基因工程制藥

第二章基因工程技術制藥10/18/20231一、概述---幾個概念基因工程技術？是將重組對象的目的基因插入載體，拼接后轉入新的宿主細胞，構建成工程菌，實現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進行復制和表達的技術。10/18/20232基因工程藥物？系指先確定對某種疾病具有預防和治療作用的蛋白質(zhì)，然后將控制該蛋白質(zhì)合成過程的基因分離、純化或進行人工合成，利用重組DNA技術加以改造，最后將該基因放入可以大量生產(chǎn)的受體細胞中不斷繁殖，并能進行大規(guī)模生產(chǎn)具有預防和治療這種疾病的蛋白質(zhì)，通過這種方法生產(chǎn)的新型藥物。一、概述---幾個概念10/18/20233基因工程藥物上游階段？主要是分離目的基因、構建工程菌（細胞）目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達。選擇基因表達主要考慮的是保證表達的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達的量和分離純化的難易。此階段的工作主要在實驗室內(nèi)完成。一、概述---幾個概念10/18/20234基因工程藥物下游階段？從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實驗室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，主要包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術，生物傳感器等一系列儀器儀表的設計和制造，電子計算機的優(yōu)化控制等。一、概述---幾個概念10/18/20235制備基因工程藥物的一般程序一、概述獲得目的基因組建重組質(zhì)粒構建基因工程菌（或細菌）培養(yǎng)工程菌除菌過濾半成品檢定包裝10/18/20236傳統(tǒng)制藥存在的問題許多在疾病診斷、預防和治療中有重要價值的內(nèi)源性活性物質(zhì)（如激素、細胞因子、神經(jīng)多肽、調(diào)節(jié)蛋白、酶類等人體活性多肽）以及某些疫苗，由于材料來源困難或者制造技術問題而無法研制出產(chǎn)品而付諸應用。從動物臟器中提取出來（比如動物腦垂體中的一些肽類激素，包括腎上腺皮質(zhì)激素、催產(chǎn)素起引產(chǎn)或催產(chǎn)作用，胃腸道類激素緩激肽等），也因造價太高，或來源困難而供不應求。一、概述10/18/20237傳統(tǒng)制藥存在的問題由于免抗原等緣故（由于酶的相對分子量較大，對人體可能具有抗原性，因此動物酶如作為注射用藥要經(jīng)過大量的藥理實驗），使他們在使用上受到限制。在提取過程中難免有病毒感染，因此還可能會對病人造成嚴重后果。一、概述10/18/20238基因工程技術的特點就是能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。它能從極端復雜的機體細胞內(nèi)取出所需要的基因，將其在體外進行剪切拼接、重新組合，然后轉入適當?shù)募毎M行表達，從而生產(chǎn)出比原來多數(shù)百、數(shù)千倍的相應的蛋白質(zhì)。一、概述10/18/20239基因工程技術的特點可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)，為臨床使用提供有效的保障；可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對其生理生化和結構進行深入的研究，從而擴大這些物質(zhì)的應用范圍；利用基因工程技術可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時存在的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進行改造；利用基因工程技術可以獲得新型化合物，擴大藥物篩選來源一、概述10/18/202310二、目的基因的獲得從染色體中直接分離純化目的基因極為困難。原核細胞不能直接克隆真核基因。來源于真核細胞的產(chǎn)生基因工程藥物的目的基因，是不能進行直接分離的，原因有二：10/18/202311二、目的基因的獲得Ⅰ逆轉錄法目的克隆真核基因常用的方法有逆轉錄法和化學合成法：cDNA序列不含內(nèi)含子10/18/202312二、目的基因的獲得1mRNA的純化利用mRNA的3’末端含有polyA的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dt）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度洗脫時，或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫下來，經(jīng)過兩次寡聚（dt）纖維素柱后，可得到較高純度的mRNA。10/18/202313二、目的基因的獲得2cDNA第一鏈的合成一般mRNA都帶有3‘-polyA，所以可用寡聚dT作為引物，在逆轉錄酶的催化下，開始cDNA鏈的合成。一次好的逆轉錄可使寡聚dT選出的mRNA有5%~30%被拷貝。10/18/202314二、目的基因的獲得

