高通量測序技術(shù)簡介

高通量測序應(yīng)用與進(jìn)展報告綱要高通量測序簡介高通量測序平臺的介紹高通量測序的應(yīng)用范圍及案例分析相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件介紹高通量測序簡介高通量測序:一次性對幾百萬到十億條DNA分子進(jìn)行并行測序，又稱為下一代測序技術(shù)，其使得可對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行深入、細(xì)致、全貌的分析，所以又被稱為深度測序。High-throughputSequencingNextGenerationSequencingDeepSequencing3高通量測序流程文庫擴(kuò)增低通量ASanger測序B高通量測序并行測序

高通量無需建立文庫，

兩端加測序接頭PCR擴(kuò)增報告綱要高通量測序簡介高通量測序平臺的介紹高通量測序的應(yīng)用范圍及案例分析相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件介紹高通量測序技術(shù)的起源與發(fā)展1992年LynxTherapeuticsMPSS2003年P(guān)olonySequencing（哈佛）2005年454Pyrosequencing2006年SolexaSequencing-by-Synthesis2007年ABISOLiD2008年HelicostSMSSequencing2010年IontorrentSemiconductorSequensing2011年P(guān)acificBiosciencesSMRTSequensing6高通量測序技術(shù)的傳承關(guān)系圖LynxMPSSSolexaABISOLiD454IonTorrentHelicosSMRTIlluminaSolexaRoche454PolonySeqABIIonTorrent現(xiàn)有主要高通量測序儀開發(fā)商測序儀品牌技術(shù)原理開發(fā)商Roche454焦磷酸測序RocheIlluminaSolexa邊合成邊測序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大規(guī)模并行連接測序ABIHelicos單分子熒光測序HelicosIonTorrent半導(dǎo)體測序ABISMRT單分子實時測序PacificBio454Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸測序：A磁珠制備設(shè)備B454測序儀C454測序原理454測序流程454測序流程與BaseCalling454的特點與主要應(yīng)用讀長較長，400－600bp通量較低，1Run1M序列，400－600Mb相對成本較高主要應(yīng)用：denovo測序IlluminaSolexa簡介橋式PCR邊合成邊測序可逆終止物HiSeq2000IlluminaSolexa測序流程IlluminaSolexa橋式PCRdioldiol 1stcycledenaturation1stcycleannealingdioldioln=35total1stcycleextensiondioldioldioldiol2ndcycledenaturation2ndcycleannealingdioldioldioldioldioldiol2ndcycleextensionIlluminaSolexaBaseCalling123789456TTTTTTT

G

T…T

G

C

T

A

C

G

A

T…Solexa的特點與主要應(yīng)用讀長較短，100－150bp通量高，25G每天，120-150G每Run主要應(yīng)用：RNA測序、表觀遺傳學(xué)研究ABISOLiD簡介SOLiD

SequencingbyOligoLigation/DetectionOligo連接測序：通過連接酶連接，再對oligo上熒光基團(tuán)進(jìn)行檢測SOLiD5500xlABISOLiD測序前期制備A樣品片段化磁珠連接B乳化PCR3‘末端修飾C磁珠富集轉(zhuǎn)到測序玻片ABISOLiD測序原理ABISOLiD熒光結(jié)合和結(jié)果示例@SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35T11.0203.3.1113211010332111302330201+SRR029969.1VAB_5551_12_381_F3length=35!36!8/8:!:!462>@6=(<8>8.<;2:*9748078@SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35T202312302.3333130131131322113203131+SRR029969.2VAB_5551_13_468_F3length=35!9),4/3)&$!(&(573(96,'7&91>)43),(95,A.SOLiDOligo熒光基團(tuán)模式圖B.SOLiD測序結(jié)果示例（ColorSpace)SOLiD的特點與主要應(yīng)用讀長較短，50-75bp精度高，可達(dá)Q40通量高，20-30G每天，1Run可達(dá)120G主要應(yīng)用：基因組重測序、SNP檢測等三種平臺的技術(shù)差異平臺454SolexaSOLiDPCR磁珠乳化PCR橋式PCR磁珠乳化PCR測序載體磁珠玻片玻片測序方式焦磷酸、熒光可逆終止物、熒光連接酶、熒光結(jié)果序列FastQFastQCSFastQ三種平臺的效能參數(shù)差異平臺讀長通量周期精度SolexaHiSeq2000Single-end:1x35bpPaired-end:2x50bpPaired-end:2x100bp25Gb/d~1.5d~4d~8d?50bp85%以上Q30

