腎茶對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及機制研究

腎茶對糖尿病大鼠腎臟的保護作用及機制研究

糖尿病性腎衰竭（dn）是糖尿病患者的主要慢性并發(fā)癥，也是腎衰竭的重要原因之一。DN發(fā)病機制復雜,其中涉及糖代謝紊亂、腎臟血流動力學改變,多種細胞因子及遺傳背景等。目前國內(nèi)外研究認為,多種細胞因子分泌增多和細胞外基質(zhì)(ECM)蛋白代謝異常,在DN發(fā)病機制的各個環(huán)節(jié)起著重要的作用。DN腎臟系膜細胞轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)合成增加,基本已成定論。并且認為糖尿病早期腎小球肥大是TGF-β1所介導的。腎茶(C.Spicatus)又名貓須草,主產(chǎn)廣西、廣東、云南、福建、臺灣等地,其主要活性成分有迷迭香酸(rosmarinicacid,RsA)、熊果酸、黃酮類和肌醇等。腎茶的藥理作用主要為抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗凝、抗感染、利尿等,其作用與其所含活性成分RsA、熊果酸、黃酮、肌醇等有關(guān)。近年來有應用單味腎茶及其復方制劑治療尿路感染、尿路結(jié)石、腎病綜合征及腎衰竭等臨床報道。本實驗擬探討腎茶對早期糖尿病腎病是否有保護作用,以期為中西醫(yī)結(jié)合防治早期糖尿病腎病提供實驗依據(jù)。材料和方法1實驗材料1.1動物許可證清潔級雄性SD大鼠48只,體重180～200g,由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供,動物許可證號:SCXKC(滬)2003-0002。1.2腎茶提取液的制備腎茶購自泉州市醫(yī)藥分公司,產(chǎn)地福建同安。取腎茶粗粉150g加蒸餾水10倍量,浸泡1h后,在70℃水浴提取2h后,濾過,濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮制成大劑量每毫升相當于1g生藥,小劑量每毫升相當于0.25g生藥的腎茶提取液供用。1.3試劑盒和試劑盒鏈脲佐菌素(STZ)由美國Sigma公司提供,尿白蛋白放免試劑盒由中科院原子能科學研究所提供,SOD及MDA試劑盒由南京建成生物公司提供,兔抗TGF-β1、FN,小鼠抗Col-Ⅳ單克隆抗體及SABC試劑盒由武漢博士德生物公司提供。1.4儀器、檢測方法GF-234A型生化超微量自動分析儀(高密儀器廠),SN695型智能放免γ測量儀(上海核福光電儀器有限公司),Beckman自動生化儀,大鼠金屬代謝籠(蘇州動物儀器廠),透射電子顯微鏡(福建醫(yī)科大學電鏡室)。2實驗方法2.1糖尿病動物模型的建立取SD大鼠40只,適應性飼養(yǎng)1周后,按55mg/kg體重腹腔注射2%的枸櫞酸鈉緩沖液(pH值4.2)在低溫下配制的STZ。72h后,經(jīng)尾靜脈采血測血糖,代謝籠收集尿液測尿糖。如達到下列條件即認為糖尿病動物模型成立,列入研究觀察對象:(1)隨機血糖≥16.7mmol/L;(2)尿糖強陽性。2.2動物組將預留的8只大鼠設為正常對照組;并選30只成模大鼠隨機分為糖尿病對照組、腎茶小劑量治療組、腎茶大劑量治療組,每組各10只。2.3灌胃給藥及給藥時間腎茶大、小劑量治療組,分別按生藥8.0、2.0g·kg-1·d-1灌胃;糖尿病對照組及正常對照組給予等體積蒸餾水灌胃。以上各組均連續(xù)給藥8周。各組均自由取食,自由飲水。3腎組織超氧化物歧化酶、丙二醛、mda的檢測方法(1)精神狀態(tài)、飲食、毛色、體重(每周測1次)。(2)每4周測血糖1次。(3)治療8周后,所有大鼠收集24h尿液,放免法測定尿微量白蛋白排泄率,苦味酸法測定尿肌酐。以戊巴比妥鈉40mg/kg麻醉下心臟采血測血肌酐,取腎稱重后斷頭處死。測定腎小球濾過率[采用內(nèi)生肌酐清除率(Ccr)公式計算]。測定腎重/體重比,得出腎重/體重指數(shù)(腎重/體重比值×1000)。(4)所取大鼠右腎1/4用玻璃勻漿器勻漿,測定腎組織超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。①SOD測定采用黃嘌呤氧化酶法,取10μl腎組織勻漿參照測試盒說明書具體步驟進行。②MDA測試盒原理:采用硫代巴比妥酸(TBA)縮合法,測定時參照測試盒說明書具體步驟進行。(5)取左腎皮質(zhì)以10%福爾馬林固定、脫水、浸蠟包埋備用,制3μm厚切片行PAS染色、PASM染色觀察腎單位形態(tài)及病變程度。