3cDNA第二鏈的合成先用堿解或RHase酶解的方法除去cDNA-mRNA雜交鏈中的mRNA鏈，然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈。雙鏈cDNA分子的大小常用變性瓊脂糖凝膠電泳進行測定。10/18/202315二、目的基因的獲得

4cDNA克隆用于cDNA的克隆載體有兩類：質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等）和噬菌體DNA（如λgt10、λgt10）等。根據(jù)重組后插入的cDNA是否能夠表達、能否經(jīng)轉錄和翻譯合成蛋白，又將載體分為表達型載體和非表達型載體。在DNA克隆操作中應根據(jù)不同的需要選擇適當?shù)妮d體。10/18/202316二、目的基因的獲得

5將重組體導入宿主細胞體外包裝的重組體感染受態(tài)宿主細胞。10/18/202317二、目的基因的獲得

6cDNA文庫的鑒定

cDNA文庫是指細胞中全部mRNA反轉錄成cDNA并被克隆的總各。根據(jù)重組體的表型進行篩選，主要有抗性基因失活法和菌落或噬菌斑顏色改變法。然后采取凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析法等方法進行進一步篩選和鑒定。10/18/202318二、目的基因的獲得

7目的cDNA克隆的分離和鑒定

從cDNA文庫分離特異性cDNA克隆，主要采用下列兩種方法：1核酸探針雜交法；2免疫反應鑒定法。10/18/202319二、目的基因的獲得

7目的cDNA克隆的分離和鑒定1核酸探針雜交法用層析和高分辨率電泳等技術純化微克量的目的蛋白質(zhì)，根據(jù)目的蛋白純品的氨基酸序列分析結果，人工合成相應的單鏈寡核苷酸作為探針，從cDNA文庫分離特異cDNA克隆。10/18/202320二、目的基因的獲得

7目的cDNA克隆的分離和鑒定2免疫反應鑒定在既無可供選擇的基因表性特征，又沒有合適探針的情況下，本法是篩選特異cDNA克隆的重要途徑。用表達載體構建的cDNA文庫，可利用免疫學方法分組逐一鑒定cDNA的表達產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應的特異cDNA克隆。

10/18/202321二、目的基因的獲得Ⅱ反轉錄-聚合酶鏈反應法目的克隆真核基因常用的方法有逆轉錄法和化學合成法：

1985年聚合酶鏈反應（PCR）創(chuàng)立后，人們將它與反轉錄方法結合起來得到一種新的合成cDNA的方法，即反轉錄-聚合酶鏈反應法。該方法是mRNA經(jīng)反應轉錄合成cDNA第一鏈，不需要再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR法進行擴增，特異性地合成目的cDNA鏈，用于重組、克隆。10/18/202322二、目的基因的獲得Ⅲ

化學法目的克隆真核基因常用的方法有逆轉錄法和化學合成法：較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學合成法獲得合成目的基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進行退火連接成較長的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。10/18/202323二、目的基因的獲得人工化學合成基因的限制：A不能合成太長的基因。最長50-60bp。只適用于克隆小分子肽的基因。B人工合成基因時，遺傳密碼的簡并會為選擇密碼子帶來困難，如用氨基酸順序推測核苷酸序列，得到的結果可能與天然基因不完全一致，易造成中性突變。C費用太高。10/18/202324三、目的基因的表達

基因表達是指結構基因在生物體中的轉錄、翻譯以及所有加工過程?；蚋咝П磉_研究是指外源基因在某種細胞中的表達活動，即剪切下一個外源基因片段，拼接到另一個基因表達體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達產(chǎn)物。10/18/202325三、目的基因的表達基因表達研究的主要問題：

基因表達產(chǎn)量表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性產(chǎn)物的生物學活性