?100bp80%以上Q30SOLiD5500xlSingle-end:75bpPaired-end:75x35bpMate-pair:60x60bp20–30Gb/d1d/1lane7d/12lane7d/12laneQ40454GSFLX400-600bp400–600Mb/Run10hQ20報告綱要高通量測序簡介高通量測序平臺的介紹高通量測序的應(yīng)用范圍及案例分析相關(guān)生物信息學(xué)分析軟件介紹高通量測序應(yīng)用范圍DNA測序

全基因組denovo測序

基因組重測序

宏基因組測序

人類外顯子組捕獲測序RNA測序

轉(zhuǎn)錄組測序

小RNA測序

電子表達(dá)譜測序表觀基因組研究

ChIP-Seq

DNA甲基化測序基因組測序基因組測序是對物種的基因組DNA打斷后進(jìn)行高通量測序，根據(jù)是否有已知基因組數(shù)據(jù)主要分為denovo全基因組測序和基因組重測序。Denovo基因組測序是對未知基因組序列的物種進(jìn)行基因組從頭測序，利用生物信息學(xué)分析手段對序列進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。全基因組重測序是對已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個體的基因組測序，并在此基礎(chǔ)上對個體或群體進(jìn)行差異性分析?；蚪M測序策略Paired-EndMate-End基因組測序流程－兩種測序策略Paired-end原理29100bps100bps3000bpsPaired-end基因組重排分析

Paired-end和測序深度對測序效果的影響JunWang,etal.Nature456,60-65(6November2008)基因組測序的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)產(chǎn)出處理：圖像識別與BaseCalling\去除接頭序列、檢測與去除污染序列等；基因組組裝：原始數(shù)據(jù)統(tǒng)計、測序深度分析、組裝結(jié)果統(tǒng)計等；基因組注釋：CodingGene注釋、RNA分類注釋、重復(fù)序列注釋等；基因功能注釋：GO功能分類、Interpro功能分類等；比較基因組及分子進(jìn)化分析：SNP/InDel/CNV檢測等。References1、ErinD.Pleasance,PhilipJ.Stephens,SarahO’Meara,etal..Asmall-celllungcancergenomewithcomplexsignaturesoftobaccoexposure.Nature,2010,463:184-190.2、MichaelJamesClark,NilsHomer,BrainD.O’Connor,etal..U87MGDecoded:TheGenomicSequenceofaCytogeneticallyAberrantHumanCancerCellLine.PloSGenetics,2010,6(1):e1000832.3、WeiChen,ReinhardUllmann,ClaudiaLangnick,etal..Breakpointanalysisofbalancedchromosomerearrangementsbynext-generationpaired-endsequencing.EuropeanJournalofHumanGenetics,2010,18:539-543.4、VanTassellCP,SmithTP,MatukumalliLK,TaylorJF,SchnabelRd,etal.Whole-genomesequencingandvariantdiscoveryinC.elegans.NatMethods,2008,5(2):183-188.5、JunWang,WeiWang,RuiqiangLi,etal..ThediploidgenomesequenceofanAsianindividual.Nature456,60-65(6November2008)6、HuangSW,LiRQ,WangJ,etal.TheGenomeoftheCucumber(CucumissativusLinnaeus).

NatureGenetics2009;doi:10.1038/ng.4757、DavidHernandez,etal.Denovobacterialgenomesequencing:Millionsofveryshortreadsassembledonadesktopcomputer.GenomeRes.

