng)用提供技術(shù)支撐。本課題所采用的濕熱制備方法簡便易行、易于控制、成本較低。因此，本課題的研究具有很高的理論研究價值和實際應(yīng)用意義，也為乳清蛋白的利用和食品工業(yè)中抗氧化劑的來源提供了一條新途徑。2材料與方法2.1試驗材料2.1.1原料和主要試劑試劑與原料名稱生產(chǎn)單位或購買單位十二烷基磺酸鈉（SDS）Sigma公司，美國鄰苯二甲醛（OPA）Sigma公司，美國2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl(DPPH)Sigma公司，美國乳清蛋白分離物(WPI)北京MilkyWay商業(yè)公司核糖北京索萊寶科技有限公司半乳糖上海市藍(lán)季科技發(fā)展有限公司乳糖天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司氫氧化鈉天津市東正精細(xì)化學(xué)試劑廠磷酸氫二鈉天津市博迪化工有限公司鐵氰化鉀天津市博迪化工有限公司磷酸二氫鈉天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司鹽酸天津市耀華化學(xué)試劑有限責(zé)任公司脲西隴化工股份有限公司甲醇天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所無水乙醇天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司過硫酸鉀天津市凱通化學(xué)試劑有限公司三氯化鐵天津市雙船化學(xué)試劑廠β-巰基乙醇天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所三氯乙酸上海凌峰化學(xué)試劑有限公司以上藥品除特殊說明外均為分析純2.1.1儀器和設(shè)備名稱生產(chǎn)廠家UV-2401PC紫外可見分光光度計日本島津公司F-4500型熒光分光光度計日本日立公司GL-21M離心機(jī)上海市離心機(jī)械研究所KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司pH計賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司AL-104精密電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司DK-8B電熱恒溫水浴鍋上海精宏實驗設(shè)備有限公司電子恒溫油浴鍋江蘇金壇市億通電子有限公司漩渦混合器上海琪特分析儀器有限公司凍干機(jī)德國CHRIST2.2試驗方法2.2.1糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的制備將糖和乳清蛋白按照一定的比例制成溶液放在帶塞玻璃試管內(nèi)，在一定的起始pH值和一定溫度下，油浴反應(yīng)一定時間取出樣品，測定其pH值，-20℃儲存?zhèn)溆谩?.2.2褐變程度的測定參照Ajandouz等人[47]的方法，并略作修改。將待測樣品采用蒸餾水進(jìn)行12倍稀釋，測定其在420nm條件下的吸光值；同時將待測樣品在420nm測定基礎(chǔ)上采用蒸餾水進(jìn)行5倍稀釋，測定其在294nm條件下的吸光值。2.2.3游離氨基的測定采用OPA方法，參照Oyaizu等人[48]的方法，并略作修改。100mL鄰苯二甲醛（OPA）試劑含：50mL濃度為0.1mol/L硼酸鹽緩沖液，5mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的SDS溶液，80mgOPA（溶于2mL甲醇），200μL-巰基乙醇。取樣品液100μL（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%）和3mLOPA試劑混合，室溫暗處反應(yīng)5min后，340nm處測其吸光值。以L-亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)物，按上述方法繪制出亮氨酸濃度與吸光值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，根據(jù)測定樣品的吸光值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得出樣品中的游離氨基濃度。2.2.4還原能力測定參照Oyaizu的方法[49]，并略作修改。取樣品0.5mL（現(xiàn)將樣品配成1%的溶液），加入2.5mL磷酸鹽緩沖液(濃度為0.2mol/L，pH值為6.6)和2.5mL的1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻。再將混合物在50℃下水浴保持20min后急速冷卻，加入2.5mL的10%的三氯乙酸溶液，然后將混合物在3000r/min下離心10min。取2.5mL上層清液，加入2.5mL蒸餾水和0.5mL的0.1%的氯化鐵溶液2.2.5DPPH自由基清除能力的測定參照Saiga的方法[50]，并略作修改。將樣品配成20g/L的質(zhì)量濃度，取樣品液1.0mL及4.0mL濃度為0.1mmol/L的DPPH乙醇溶液（體積分?jǐn)?shù)為95%），混勻，室溫下避光反應(yīng)30min。用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇溶液作參比，于517nm測定吸光值。根據(jù)下式計算每種樣品液對DPPH自由基的清除率：清除率=(1－)×式中：Ai為加樣品液后DPPH溶液的吸光值；Aj為樣品液的吸光值；Ac為未加樣品液時DPPH溶液的吸光值。2.3試驗設(shè)計2.3.將乳清蛋白和3種糖類（核糖、半乳糖、乳糖）分別按1:1（質(zhì)量比）的比例溶于純凈水，制成總固形物質(zhì)量濃度為60g/L的溶液，調(diào)節(jié)起始pH值為8。