表達產(chǎn)物的分離純化10/18/202326三、目的基因的表達①容易獲得較高濃度的細胞；②能利用易得廉價原料③不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素④發(fā)熱量低，需氧低，適當?shù)陌l(fā)酵溫度和細胞形態(tài)⑤容易進行代謝調(diào)控⑥容易進行DNA技術操作⑦產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率高，且易提取純化。一、宿主細胞的選擇10/18/202327三、目的基因的表達原核細胞真核細胞一、宿主細胞的選擇大腸桿菌枯草芽孢桿菌鏈霉菌酵母絲狀真菌哺乳動物細胞10/18/202328外源基因在大腸桿菌中的表達10/18/202329外源基因在大腸桿菌中的表達表達載體必須具備的條件1.載體能夠獨立的復制2.具有靈活的克隆位點和方便的篩選標記。且克隆位點應在啟動子序列后，以使克隆的外源基因得以表達3.具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別4.具有很強的阻遏子，使啟動子受到控制，只有當誘導時才能進行轉錄10/18/202330外源基因在大腸桿菌中的表達表達載體必須具備的條件5.具有很強的終止子，以便使RNA聚合酶集中力量轉錄克隆的外源基因，而不轉錄無關的基因同時很強的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定6.所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼AUG和SD序列，以便轉錄后能順利翻譯。10/18/202331外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的優(yōu)勢：全基因組測序，共有4405個開放型閱讀框架基因克隆表達系統(tǒng)成熟完善繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定被美國FDA批準為安全的基因工程受體生物10/18/202332外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌表達外源基因的劣勢：表達不存在信號肽，故產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物，提取困難缺乏對真核生物蛋白的復性功能缺乏對真核生物蛋白的修飾加工系統(tǒng)易引起免疫反應細胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素10/18/202333外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌作為表達外源基因受體菌的特征大腸桿菌作為外源基因的表達宿主，遺傳背景清楚，技術操作簡便，培養(yǎng)條件簡單，大規(guī)模發(fā)酵經(jīng)濟，因此備受遺傳工程專家的重視。目前大腸桿菌是應用最廣泛、最成功的高效表達體系，并常常作為高效表達研究的首選體系。10/18/202334外源基因在大腸桿菌中的表達外源基因在大腸桿菌中高效表達的原理啟動子終止子轉錄核糖體結合位點密碼子質(zhì)?？截悢?shù)翻譯10/18/202335外源基因在大腸桿菌中的表達啟動子10/18/202336外源基因在大腸桿菌中的表達啟動子Lac

表達系統(tǒng)以大腸桿菌lac操縱子調(diào)控機理為基礎設計、構建的表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控機理

具有多順反子結構，基因排列次序為：啟動子（lacP）-操縱基因（lacO）-結構基因（lacZ-lacY-lacA）

正調(diào)節(jié)因子CAP

負調(diào)節(jié)因子lac110/18/202337Lac

表達系統(tǒng)正調(diào)節(jié)因子CAPcAMP激活CAP，CAP-cAMP復合物與lac操縱子上專一位點結合后，能促進RNA聚合酶與-35、-10序列的結合，進而促進Plac介導的轉錄?；蚬こ讨惺褂玫膌ac啟動子均為抗葡萄糖代謝阻遏的突變型，即PlacUV510/18/202338Lac

表達系統(tǒng)LacUV5突變體Plac

UV5突變體能夠在沒有CAP存在的情形下非常有效地起始轉錄，受它控制的基因在轉錄水平上只受lac1

的調(diào)控，因此用它構建的表達載體在使用時比野生型Plac更易操作。10/18/202339Lac

表達系統(tǒng)負調(diào)節(jié)因子lac1在無誘導情形下，lac1基因產(chǎn)物形成四具體阻遏蛋白，與啟動子下游的操縱基因緊密結合，阻止轉錄的起始。10/18/202340Tac

表達系統(tǒng)

tac

啟動子是由trp的-35序列和lacUV5的-10序列拼接而成的雜合啟動子調(diào)控模式與lacUV5相似，但mRNA轉錄水平更高于trp

和lacUV5啟動子（Ptac=3Ptrp=11Plac），因此在要求較高基因表達水平的情況下，選用tac

啟動子比用lacUV5

啟動子更優(yōu)越。10/18/202341Lac、tac啟動子對宿主菌的要求在普通大腸桿菌中，Lac1阻遏蛋白僅能滿足細胞染色體上lac操縱子轉錄調(diào)控的需要。當多拷貝的lacO隨著帶有l(wèi)acUV5、tac啟動子的表達質(zhì)粒轉化進入大腸桿菌后，Lacl阻遏蛋白與lacO的比例顯著下降，無法保證每一個lacO都能獲得足夠的Lacl阻遏蛋白參與轉錄調(diào)控。表現(xiàn)為在無誘導物存在的情形下，lacUV5、tac