2008.18:

802-80933基因組重測序案例分析ErinD.Pleasance,etal.Thecompendiumofsomaticmutationsinasmall-celllungcancergenome.Nature,2010,463:184-190.此研究用高通量測序?qū)σ粋€小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系NCI－H209基因組進(jìn)行重測序，以探討吸煙引發(fā)該細(xì)胞系基因組中特定堿基及其周圍序列的突變及細(xì)胞損傷修復(fù)原理。肺癌基因組變異情況統(tǒng)計圖基因組重排和CNV分析從頭基因組測序案例DavidHernandez,etal.Denovobacterialgenomesequencing:Millionsofveryshortreadsassembledonadesktopcomputer.GenomeRes.

2008.18:

802-809此研究對Staphylococcusaureus

strainMW2和Helicobacteracinonychis

strainSheeba兩種細(xì)菌基因組進(jìn)行從頭測序，并比較了幾種拼接方法的效果。多種拼接軟件拼接結(jié)果比較多種拼接軟件拼接結(jié)果比較五種拼接方法的拼接結(jié)果比對宏基因組測序宏基因組測序是對某一特定環(huán)境，如腸道、土壤、海水等中的所有微生物進(jìn)行基因組測序。通過此方法可對該環(huán)境中的微生物種類和優(yōu)勢物種進(jìn)行檢測，揭示微生物群落多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系。自然環(huán)境中很多微生物無法分離培養(yǎng)，而此方法無需對微生物進(jìn)行分離培養(yǎng)。宏基因組測序方法現(xiàn)在有全基因組的宏基因組測序和16S/18SrRNA宏基因組測序。全基因組的宏基因組測序通過高通量測序技術(shù)，對環(huán)境樣品的總DNA直接進(jìn)行全基因組的宏基因組測序，能夠?qū)崿F(xiàn)微生物群落的物種分類研究、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、功能注釋以及物種間的代謝網(wǎng)絡(luò)研究，挖掘具有應(yīng)用價值的基因資源，開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。與傳統(tǒng)的Sanger法相比，速度快，性價比高，周期短，單個樣品的測序量可以接近飽和。宏基因組測序信息分析主要內(nèi)容拼接組裝物種分類組成分析基因預(yù)測和功能注釋生成Profilingtable主成分分析（PCA）篩選與樣品分組顯著相關(guān)的因子多樣品間比較分析16S/18SrRNA宏基因組測序16S/18SrRNA是微生物群落分析和細(xì)菌進(jìn)化研究以及分類研究最常用的靶分子，采用新一代測序技術(shù)，對16S/18SrDNA的可變區(qū)進(jìn)行測序分析，不需進(jìn)行克隆篩選，能全面的反映微生物群體的物種組成，真實的物種分布及豐度信息。16S/18SrRNA測序信息分析內(nèi)容物種分類、物種豐度分析OTU（Operational

TaxonomicUnits）分析多樣性分析系統(tǒng)進(jìn)化分析多樣品間的比較分析ReferencesMeyer,F;PaarmannD,D'SouzaM,OlsonR,GlassEM,KubalM,(2008)."ThemetagenomicsRASTserver-apublicresourcefortheautomaticphylogeneticandfunctionalanalysisofmetagenomes".

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JBioinformComputBiol.

8

(6):995–1011.人類外顯子組捕獲測序外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需要的重要信息，涵蓋了與個體表型相關(guān)的大部分功能性變異。

與全基因組重測序相比，外顯子組測序只需針對外顯子區(qū)域的DNA，覆蓋度更深、數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性更高，更加簡便、經(jīng)濟(jì)、高效。46人類外顯子組捕獲測序原理人類外顯子組捕獲測序分析流程檢測序列變異分析示例檢測到SNP數(shù)統(tǒng)計序列InDel檢測References1、WeiX,

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2011Apr15.[Epubaheadofprint]2、JanelO.Johnson,J.RaphaelGibbs,etal.ExomeSequencinginBrown-Vialetto-VanLaereSyndrome.AmJHumGenet.

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2010Oct15;19(R2):R145-51.Epub2010Aug12.4、LeyTJ,MardisER,DingL,etal.DNAsequencingofacytogeneticallynormalacutemyeloidleukaemiagenome.Nature2008;456(7218):66-725、GnirkeA,MelnikovA,MaguireJ,etal.Solutionhybridselectionwithultra-longoligonucleotidesformassivelyparalleltargetedsequencing.NatBiotechnology2009;27(2):182-9.6、MurimChoia,UteI.Scholla,WeizhenJia,etal.(2010)GeneticdiagnosisbywholeexomecaptureandmassivelyparallelDNAsequencing.