在油浴溫度分別為75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃的條件下反應(yīng)3小時。將制備好的樣品迅速冷卻至室溫，測定pH值，冷凍貯存?zhèn)溆谩?.3.將乳清蛋白和3種糖類（核糖、半乳糖、乳糖）按質(zhì)量比分別為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3（糖/乳清蛋白）的比例溶于純凈水，制成總固形物質(zhì)量濃度為60g/L的溶液，調(diào)節(jié)起始pH值為8。在油浴溫度為90℃的條件下反應(yīng)3小時。將制備好的樣品迅速冷卻至室溫，測定pH值，冷凍貯存?zhèn)溆谩?.3.將乳清蛋白和3種糖類（核糖、半乳糖、乳糖）分別按1:1（質(zhì)量比）的比例溶于純凈水，制成總固形物質(zhì)量濃度為60g/L的溶液，調(diào)節(jié)起始pH值分別為7、8、9、10、11、12。在油浴溫度為90℃的條件下反應(yīng)3小時。將制備好的樣品迅速冷卻至室溫，測定pH值，冷凍貯存?zhèn)溆谩?.3.在前三部分試驗的基礎(chǔ)上，研究不同的反應(yīng)時間對乳清蛋白糖基化反應(yīng)特性的影響。將乳清蛋白和3種糖類（核糖、半乳糖、乳糖）分別按1:1（質(zhì)量比）的比例溶于純凈水，制成總固形物質(zhì)量濃度為60g/L的溶液，調(diào)節(jié)起始pH值分別為9。油浴溫度為95℃的條件下分別在0、0.5、1、2、3、4、5h取樣。將制備好的樣品迅速冷卻至室溫，測定pH值，冷凍貯存?zhèn)溆谩?.3.選取不同時間條件下制取的核糖-WPI、半乳糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI4種糖基復(fù)合物，進(jìn)行一定濃度的稀釋，研究其電泳譜圖及熒光強(qiáng)度的變化。2.3.在上述試驗的基礎(chǔ)上，我們選取核糖-WPI、半乳糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI4種糖基復(fù)合物，研究底物濃度和體系pH值對糖基復(fù)合物抗氧化活性的影響，為其在實踐中應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。其中在研究pH值對糖基復(fù)合物抗氧化活性的影響中，溶劑分別為：醋酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH5)；磷酸酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH6-8)；碳酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH9-10)本部分的試驗樣品取自2.2.3.選取BHA、Vc兩種常用的食品抗氧化劑，采用3種抗氧化檢測方法測定2.32.4統(tǒng)計方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS13.0軟件，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n=3）。畫圖采用Origin75軟件。3結(jié)果與分析3.1乳清蛋白糖基化反應(yīng)的動力學(xué)研究3.1.1溫度對乳清蛋白復(fù)合物褐變程度及抗氧化活性的影響3.1.1.1溫度對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物褐變程度的影響一般來說，反應(yīng)產(chǎn)物的顏色是糖基化反應(yīng)程度的重要表觀標(biāo)志，且反應(yīng)程度與顏色正相關(guān)。在糖基化反應(yīng)過程中，420nm和294nm處的吸光值來監(jiān)測反應(yīng)的褐變程度。420nm處的吸光值反映了糖基化反應(yīng)程度的大小，吸光值越大，說明其最終反應(yīng)程度越大，反之則較小。而294nm處的吸光值主要反映糖基化反應(yīng)中間產(chǎn)物的顏色，在一定程度上反映了糖基化的程度。將原反應(yīng)液進(jìn)行12倍稀釋，測定反應(yīng)后的復(fù)合物在420nm處的吸光值；在420nm測定液基礎(chǔ)上5倍稀釋，測定其在294nm的吸光值。測定結(jié)果如表3-1（A）和（B）所示。表3-1（A）WPI及其糖基化復(fù)合物在420nm處的吸光值Tab.3-1（A）Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA42075°C80°C85°C90°C95°C100°CWPI0.082±0.001a0.082±0.002a0.088±0.004a0.089±0.003a0.094±0.002a0.099±0.003a核糖-WPI0.173±0.001a0.303±0.001b0.468±0.003c0.538±0.002d1.095±0.004e1.463±0.004f半乳糖-WPI0.072±0.001a0.080±0.003a0.106±0.001b0.110±0.001c0.191±0.002d0.270±0.003e葡萄糖-WPI0.062±0.002a0.072±0.003a0.080±0.002b0.089±0.002b0.101±0.002c0.146±0.002d果糖-WPI0.070±0.002a0.067±0.002a0.085±0.004b0.097±0.003c0.117±0.003d0.169±0.002e乳糖-WPI0.064±0.002a0.056±0.003a0.071±0.001a0.082±0.004b0.085±0.002b0.105±0.001c菊粉-WPI0.102±0.001a0.095±0.004a0.112±0.001b0.126±0.002c0.136±0.003c0.138±0.003c注：分別對不同溫度下的每組數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。