啟動子有較高的本地轉錄。10/18/202342Lac、tac啟動子對宿主菌的要求為了使以Lac、Tac表達具有嚴緊調(diào)控外源基因轉錄的能力，一種能產(chǎn)生過量的Lacl

阻遏蛋白的lacl

基因突變體laclq被應用于表達系統(tǒng)。大腸桿菌JM109等菌株的基因型均為lacq，常被選用為

Lac、Tac表達系統(tǒng)的宿主菌。但是這些菌株也只能對低拷貝的表達載體實現(xiàn)嚴緊調(diào)控，在使用高拷貝復制子的構建表達載體時，仍能觀察到較高水平的本底轉錄。

需在表達載體中插入lacq基因以保證有較多的Lacl阻遏蛋白產(chǎn)生。10/18/202343Lac、tac表達系統(tǒng)存在的問題IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）用于誘導lac、tac啟動子的轉錄，但由于IPTG本身具有一定的毒性。從安全角度，對表達和制備用于醫(yī)療目的的重組蛋白并不適合。一些國家規(guī)定在生產(chǎn)人用重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)工藝中不能使用IPTG解決方法

lac

和tac啟動子的轉錄受溫度嚴緊調(diào)控乳糖替代IPTG誘導lac

和tac

啟動子的轉錄10/18/202344Lac、tac表達系統(tǒng)存在的問題Lac

和tac

啟動子的轉錄受溫度嚴緊調(diào)控把阻遏蛋白Lacl的溫度敏感突變體lacl(ts)、lacq(ts)插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac

和tac啟動子的轉錄受到溫度嚴緊調(diào)控在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃

）時開放。用乳糖替代IPTG誘導lac

和tac

啟動子的轉錄乳糖在β-半乳糖苷酶作用下生成異乳糖，異乳糖具有誘導劑的作用這一過程涉及乳糖的轉運和和轉化，其效率受到多種因素的影響和制約，因此乳糖誘導的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導致菌體生理及生長特性變化。乳糖替代IPTG作為誘導劑的研究要與發(fā)酵工藝結合起來，才能顯示其良好的前景。10/18/202345外源基因在大腸桿菌中的表達啟動子Trp

表達系統(tǒng)以大腸桿菌trp

操縱子調(diào)控機理為基礎設計、構建的表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控機理色氨酸啟動子Ptrp受色氨酸-阻遏蛋白復合物的阻遏，轉錄呈基底狀態(tài)。在培養(yǎng)系統(tǒng)中去除色氨酸或者加入3-吲哚丙烯酸（IAA），變可有效地解除阻遏作用。

在正常的細菌培養(yǎng)體系中，除去色氨酸是困難的，因此基因工程中往往添加IAA誘導Ptrp

介導的目的基因表達。10/18/202346Trp

表達系統(tǒng)10/18/202347外源基因在大腸桿菌中的表達啟動子PL和PR

表達系統(tǒng)以λ噬菌體早期轉錄啟動子PL、PR為核心構建的表達系統(tǒng)在野生型λ

噬菌體中，PL、PR啟動子轉錄與否決定了λ

噬菌體進入了裂解循環(huán)還是溶源循環(huán)。10/18/202348PL和PR

表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理由λ噬菌體PE啟動子控制的cl基因的產(chǎn)物是PL、PR啟動子轉錄的阻遏物。cl

基因的產(chǎn)物在大腸桿菌宿主中的濃度取決于一系列宿主與噬菌體因子之間的錯綜復雜的平衡關系。由于通過細胞因子來控制cl

基因產(chǎn)物的產(chǎn)生和消失是相當困難的。因此PL、PR表達系統(tǒng)都選用溫度敏感突變體cl857(ts)的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL、PR啟動子的轉錄。