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42,30-35.50人類外顯子組捕獲測序案例WeiX,

WaliaV,

etal.ExomesequencingidentifiesGRIN2Aasfrequentlymutatedinmelanoma.NatGenet.

2011Apr15.[Epubaheadofprint]

黑色素瘤發(fā)生率一直在上升，此研究對黑色素瘤細(xì)胞進(jìn)行外顯子組捕獲測序，發(fā)現(xiàn)了和其相關(guān)的高頻突變基因。七個新發(fā)現(xiàn)的非同義高頻突變位點單個基因中突變位點分析基因GRIN2A模式圖，箭頭表示突變位點轉(zhuǎn)錄組測序簡介轉(zhuǎn)錄組即特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA(Non-coding

RNA)。

第二代測序系統(tǒng)可精確檢測單個堿基，并且不受到研究中先驗信息的干擾，科研人員能夠快速地獲得某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA轉(zhuǎn)錄本序列，從而能夠開展：UTRs區(qū)域界定、可變剪切研究、低豐度新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)、融合基因鑒定、cSNP（編碼序列單核苷酸多態(tài)性）研究等。轉(zhuǎn)錄組測序測序流程全轉(zhuǎn)錄組總RNApolyT富集mRNA去除rRNANon-codingRNA轉(zhuǎn)錄組mRNARNA片段化、純化、檢測產(chǎn)量連接兩端接頭序列逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA選擇適當(dāng)長度cDNA進(jìn)行擴(kuò)增純化擴(kuò)增產(chǎn)物，評估產(chǎn)量上機(jī)進(jìn)行高通量測序轉(zhuǎn)錄組測序測序流程無參考序列測序流程有參考序列測序流程轉(zhuǎn)錄組主要分析內(nèi)容無參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容有參考序列轉(zhuǎn)錄組分析內(nèi)容1測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量統(tǒng)計，數(shù)據(jù)成分和質(zhì)量評估；2Contig及Scaffold長度分布3Unigene的長度分布和功能注釋，GO分類，Pathway分析，差異表達(dá)分析4蛋白功能預(yù)測與分類，差異表達(dá)基因GO富集和Pathway富集分析。1基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計，比對參考序列2序列在基因組上在分布3測序深度分析、隨機(jī)性評估和基因差異表達(dá)分析4新基因預(yù)測，基因可變剪接鑒定和基因融合鑒定等。ReferencesMaherCA,Kumar-SinhaC,

CaoX,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009Mar5;458(7234):97-101.GuojieZhang,GuangwuGuo,XuedaHu,etal.DeepRNAsequencingatsinglebase-pairresolutionrevealshighcomplexityofthericetranscriptome.GenomeRes.

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CrawfordJE,GuelbeogoWM,SanouA,TraoréA,VernickKD,etal.(2010)

DeNovoTranscriptomeSequencingin

Anophelesfunestus

UsingIlluminaRNA-SeqTechnology.PLoSONE5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202有參考序列轉(zhuǎn)錄組測序案例MaherCA,Kumar-SinhaC,

CaoX,etal.Transcriptomesequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009Mar5;458(7234):97-101.此研究使用454和Solexa兩種高通量測序平臺對前列腺癌細(xì)胞系VcaP和LNCaP轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序，以檢測和研究前列腺癌細(xì)胞系中基因融合表達(dá)情況?；蛉诤戏治龌蚯逗戏治隽鞒蘉IPOL1-DGKB

基因融合模式無參考序列轉(zhuǎn)錄組測序案例CrawfordJE,GuelbeogoWM,SanouA,TraoréA,VernickKD,etal.(2010)