a=0.05；字母在同一行數(shù)據(jù)中，相同表示差異不顯著，不同表示差異顯著。下同由表3-1（A）的方差分析的多重比較結(jié)果結(jié)果可知，單獨加熱WPI時，其420nm的吸光值隨溫度的升高變化不顯著(p>0.05)；核糖-WPI的吸光值隨反應(yīng)的溫度升高顯著增大(p<0.05)；半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI在75℃和80℃的吸光變化不顯著(p>0.05)，而當(dāng)反應(yīng)溫度升至85℃吸光值顯著增大(p<0.05)；乳糖-WPI和乳糖-WPI的吸光值在整個反應(yīng)過程中變化較小。由測定結(jié)果可知，多數(shù)糖基化復(fù)合物在75℃和80℃的吸光值變化不大，甚至略有下降。此后，吸光值隨著溫度的升高而增大。其中核糖-WPI吸光值隨溫度升高吸光值增幅最大，75℃加熱時的吸光值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其它復(fù)合物。其次分別為半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>菊粉-WPI>乳糖-WPI。單獨加熱WPI顏色變化很小。表3-1（B）WPI及其糖基化復(fù)合物在294nm處的吸光值Tab.3-1（B）Theabsorbancesat294nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA29475°C80°C85°C90°C95°C100°CWPI0.166±0.003a0.160±0.017a0.187±0.002b0.197±0.006b0.200±0.001b0.197±0.002b核糖-WPI0.425±0.001a0.599±0.005b0.793±0.002c0.816±0.005d1.499±0.011e1.814±0.022f半乳糖-WPI0.187±0.001a0.208±0.002b0.228±0.001c0.290±0.002d0.427±0.001e0.530±0.003f葡萄糖-WPI0.171±0.001a0.183±0.002a0.192±0.002b0.216±0.001c0.260±0.003d0.330±0.010e果糖-WPI0.186±0.007a0.183±0.006a0.216±0.005b0.232±0.007c0.284±0.057d0.356±0.005e乳糖-WPI0.174±0.001a0.171±0.007a0.203±0.005b0.207±0.006b0.222±0.006c0.229±0.007c菊粉-WPI0.202±0.006a0.175±0.007b0.222±0.006c0.223±0.006c0.226±0.004c0.236±0.005c由表3-1（B）的方差分析的多重比較結(jié)果可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，WPI的吸光值變化差異不顯著(p>0.05)；隨反應(yīng)溫度升高，核糖-WPI和半乳糖-WPI在294nm的吸光值差異顯著(p<0.05)；果糖-WPI和葡萄糖-WPI的吸光值在75℃和80℃的吸光值變化差異不顯著(p>0.05)，而當(dāng)反應(yīng)溫度升至85℃吸光值顯著增大(p<0.05)；乳糖-WPI在相鄰的兩個溫度范圍（75℃和80℃、85℃和90℃、95℃和100℃）的吸光值變化差異不顯著(p>0.05)；菊粉-WPI則在85-100℃加熱時吸光值變化不顯著(p>0.05)。由此可知，WPI及其它糖基復(fù)合物的吸光值隨溫度升高多數(shù)呈現(xiàn)上升趨勢。其中核糖-WPI的吸光值受反應(yīng)溫度影響最大，說明其中間產(chǎn)物顏色最深；其次分別為半乳糖-WP>果糖-WPI>葡萄糖-WPI。WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI不同糖基復(fù)合物的褐變程度不同，主要是因為參加反應(yīng)的糖的活性不同。據(jù)研究，還原糖的反應(yīng)活性為：醛基戊糖>醛基己糖>酮基己糖>二糖。由果糖得到的糖基復(fù)合物比葡萄糖的褐變程度大，可能是因為果糖比葡萄糖含有的開鏈結(jié)構(gòu)比例高的緣故[55]。3.1.1.2溫度對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物抗氧化性質(zhì)的影響1）溫度對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物還原能力的影響糖基化復(fù)合物具有一定的抗氧化作用[56]，而抗氧化效果的強(qiáng)弱與還原能力存在一定的聯(lián)系。該方法的測定是以測定的樣品是否為良好的電子供體為重要標(biāo)志，還原能力強(qiáng)的樣品往往是優(yōu)良的電子供體，測定樣品所供應(yīng)的電子能將Fe3+還原成Fe2+的同時，與自由基發(fā)生反應(yīng)，從而使自由基成為更穩(wěn)定的物質(zhì)。這樣就可以中斷自由基的連鎖反應(yīng)[57]。復(fù)合物在700nm處吸光值越大，表明其還原力越強(qiáng)。在不同反應(yīng)溫度條件下，不同類型糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的還原能力結(jié)果，見圖3-1所示。圖3-1不同溫度下WPI及其糖基化產(chǎn)物的還原能力Fig.3-1ThereducingpowerofWPIandglycosylatedWPIconjugatesatdifferenttemperature由圖3-1可以看出，WPI隨著反應(yīng)溫度的升高，還原能力幾乎沒有變化。