在較低溫度下（30℃）時以活性形式存在在較高溫度（42℃

）時失活脫落10/18/202349PL和PR

表達系統(tǒng)宿主菌中沒有cl基因產(chǎn)物，PL、PR啟動子的高強度直接轉錄，帶有PL或PR啟動子的表達載體在普通大腸桿菌中相當不穩(wěn)定對宿主菌的要求

用溶源化λ噬菌體的大腸桿菌作PL、PR啟動子表達載體的宿主菌N4830-1，POP2136等菌株已經(jīng)溶源化cl

857(ts)

λ噬菌體，可用作表達外源基因時的宿主菌。

把cl857(ts)基因組裝在表達載體上宿主菌選擇范圍更大10/18/202350PL和PR

表達系統(tǒng)存在的問題由于PL和PR表達系統(tǒng)誘導時不加化學誘導劑，成本又低廉，最初幾個在大腸桿菌中制備的藥用重組蛋白質(zhì)都采用PL或PR表達系統(tǒng)。缺陷在熱脈沖誘導中，大腸桿菌熱休克蛋白的表達也會被激活，其中一些是蛋白質(zhì)水解酶，有可能降解所表達的重組蛋白。

在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時，通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度提高到42℃需要較長的時間，這種緩慢的升溫方式影響誘導效果，對重組蛋白表達量有一定的影響。10/18/202351T7表達系統(tǒng)大腸桿菌T7噬菌體具有一套專一性非常強的轉錄體系，利用這一體系中的元件為基礎構建的表達系統(tǒng)稱為T7表達系統(tǒng)。10/18/202352T7表達系統(tǒng)

T7噬菌體基因1編碼的T7RNA聚合酶選擇性激活T7

噬菌體啟動子的轉錄。

T7RNA聚合酶活性高，其合成RNA的速度比大腸桿菌RNA聚合酶快5倍左右。并可以轉錄某些不能被大腸桿菌RNA聚合酶有效轉錄的序列。在細胞中存在T7RNA聚合酶和T7噬菌體啟動子的情形下，大腸桿菌宿主本身基因的轉錄競爭不過T7噬菌體轉錄體系，最終T7噬菌體啟動子控制的基因的轉錄達到很高的水平。10/18/202353T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理T7噬菌體啟動子的轉錄完全依賴于T7RNA聚合酶，因此T7RNA聚合酶的轉錄模式就決定了表達系統(tǒng)的調(diào)控方式?；瘜W誘導型溫度誘導型雙質(zhì)粒系統(tǒng)10/18/202354T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理化學誘導型噬菌體DE3是λ噬菌體的衍生株，一段含有l(wèi)acl、lacUV5啟動子和T7RNA聚合酶基因的DNA片段被插入其int

基因中用噬菌體DE3作為表達載體的宿主菌，調(diào)控方式為化學誘導型，類似于Lac表達系統(tǒng)。10/18/202355T7表達系統(tǒng)轉錄調(diào)控的機理溫度誘導型PL啟動子控制T7RNA聚合酶基因，通過熱誘導方式激發(fā)T7噬菌體啟動子的轉錄。這種方式可以使本底轉錄酶降到很低的水平，尤其適用于表達對大腸桿菌宿主有毒性的重組蛋白質(zhì)。10/18/202356T7表達系統(tǒng)存在的問題T7表達系統(tǒng)表達目的基因的水平是目前所有表達系統(tǒng)中最高的，但也不可避免出現(xiàn)在相對較高的本底轉錄，如果目的基因產(chǎn)物對大腸桿菌宿主有毒性，會影響細胞的生長。解決辦法之一因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上肽聚糖外，還能與T7RNA聚合酶結合抑制其轉錄的活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉化質(zhì)粒導入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉錄，但對誘導后目的的基因的表達水平無明顯影響。10/18/202357其他表達系統(tǒng)營養(yǎng)調(diào)控型采用大腸桿菌堿性磷酸酯酶基因phoA啟動子或甘油3‘-