DeNovoTranscriptomeSequencingin

Anophelesfunestus

UsingIlluminaRNA-SeqTechnology.PLoSONE5(12):e14202.doi:10.1371/journal.pone.0014202此研究通過對3個按蚊樣品進(jìn)行高通量測序，通過拼接組裝后，和相近物種進(jìn)行比較基因組學(xué)分析。Denovo序列拼接、組裝和比對流程拼接結(jié)果統(tǒng)計拼接和變異檢測分析流程圖比較基因組分析各類功能基因中氨基酸在物種間差異比例差異同源蛋白GO分類進(jìn)化關(guān)系分析電子表達(dá)譜測序?qū)μ囟ㄌ幚項l件下的全基因組基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，已被廣泛用于功能基因組學(xué)和醫(yī)學(xué)等研究領(lǐng)域。電子表達(dá)譜測序（DigitalGeneExpression,DGE）又稱為基因表達(dá)標(biāo)簽測序（mRNAtagprofiling），其原理是通過兩種酶切作用對基因中一段長度為21nt的序列標(biāo)簽進(jìn)行測序。由于其測序只針對表達(dá)的基因進(jìn)行測序，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量相對較小，是研究基因表達(dá)譜的經(jīng)濟(jì)而快速的研究手段。又稱Tag-SAGE電子表達(dá)譜測序流程圖NlaIII限制性酶切電子表達(dá)譜分析內(nèi)容圖像識別與原始堿基數(shù)據(jù)讀取。去污染、去接頭，標(biāo)簽序列計數(shù)統(tǒng)計?；蚪M比對與統(tǒng)計，基因序列比對獲得所表達(dá)的基因列表基因差異表達(dá)分析。聚類與表達(dá)類型分析。GO基因富集與分類分析。Pathway富集與分類分析。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。反義鏈轉(zhuǎn)錄本與新轉(zhuǎn)錄本檢測。ReferencesMorrissyAS,etal.Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling.GenomeRes.2009.19(10):1825-1835.'tHoenPA,etal.Deepsequencing-basedexpressionanalysisshowsmajoradvancesinrobustness,resolutionandinter-labportabilityoverfivemicroarrayplatforms.NucleicAcidsRes,2008.36(21):e141(1-11).style7">3.HegedusZ,etal.Deepsequencingofthezebrafishtranscriptomeresponsetomycobacteriuminfection.MolImmunol,2009.46(15):2918-2930.AudicSandClaverieJM.Thesignificanceofdigitalgeneexpressionprofiles.GenomeRes.1997.7(10):986-995.ZhenhuaJeremyWu,

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1730-1739AndreaL.Eveland,NamikoSatoh-Nagasawa,AlexanderGoldshmidt,etal.DigitalGeneExpressionSignaturesforMaizeDevelopment.PlantPhysiol.,2010

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1024-1039PeterRuzanovandDonaldL.Riddle.DeepSAGEanalysisoftheCaenorhabditiseleganstranscriptome.NucleicAcidsResearch,2010,Vol.38,No.10SaurabhSaha,AndrewB.Sparks,CarloRago,etal.Usingthetranscriptometoannotatethegenome.NatureBiotechnology

(2002)20,508-512電子表達(dá)譜測序案例分析MorrissyAS,etal.Next-generationtagsequencingforcancergeneexpressionprofiling.GenomeRes.2009.19(10):1825-1835.此研究用高通量電子表達(dá)譜測序（Tag-SAGE）和傳統(tǒng)LongSAGE測序方法對癌癥細(xì)胞進(jìn)行研究，比較兩種方法效果，揭示了電子表達(dá)譜在基因發(fā)現(xiàn)中的諸多優(yōu)勢，可發(fā)現(xiàn)更多的基因，減少GC偏好。兩種方法所檢測到的基因數(shù)比較GC偏好性和低豐度轉(zhuǎn)錄本檢測效果小RNA測序小RNA是指長度在21-31nt的內(nèi)源性非蛋白質(zhì)編碼RNA，廣泛存在于高等和低等生物體內(nèi)，其對mRNA的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平等生命過程起到調(diào)節(jié)作用。現(xiàn)已知小RNA可歸納成三類：微RNA(miRNA)，小干擾RNA(siRNA)和與piwi相互作用的RNA(piRNA)。miRNA長度為21~24nt，產(chǎn)生于有典型莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)的原轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA)，在動植物的目標(biāo)mRNA的降解與抑制方面發(fā)揮重要作用。siRNA，長度在19