而WPI復(fù)合物的還原能力則隨著溫度升高有不同程度的提高：其中核糖-WPI復(fù)合物的還原能力明顯優(yōu)于其它糖基復(fù)合物，75℃時的還原能力值已相當(dāng)于半乳糖-WPI在100℃時的1.8倍；半乳糖-WPI在100℃時的還原能力是75℃的4.3倍；果糖-WPI在100℃時的還原能力略高于葡萄糖-WPI，分別是其對應(yīng)75℃的4.5和3.6倍；乳糖-WPI在100℃反應(yīng)的還原能力仍較低，但相對于75℃提高了2.4倍；菊粉-WPI的還原能力則隨溫度的升高變化不大。由結(jié)果可知，糖基復(fù)合物還原能力強(qiáng)弱分別為核糖-WPI>半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI，核糖-WPI、半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI的還原能力隨溫度升高而增大，乳糖-WPI和菊粉-WPI的還原能力隨溫度變化平緩。除核糖-WPI外的其它糖基復(fù)合物，在75和80℃加熱時，還原能力變化不大。2）溫度對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響DPPH自由基經(jīng)常被用來衡量抗氧化劑的抗氧化活性。DPPH·是一種比較穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液呈紫色，該溶液在5l7nm處有最大吸收。當(dāng)自由基清除劑存在時，由于DPPH·的單電子被配對，使DPPH·濃度減小，從而導(dǎo)致其顏色由紫色變?yōu)辄S色，同時溶液在517nm波長處的吸光值變小[58]。清除劑可直接作用于DPPH·自由基，且反應(yīng)時間較短，操作簡便易行。在不同反應(yīng)溫度條件下，不同類型糖基化反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力結(jié)果，見圖3-2所示。圖3-2不同溫度下WPI及其糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力Fig.3-2TheDPPHradicalscavengingactivityofWPIandglycosylatedWPIconjugatesatdifferenttemperature由圖3-2可知，WPI及其糖基復(fù)合物的DPPH自由基清除能力隨溫度升高的變化情況可以分為3類：(1)核糖-WPI：該復(fù)合物在75℃反應(yīng)時已達(dá)到62.33%，此后隨溫度升高仍有所提高，和其它糖基復(fù)合物相比具有明顯的優(yōu)勢；(2)半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI和果糖-WPI：這3種復(fù)合物的DPPH自由基清除能力雖不及核糖-WPI，但在75℃時已具有40%以上的清除力，且隨著溫度的升高而不斷提高；(3)WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI：這3種物質(zhì)的DPPH自由基清除能力均較弱，最高不到40%，可能是由于乳糖、菊粉與WPI反應(yīng)較慢，在該實驗條件下并未生成具有較強(qiáng)抗氧化性質(zhì)的產(chǎn)物。從中可以看出，不同種類WPI糖基復(fù)合物的DPPH自由基清除能力隨溫度的升高提高幅度不大，溫度從75℃到100℃，葡萄糖-WPI清除能力提高最多，為原來的1.4倍。在相同溫度下反應(yīng)，核糖-WPI的清除能力最高，其次分別為半乳糖-WP>葡萄糖-WPI>果糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI。WPI和菊粉WPI的清除能力變化不大。3.1.2糖和WPI質(zhì)量比對糖基化褐變程度及抗氧化性質(zhì)的影響3.1.2.1質(zhì)量比對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物褐變程度的影響將原反應(yīng)液進(jìn)行12倍稀釋，測定反應(yīng)后物質(zhì)的420nm的吸光值；在420nm測定液基礎(chǔ)上5倍稀釋，測定294nm的吸光值。測定結(jié)果分別如表3-2（A）和（B）所示。表3-2（A）WPI及其糖基化復(fù)合物在420nm處的吸光值Tab.3-1（A）Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA4203:12:11:11:21:3WPI對照0.042±0.001a0.061±0.003b0.080±0.005c0.106±0.004d0.147±0.002e核糖-WPI0.480±0.009a0.622±0.004b0.799±0.004c0.789±0.004c0.701±0.009d半乳糖-WPI0.103±0.004a0.137±0.002b0.186±0.003c0.226±0.001d0.250±0.002e葡萄糖-WPI0.076±0.002a0.097±0.001b0.148±0.002c0.189±0.001d0.216±0.007e果糖-WPI0.099±0.002a0.111±0.001b0.147±0.002c0.189±0.005d0.210±0.001e乳糖-WPI0.060±0.001a0.081±0.001b0.121±0.004c0.156±0.001d0.180±0.003e菊粉-WPI0.067±0.003a0.064±0.003a0.107±0.011b0.143±0.003c0.147±0.004c由表3-2（A）中方差分析的多重比較結(jié)果可知，核糖-WPI的吸光值在質(zhì)量比1:1和1:2差異不顯著(p>0.05)，在其它質(zhì)量比差異顯著(p<0.05)；菊粉-WPI在質(zhì)量比3:1和2:1及1:2和1:3差異不顯著(p>0.05)；WPI及各糖基化復(fù)合物在420nm的吸光值隨WPI含量的提高差異顯著(p<0.05)。