磷酸轉移系統(tǒng)ugp啟動子構建表達載體。這兩個啟動子受在培養(yǎng)基中的無機磷（Pi）濃度調(diào)控（Pi﹥5mmol/L時抑制，Pi﹤1mmol/L時激活），具有較高的轉錄水平。10/18/202358其他表達系統(tǒng)糖原調(diào)控型采用的有大腸桿菌半乳糖轉移系統(tǒng)（mg1BAEC）mgl啟動或沙門氏菌阿拉伯糖基因araB啟動構建表達載體。這兩個啟動子受葡萄糖抑制，巖藻糖和阿拉伯糖是它們的誘導物。其調(diào)控機理類似于Lac表達系統(tǒng)。10/18/202359其他表達系統(tǒng)pH調(diào)控型采用大腸桿菌賴氨酸脫羧酶基因cadA

啟動子構建表達載體。

cadA啟動子受培養(yǎng)基中H+濃度，即pH值調(diào)控。（在

pH﹥8時抑制，pH﹤6時激活，pH=6時轉錄活力最高）。該表達系統(tǒng)要求菌體發(fā)酵溫度控制在27~30℃之間才能使目的基因得到穩(wěn)定的表達。10/18/202360其他表達系統(tǒng)溶氧調(diào)控型采用大腸桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因

pfl

啟動子，硝基還原酶基因nirB啟動子或透明顫菌血紅蛋白基因vgb

啟動子構建表達載體。這些啟動子中都含有對氧響應的調(diào)節(jié)因子

fnr的作用位點。在富氧條件下轉錄被抑制，在貧氧或微生物條件下轉錄被激活。10/18/202361其他表達系統(tǒng)溶氧調(diào)控型大腸桿菌GJ100有透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）啟動子控制下的T7RNA聚合酶基因表達質(zhì)粒，vgb

基因的轉錄是受環(huán)境溶氧濃度調(diào)控的，在貧氧條件下vgb

基因的啟動子被激活。因此，用大腸桿菌GJ100作為宿主時，表達系統(tǒng)調(diào)控方式為貧氧誘導型，菌體發(fā)酵時的溶氧濃度可以通過控制攪拌轉速和通氣量加以調(diào)節(jié)，與其他調(diào)控模式相比更適合于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過程。10/18/202362其他表達系統(tǒng)生物素調(diào)控型用大腸桿菌生物素操縱子及其調(diào)控區(qū)構建表達載體，而菌體生長過程中生物素會不斷消耗，當濃度到達2ng/ml以下時啟動子被激活。能夠在沒有外界的物理，化學信號的介入條件下自動誘導表達目的基因時這類表達載體的特點，其缺陷是不容易精確控制自動誘導的時刻。10/18/202363終止子強化轉錄終止的必要性外源基因在強啟動子的控制下表達，容易發(fā)生轉錄過頭現(xiàn)象，即RNA聚合酶滑過終止子結構繼續(xù)轉錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列，形成長短不一的mRNA混合物，過長轉錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達，其原因如下：轉錄產(chǎn)物越長，RNA聚合酶轉錄一分子mRNA所需的時間就相應增加，外源基因本身的轉錄效率下降。如果外源基因下游緊接有載體上的其它重要基因或DNA功能區(qū)域，如選擇性標記基因和復制子結構等，則RNA聚合酶在此處的轉錄可能干擾質(zhì)粒的復制及其它生物功能，甚至導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性。過長的mRNA往往會產(chǎn)生大量無用的蛋白質(zhì)，增加工程無謂的能量消耗。更為嚴重的是，過長的轉錄物往往不能形成理想的二級結構，從而大大降低外源基因編碼產(chǎn)物的翻譯效率。10/18/202364終止子強終止子的選擇與使用目前外源基因表達質(zhì)粒中常用的終止子是來自大腸桿菌

rRNA操縱子上的rrnT1T2以及T7噬菌體DNA上的TΦ。對于一些終止作用較弱的終止子，通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結構，以增強其轉錄終止作用。10/18/202365核糖體結合位點核糖體結合位點外源基因在大腸桿菌細胞中的高效表達不僅取決于轉錄啟動的頻率，而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關。大腸桿菌細胞中結構不同的mRNA分子具有不同的翻譯效率，它們之間的差別有時可高達數(shù)百倍。

mRNA翻譯的起始效率主要由其5’端的結構序列所決定，稱為核糖體結合位點（RBS）10/18/20236610/18/202367核糖體結合位點核糖體結合位點大腸桿菌核糖體結合位點包括下列四個特征結構要素：