其中核糖-WPI復(fù)合物在質(zhì)量比為1：1時吸光值最大，且在相同條件下和其它糖基化復(fù)合物相比吸光值最大；半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI均隨著WPI含量的提高，吸光值也隨之升高。同樣條件下吸光值的大小依次為核糖-WPI>半乳糖-WP>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI。表3-2（B）WPI及其糖基化復(fù)合物在294nm處的吸光值Tab.3-2（B）Theabsorbancesat294nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA2943:12:11:11:21:3WPI對照0.079±0.003a0.102±0.003b0.161±0.003c0.215±0.004d0.249±0.003e核糖-WPI0.697±0.005a0.880±0.011b1.220±0.006c1.173±0.007d1.156±0.011e半乳糖-WPI0.178±0.002a0.243±0.002b0.324±0.006c0.372±0.008d0.409±0.005e葡萄糖-WPI0.131±0.002a0.168±0.003b0.248±0.004c0.305±0.002d0.329±0.010e果糖-WPI0.178±0.003a0.202±0.002b0.249±0.002c0.294±0.004d0.322±0.003e乳糖-WPI0.101±0.001a0.130±0.003b0.194±0.005c0.248±0.003d0.267±0.001e菊粉-WPI0.107±0.002a0.122±0.003b0.176±0.002c0.228±0.004d0.268±0.007e由表3-2（B）中方差分析的多重比較結(jié)果可知，WPI及糖基化復(fù)合物在294nm的吸光值隨WPI含量的提高差異顯著(p<0.05)。其中核糖-WPI在質(zhì)量比為1：1時吸光值最大；半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI、乳糖-WPI和菊粉-WPI隨著WPI含量的提高，吸光值也隨之升高。同樣條件下吸光值的大小依次為核糖-WPI>半乳糖-WP>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI。3.1.2.3質(zhì)量比對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物抗氧化性質(zhì)的影響1）質(zhì)量比對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物還原能力的影響將原反應(yīng)液進(jìn)行6倍稀釋，測定其還原能力，結(jié)果如圖3-3所示。圖3-3不同質(zhì)量比條件下WPI及其糖基化產(chǎn)物的還原能力Fig.3-3ThereducingpowerofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentmassratio由圖3-3可以看出，6種糖基復(fù)合物在糖和WPI質(zhì)量比為1：1時，還原能力達(dá)到最大。相同條件下，核糖-WPI的還原能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出其它糖基復(fù)合物；其次分別為半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI。除核糖-WPI外，質(zhì)量比對還原能力的影響不是很大。不同質(zhì)量比的糖基復(fù)合物的還原能力，以糖和質(zhì)量比為1：1為分界點，呈現(xiàn)先升高后降低的特點?？赡苁翘呛偷鞍自谫|(zhì)量1：1時反應(yīng)程度相對較大，因此還原能力最強(qiáng)。2）質(zhì)量比對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響在原反應(yīng)液基礎(chǔ)上6倍稀釋，測定其DPPH自由基清除能力，結(jié)果如圖3-4所示。圖3-4不同質(zhì)量比條件下WPI及其糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力Fig.3-4TheDPPHradicalscavengingactivityofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentmassratio由圖3-4可知，除菊粉-WPI外，其它糖基復(fù)合物均在質(zhì)量比為1：1時有最大的自由基清除能力；菊粉-WPI在質(zhì)量比為2：1時最高，且各種糖基復(fù)合物隨WPI含量的提高變化較小。相同條件下，核糖-WPI的自由基清除能力明顯高于其它糖基復(fù)合物。在質(zhì)量比為1：1時，清除率達(dá)到72.67%，是同等條件下半乳糖-WPI的1.6倍，菊粉-WPI的3.3倍。不同質(zhì)量比的條件下，DPPH自由基的清除能力以此為核糖-WPI>半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI。在不同糖和乳清蛋白質(zhì)量比的反應(yīng)條件下，6種糖基復(fù)合物的還原能力和DPPH自由基清除能力的變化趨勢基本一致，均是在質(zhì)量比1：1時達(dá)到最大值。3.1.3起始pH值對糖基化反應(yīng)特性及抗氧化性質(zhì)的影響3.1.3.1起始pH值對乳清蛋白糖基化復(fù)合物褐變程度的影響將原反應(yīng)液進(jìn)行24倍稀釋，測定反應(yīng)后物質(zhì)的420nm的吸光值；在420nm測定液基礎(chǔ)上5倍稀釋，測定294nm的吸光值。