位于翻譯起始密碼子上游的6-8個核苷酸序列5‘UAAGGAGG3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，他通過識別大腸桿菌核糖體小亞基中的16SrRNA3’端區(qū)域3‘AUUCCUCC5’

并與之專一性結合將mRNA定位于核糖體上，從而啟動翻譯；翻譯起始密碼子，大腸桿菌絕大部分基因以AUG作為閱讀框架的起始位點，有些基因也使用GUG或UUG作為翻譯起始密碼子

SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離及堿基組成基因編碼區(qū)5’端若干密碼子的堿基序列10/18/202368核糖體結合位點核糖體結合位點對外源基因表達的影響SD序列的影響一般來說mRNA與核糖體的結合程度越強，翻譯的起始效率就越高，而這種結合程度主要取決于SD（UAAGGAGG）序列與16SrRNA

的堿基互補性，其中以GGAG四個堿基序列尤為重要。對多數(shù)基因而言，上述四個堿基序列尤為重要。上述四個堿基中任何一個換成C或T，均會導致翻譯效率大幅度降低。10/18/202369核糖體結合位點對外源基因表達的影響SD序列與起始密碼子之間的序列影響

SD序列下游堿基若為AAAA或UUUU，翻譯效力最高；而CCCC或GGGG的翻譯效率則分別最高值的50%和25%。緊鄰AUG的前三個堿基成份對翻譯起始也有影響。對于大腸桿菌β-半乳糖苷酶的mRNA而言，在這個位置上最佳的堿基組合是UAU或CUU，如果用UUC、UCA或

AGG取代之，則酶的表達水平低20倍。

核糖體結合位點10/18/202370核糖體結合位點對外源基因表達的影響SD序列與起始密碼子之間的距離的影響

SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA

在核糖體上定位后，翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復合物結構中的P位，這是翻譯啟動的前提條件。在很多情況下，SD序列位于AUG之前大約七個堿基處，在此間隔中少一個堿基或多一個堿基，均導致翻譯起始效率不同程度的降低。

核糖體結合位點10/18/202371核糖體結合位點對外源基因表達的影響起始密碼子及其后續(xù)若干密碼子的影響大腸桿菌中的起始tRNA

分子可以同時識別AUG、GUG

和UUG三種起始密碼子，但其識別頻率并不相同，通常

GUG為AUG的50%，而UUG只及AUG的25%。除此之外，從AUG開始的前幾個密碼子堿基序列也至關重要，至少這一序列不能與mRNA的5‘端非編碼區(qū)形成莖環(huán)結構，否則便會嚴重干擾mRNA在核糖體上的準確定位。目前廣泛用于外源基因表達的大腸桿菌表達型質(zhì)粒上，均含有與啟動子來源相同的核糖體結合位點序列，序列和間隔是最佳的。

核糖體結合位點10/18/202372密碼子生物體對密碼子的偏愛性不同的生物，甚至同種生物不同的蛋白質(zhì)編碼基因，對簡并密碼子使用頻率并不相同，具有一定的偏愛性，其決定因素是：生物基因組中的堿基含量在富含AT的生物（如單鏈DNA噬菌體ΦX174）基因組中，密碼子第三位上的U和A出現(xiàn)的頻率較高；在GC豐富的生物（如鏈霉菌）基因組中，第三位上含有G或C的簡并密碼子占90%以上的絕對優(yōu)勢10/18/202373密碼子偏愛性對外源基因表達的影響由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程度的差異性，因此外源基因尤其是高等哺乳動物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個重要因素是密碼子的正確選擇。一般而言，有兩種策略可以使外源基因上的密碼在大腸桿菌細胞中獲得最佳表達：