測定結(jié)果分別如表3-3（A）和（B）所示。3-3（A）WPI及其糖基化復(fù)合物在420nm處的吸光值Tab.3-3（A）Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA420789101112WPI0.067±0.004a0.065±0.003a0.065±0.003a0.063±0.002a0.065±0.003a0.076±0.004a核糖-WPI0.501±0.008a0.430±0.006b0.390±0.008c0.428±0.003b0.676±0.005e0.872±0.004f半乳糖-WPI0.112±0.005a0.108±0.001a0.132±0.001b0.208±0.003c0.532±0.005d0.719±0.006e葡萄糖-WPI0.072±0.002a0.066±0.001a0.083±0.003b0.119±0.002c0.315±0.007d0.680±0.008e果糖-WPI0.078±0.003a0.077±0.002a0.098±0.003b0.155±0.004c0.385±0.011d0.798±0.003e乳糖-WPI0.069±0.003a0.072±0.001a0.085±0.001b0.115±0.002c0.247±0.008d0.494±0.010e菊粉-WPI0.077±0.001a0.078±0.001a0.080±0.001a0.084±0.002a0.140±0.003b0.199±0.005c由表3-3（A）方差分析的多重比較結(jié)果可知，WPI在420nm處的吸光值隨起始pH值的升高差異不顯著(p>0.05)；核糖-WPI在420nm處的吸光值隨pH的變化差異顯著(p<0.05)，但是吸光值的大小呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI和乳糖-WPI的吸光值除在pH7和8的吸光值差異不顯著(p>0.05)外，隨著起始pH值的升高而顯著增加(p<0.05)；菊粉-WPI的吸光值隨著起始pH值升高到10以后顯著增加(p<0.05)。3-3（B）WPI及其糖基化復(fù)合物在294nm處的吸光值Tab.3-3（B）Theabsorbancesat294nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA294789101112WPI0.097±0.005a0.084±0.002a0.085±0.005a0.087±0.006a0.097±0.004a0.099±0.005a核糖-WPI0.661±0.009a

0.622±0.009b0.625±0.003b0.644±0.005c0.879±0.012d1.426±0.010e半乳糖-WPI0.195±0.009a0.182±0.004a0.204±0.001b0.263±0.006c0.641±0.002d1.115±0.017e葡萄糖-WPI0.124±0.002a0.119±0.005a0.146±0.004b0.184±0.004c0.463±0.004d1.249±0.007e果糖-WPI0.123±0.004a0.124±0ha0.161±0.004b0.229±0.004c0.548±0.012d1.530±0.030e乳糖-WPI0.103±0.002a0.105±0.002a0.144±0.002b0.161±0.002c0.272±0.006d0.679±0.014e菊粉-WPI0.108±0.002b0.100±0.001a0.102±0.001a0.111±0.002b0.184±0.005c0.215±0.004d由表3-3（B）方差分析的多重比較結(jié)果可知，WPI隨起始pH值的升高吸光值差異不顯著(p>0.05)；核糖-WPI的吸光值除在pH8和9其它差異顯著(p<0.05)；半乳糖-WPI、果糖-WPI和乳糖-WPI除在pH7和8之外，其它差異顯著(p<0.05)；葡萄糖-WPI在294nm處的吸光值隨pH的變化差異顯著(p<0.05)；菊粉-WPI在起始pH7-9的吸光值差異不顯著(p>0.05)；在pH10-12時吸光值差異顯著(p<0.05)，。由測定結(jié)果可知，起始pH7到8對糖基復(fù)合物的吸光度影響不大；pH由8到10，吸光度緩慢增加；pH到10以后，吸光度迅速增大。由此可知，堿性環(huán)境對糖基復(fù)合物褐變程度影響較大。3.1.3.2起始pH值對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物抗氧化性質(zhì)的影響1）起始pH值對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物還原能力的影響在原液基礎(chǔ)上稀釋12倍，測定其還原能力，結(jié)果如表3-4所示。表3-4不同起始pH條件下WPI及其糖基化產(chǎn)物的還原能力Tab.3-4ThereducingpowerofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentinitialpHA700789101112WPI0.034±0.003a0.036±0.004a0.035±0.005a0.042±0.008a0.088±0.003b0.135±0.005c核糖-WPI0.781±0.003a0.762±0.011a0.749±0.010b0.689±0.010c0.824±0.011d1.130±0.034e半乳糖-WPI0.186±0.006a0.223±0.006b0.238±0.003b0.291±0.006c0.619±0.012d1.015±0.015e葡萄糖-WPI0.156±0.011a0.178±0.005b0.197±0.001b0.231±0.003c0.475±0.011d1.022±0.021e果糖-WPI0.079±0.003a0.107±0.010b0.163±0.006c0.254±0.005d0.565±0.009e1.190±0.009f乳糖-WPI0.077±0.001a0.091±0.007b0.156±0.003c0.193±0.006d0.405±0.008e0.674±0.006f菊粉-WPI0.044±0.003a0.047±0.002a0.059±0.002b0.066±0.001b0.166±0.006c0.250±0.010d由表3-4可知，除核糖-WPI外，WPI及其它糖基復(fù)合物的還原能力隨著起始pH值的升高有不同程度的提高。WPI的還原能力在起始pH7-10之間差異不顯著(p>0.05)，在pH10-12之間顯著提高(p<0.05)；核糖-WPI的還原能力在pH7和8之間差異不顯著(p>0.05)，在pH8-12之間差異顯著(p<0.05)，且以pH值10為分界點，呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢；半乳糖-WPI和葡萄糖-WPI的還原能力在pH8-9之間差異不顯著(p<0.05)，在其它pH差異顯著(p<0.05)；果糖-WPI和乳糖-WPI的還原能力隨著起始pH值的升高顯著提高(p<0.05)；菊粉-WPI在7-8及9-10之間的還原能力差異不顯著(p>0.05)，在pH提高到11后，還原能力明顯提高(p<0.05)。其中，核糖-WPI的還原能力在起始pH值7-11時，明顯優(yōu)于其它糖基復(fù)合物；在起始pH12時，核糖-WPI、半乳糖-WPI、葡萄糖-WPI、果糖-WPI四種復(fù)合物的還原能力基本相當(dāng)；乳糖-WPI的還原能力逐步提高，菊粉-WPI的還原能力變化較小。由表中測定結(jié)果還可以得到如下結(jié)論：WPI及其糖基復(fù)合物在起始pH7-10之間，還原能力提高緩慢，而當(dāng)起始pH增至10以后，還原能力迅速提高。這可能是由于強(qiáng)堿性環(huán)境促進(jìn)了蛋白質(zhì)的分解，從而加速了糖基化反應(yīng)。2）起始pH值對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物DPPH自由基清除能力的影響在原液基礎(chǔ)上稀釋12倍，測定其DPPH自由基清除能力，結(jié)果如表3-5所示。表3-5不同起始pH值條件下WPI及其糖基化產(chǎn)物的DPPH自由基清除能力Tab.3-5TheDPPHradicalscavengingactivityofWPIandglycosylatedWPIconjugatesunderdifferentinitialpHIP（%）789101112WPI11.24±0.96a6.91±1.27b9.27±1.32c15.23±0.83d17.87±0.77e11.97±0.29a核糖-WPI82.73±0.99a76.59±1.41b71.49±0.55c51.41±1.38d30.01±0.72e34.48±0.72f半乳糖-WPI23.53±1.10a31.17±0.55b33.75±0.78c37.07±0.24d30.55±1.65b46.34±1.03e葡萄糖-WPI11.42±0.59a11.86±0.64a15.72±0.45b24.40±0.68c45.19±0.74d38.26±0.89e果糖-WPI21.54±0.94a24.05±0.73b35.44±0.32c53.33±1.38d49.23±0.46e45.03±0.62f乳糖-WPI10.86±1.18a9.33±0.57a18.11±1.10b31.67±0.88c47.58±0.89d44.90±0.97e菊粉-WPI4.91±0.63a6.08±0.68a9.59±0.51b13.04±1.02c26.70±0.84d8.36±0.77b由表中方差分析的多重比較結(jié)果可知，WPI在起始pH7-11之間反應(yīng)后的DPPH自由基清除能力差異顯著(p<0.05)，在起始pH7和12時差異不顯著(p>0.05)；核糖-WPI和果糖-WPI的自由基清除能力隨pH的變化差異顯著(p<0.05)；半乳糖-WPI除在起始pH8和11外，其它差異顯著(p<0.05)；葡萄糖-WPI和乳糖-WPI除在pH7和8外，在其它起始pH值時DPPH自由基清除能力差異顯著(p<0.05)；菊粉-WPI在起始pH9和11之間的清除能力差異顯著(p<0.05)。隨著起始pH值的升高，WPI及其糖基復(fù)合物的DPPH自由基清除能力并不表現(xiàn)出特定的規(guī)律。從表可以看出，核糖-WPI的DPPH自由基清除能力隨著起始pH的升高呈現(xiàn)下降趨勢，起始pH值為7時，清除率高達(dá)82.73%，而當(dāng)起始pH值升為12時，清除率只有34.48%，下降了58%；半乳糖-WPI的DPPH自由基清除能力在pH值為11時出現(xiàn)降低，之后升高；WPI及其它糖基復(fù)合物則在起始pH值12時出現(xiàn)DPPH自由基清除能力降低的現(xiàn)象。由測定結(jié)果可知，核糖-WPI的DPPH自由基清除能力隨著起始pH的升高呈現(xiàn)下降趨勢；半乳糖-WPI的DPPH自由基清除能力在pH值為11時出現(xiàn)降低，之后升高；WPI及其它糖基復(fù)合物則在起始pH值12時出現(xiàn)降低的特性。由此可知，較高的起始pH值環(huán)境，并不利于糖基化反應(yīng)產(chǎn)物DPPH自由基清除能力的提高。3.1.4反應(yīng)時間對糖基化反應(yīng)特性及抗氧化性質(zhì)的影響3.1.4.1反應(yīng)時間對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物褐變程度的影響將原反應(yīng)液進(jìn)行12倍稀釋，測定反應(yīng)后物質(zhì)的420nm的吸光值；在420nm測定液基礎(chǔ)上5倍稀釋，測定294nm的吸光值。測定結(jié)果分別如表3-6（A）和（B）所示。