外源基因全合成同步表達相關tRNA編碼基因密碼子10/18/202374質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)對細菌生長代謝的影響目前實驗室里廣泛使用的表達型質(zhì)粒在每個大腸桿菌細菌中可達數(shù)百甚至上千個拷貝，質(zhì)粒的擴增過程通常發(fā)生在受體細胞的對數(shù)生長期內(nèi)，而此時正是細菌生理代謝最旺盛的階段。質(zhì)粒分子的過度增殖以及其后目的基因的高效表達勢必會影響受體細胞的生長代謝，進而導致重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性以及目的基因宏觀表達水平的下降。解決上述難題的一種有效策略是將重組質(zhì)粒的擴增納入可控制的軌道10/18/202375外源基因在大腸桿菌中的表達蛋白質(zhì)的合成是在細胞之中進行的目標蛋白在細胞質(zhì)中表達的主要優(yōu)點是：表達質(zhì)粒的構建比較簡單；能夠達到很高的目標蛋白表達量，一般可以達到占細胞總蛋白的20%~40%。目標蛋白在大腸桿菌系統(tǒng)表達的形式有兩種：在細胞內(nèi)表達為不溶性的包涵體顆粒包涵體存在于大腸桿菌細胞質(zhì)中在細胞內(nèi)表現(xiàn)為可溶性的蛋白質(zhì)可溶性的蛋白質(zhì)除可存在于細胞質(zhì)中外，還可借助于本身的功能序列和大腸桿菌蛋白質(zhì)加工、運輸體系，最終分泌到周質(zhì)空間，或分泌到培養(yǎng)液中。10/18/202376外源基因在大腸桿菌中的表達大腸桿菌基因工程菌的構建策略包涵體型異源蛋白的表達分泌型異源蛋白的表達融合型異源蛋白的表達寡聚型異源蛋白的表達整合型異源蛋白的表達蛋白酶抗性或缺陷性表達系統(tǒng)的構建10/18/202377包涵體性異源蛋白的表達包涵體及其性質(zhì)在某些生長條件下，大腸桿菌能積累某種特殊的生物大分子，它們致密地集聚在細胞內(nèi)，或被膜包裹或形成無膜裸露結構，這種水不溶性的結構稱為包涵體（InclusionBodies，IB）富含蛋白質(zhì)的包涵體多見于生長在含有氨基酸類似物培養(yǎng)基的大腸桿菌細胞中，由這些氨基酸類似物所合成的蛋白質(zhì)往往會喪失其理化特性和生物功能，從而集聚形成包涵體。由高效表達質(zhì)粒構建的大腸工程桿菌大量合成非天然的同源或異源蛋白質(zhì)，后者在一般情況下也以包涵體的形式存在于細菌細胞內(nèi)。除此之外，包涵體中還含有少量的DNA、RNA和脂多糖等非蛋白質(zhì)分子10/18/202378以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定能夠避免細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集簡化外源基因表達產(chǎn)物的分離操作包涵體的水難溶性及其密度遠大于其它細胞碎片和細胞成分，菌體經(jīng)超聲波裂解后，直接通過高速離心即可將重組異源蛋白從細菌裂解物中分離出來能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白包涵體性異源蛋白的表達10/18/202379以包涵體形式表達目的蛋白的優(yōu)缺點包涵體表達形式的缺點

以包涵形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白，因此包涵體變性復性操作的效率對目標產(chǎn)物的收率至關重要。經(jīng)過復性處理的目標蛋白不一定能完全恢復原來的生物學活性，有時甚至完全得不到有活性的蛋白，尤其當目標蛋白分子中的Cys殘基數(shù)目較高時，體外復性蛋白的成功率相當?shù)?，一般不超過30%包涵體性異源蛋白的表達10/18/202380包涵體的變性與復性操作包涵體的溶解與變性

包涵體的溶解與變性的主要任務是拆開錯配的二硫鍵和次級鍵。在人工條件下，使包涵體溶解并重新進入復興途徑中。能有效促進包涵體溶解變性的試劑和條件包括：清洗劑

SDS、正十二醇肌氨酸、廉價，但影響復性和純化促溶劑鹽酸胍，尿素，前者昂貴，尿素便宜，但常被自發(fā)形成的氰酸鹽污染，后者能與多肽鏈中的氨基反應混合溶劑如尿素與醋酸、二甲基砜等聯(lián)合使用，溶解力增強極端pH

廉價、但許多蛋白質(zhì)在極端pH條件下發(fā)生修飾反應包涵體性異源蛋白的表達10/