3-6（A）WPI及其糖基化復(fù)合物在420nm處的吸光值Tab.3-6（A）Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA4200(h)0.512345WPI0.124±0.010a0.125±0.002a0.124±0.003a0.124±0.001a0.125±0.004a0.123±0.004a0.124±0.003a核糖-WPI0.118±0.001a0.199±0.001b0.353±0.002c0.698±0.001d1.013±0.012e1.170±0.015f1.467±0.036g半乳糖-WPI0.125±0.002a0.133±0.002b0.157±0.002c0.211±0.002d0.270±0.002e0.314±0.002f0.364±0.002g葡萄糖-WPI0.126±0.002a0.124±0.001a0.130±0.002b0.159±0.002c0.194±0.002d0.214±0.002e0.238±0.002f果糖-WPI0.126±0.001a0.136±0.002b0.155±0.002c0.202±0.002d0.233±0.002e0.271±0.002f0.314±0.002g乳糖-WPI0.127±0.002a0.115±0.002b0.122±0.002c0.144±0.002d0.165±0.002e0.187±0.002f0.204±0.001g菊粉-WPI0.155±0.06a0.141±0.003a0.142±0.004a0.145±0.002a0.146±0.004a0.154±0.003a0.158±.0.005a由表3-6（A）方差分析的多重比較結(jié)果可知，WPI和菊粉-WPI在420nm處的吸光值隨反應(yīng)時間的增加差異不顯著(p>0.05)；葡萄糖-WPI的吸光值在加熱1-5h內(nèi)差異顯著(p<0.05)；其它糖基復(fù)合物在420nm處的吸光值隨反應(yīng)時間的增加差異顯著(p<0.05)。由表中測定結(jié)果可知，除WPI及菊粉-WPI外，多數(shù)糖基復(fù)合物在420nm的吸光值隨著反應(yīng)時間的增加而增大[64-65]。其中核糖-WPI的吸光值增幅最大，顏色最深，5h的吸光值是0h的12.4倍；六碳糖中半乳糖-WPI顏色最深，果糖-WPI和葡萄糖-WPI稍淺一些，反應(yīng)后的吸光值分別是0h的2.9倍，2.5倍和1.9倍；乳糖-WPI的吸光值升高較少，吸光值是反應(yīng)前的1.6倍，WPI和菊粉-WPI吸光值變化不大。420nm的吸光值依次為核糖-WPI>半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI，顏色也依次變淺。3-6（B）WPI及其糖基化復(fù)合物在420nm處的吸光值Tab.3-6（B）Theabsorbancesat420nmofWPIandglycosylatedWPIconjugatesA2940(h)0.512345WPI0.190±0.001a0.180±0.002b0.185±0.002c0.186±0.002c0.184±0.002c0.186±0.002c0.189±0.001a核糖-WPI0.172±0.001a0.393±0.001b0.660±0.003c1.107±0.004d1.433±0.004e1.559±0.004f1.845±0.004g半乳-WPI0.177±0.002a0.197±0.002b0.250±0.002c0.341±0.001d0.438±0.001e0.511±0.002f0.593±0.002g葡萄糖-WPI0.191±0.002a0.194±0.002a0.214±0.001b0.265±0.001c0.330±0.002d0.366±0.002e0.404±0.002f果糖-WPI0.186±0.001a0.220±0.001b0.257±0.001c0.333±0.002d0.383±0.002e0.445±0.003f0.504±0.002g乳糖-WPI0.178±0.002a0.167±0.001b0.193±0.001c0.239±0.002d0.253±0.002e0.267±0.002f0.283±0.003g菊粉-WPI0.193±0.001a0.192±0.002a0.191±0.002a0.201±0.002b0.202±0.002b0.214±0.001c0.220±0.002d由表3-6（B）方差分析的多重比較結(jié)果可知，WPI和菊粉-WPI在294nm處的吸光值隨反應(yīng)時間的增加差異不顯著(p>0.05)；葡萄糖-WPI的吸光值在加熱1-5h內(nèi)差異顯著(p<0.05)；其它糖基復(fù)合物在420nm處的吸光值隨反應(yīng)時間的增加差異顯著(p<0.05)。其中核糖-WPI的吸光值增幅最大，5h的吸光值是0h的10.7倍；六碳糖中依次為半乳糖-WPI、果糖-WPI和葡萄糖-WPI，反應(yīng)后的吸光值分別是0h的3.4倍，2.7倍和2.1倍；乳糖-WPI的吸光值升高較少，吸光值是反應(yīng)前的1.6倍；WPI和菊粉-WPI吸光值變化不大。由測定結(jié)果可知，大多糖基復(fù)合物在294nm處的吸光值都隨時間的增加而增大。其中核糖-WPI的吸光值增幅最大；其余依次為半乳糖-WPI>果糖-WPI>葡萄糖-WPI>乳糖-WPI>菊粉-WPI>WPI。3.1.4.2反應(yīng)時間對乳清蛋白及其糖基復(fù)合物游離氨基含量的影響以0h的WPI及糖和WPI的游離氨基酸含量為基準(zhǔn)，測定反應(yīng)后的游離氨基酸含量。以反應(yīng)后的游離氨基酸含量占0h的百分比表示。將原反應(yīng)液進(jìn)行12倍稀釋，測定游離氨基的變化，結(jié)果如圖3-5所示。圖3-5不同反應(yīng)時間條件下WPI及其糖基化產(chǎn)物的游離氨基酸含量Fig.3-5Thefreeaminogrou