4免疫組化染色石蠟切片常規(guī)脫蠟入水,3%H2O2室溫8min以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶,高壓抗原修復(TGF-β1、Col-Ⅳ),酶消化抗原修復(FN);滴加正常山羊血清封閉液,室溫20min后分別滴加兔抗TGF-β1(1∶200)、兔抗FN(1∶100)、小鼠抗大鼠Col-Ⅳ單克隆抗體(1∶150),4℃冰箱過夜;分別滴加生物素化羊抗兔IgG(TGF-β1、FN),生物素化羊抗小鼠IgG,37℃20min;滴加試劑SABC,37℃20min;滴加DAB試劑,室溫顯色,鏡下控制反應時間;蘇木素輕度復染,脫水透明封片,顯微鏡觀察。以上各步驟滴加抗體前,均以PBS液洗片5min×3次。實驗均同時采用PBS代替第一抗體方法作為陰性對照。結(jié)果在高倍鏡(×200)下隨機選擇20個腎小球和20個視野腎小管-間質(zhì),根據(jù)染色面積和強度按下列方法進行半定量評分:染色強度標準:基本不著色者0分,著色淡者1分,適中者2分,深者3分;染色面積標準:0:無染色或微弱染色,1:染色面積<25%,2:染色面積在25%～50%之間,3:染色面積在50%～75%之間,4:染色面積>75%;將染色強度與染色面積得分相加,總得分0為0,總得分1～2為1,總得分3～4為2,總得分5～6為3,總得分7為4。5加方差分析采用SPSS11.0醫(yī)學統(tǒng)計軟件進行方差分析。所有計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果采用(ˉx±s)(xˉ±s)表示,免疫組化染色采用半定量統(tǒng)計,評分方法見上述。結(jié)果1腎茶各劑量治療組血糖情況治療前后DM對照組大鼠血糖較正常對照組顯著升高(P<0.01),腎茶各劑量治療組血糖與DM對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。治療后腎茶治療組血糖與治療前自身對照亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。2f、aer和腎臟體重指數(shù)腎茶治療8周后各治療組GFR、UAER、腎重/體重指數(shù)均顯著低于DM對照組(P均<0.05)。見表2。3腎茶大劑量組與腎茶小劑量組p7治療8周后腎茶各劑量治療組腎MDA顯著低于DM對照組(P<0.01),腎茶大劑量組與腎茶小劑量組比較(P<0.01)。治療8周后腎茶各劑量治療組腎SOD顯著低于DM對照組(P<0.01),腎茶大劑量組與腎茶小劑量組比較(P<0.05)。見表3。4腎病理觀察4.1腎茶大劑量治療組膜細胞增殖療效與正常對照組相比DM對照組光學顯微鏡下見系膜區(qū)增寬、系膜增生寬度大于毛細血管直徑、呈彌漫團狀分布,系膜基質(zhì)、系膜細胞增生,腎小管上皮細胞肥大,腎茶大劑量治療組較DM對照組病變明顯改善。見圖1、圖2。4.2腎茶大劑量治療組fn、型膠原表達增加TGF-β1在正常對照組主要在集合管、遠端小管、近端小管細胞漿表達,而腎小球系膜區(qū)表達較少;在DM對照組,TGF-β1表達明顯增加(P<0.01);在腎茶大劑量治療組上述明顯增加的表達受到明顯抑制(P<0.05)。正常對照組腎小球、腎小管基底膜有FN、Ⅳ型膠原表達,腎小球系膜區(qū)亦有少量FN、Ⅳ型膠原表達;在DM對照組,這些成分表達明顯增加(P<0.01);在腎茶大劑量治療組上述明顯增加的表達受到明顯抑制(P<0.05)。見表4、圖3～圖5。4.3基底膜組織異常在透射電鏡下放大4800倍后觀察腎臟組織超微結(jié)構(gòu),可以看到DM組腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)明顯異常,內(nèi)皮細胞排列紊亂、脫落,完整性被破壞,足突增粗、彎曲、倒伏融合成團塊,系膜細胞增多,基質(zhì)增多,基底膜明顯增厚。正常對照組內(nèi)皮細胞排列整齊,足突細長整齊,基底膜厚度適中。腎茶大劑量治療組腎小球濾過膜結(jié)構(gòu)有損害,但與未治療組相比有所改善。見圖6。腎茶保護作用機制DM對照組與正常對照組相比,24h尿白蛋白排泄率及GFR顯著升高,病理觀察有腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)增寬、系膜基質(zhì)增生、腎小管上皮細胞肥大等特征,具有典型早期DN表現(xiàn)。腎皮質(zhì)免疫組化提示腎小球系膜區(qū)TGF-β1、FN、Col-Ⅳ表達增強并且腎小管及間質(zhì)病變同樣明顯,證實TGF-β1活化后所誘發(fā)的ECM增生參與了DN腎單位纖維化的過程。與糖尿病對照組相比,腎茶小劑量及大劑量治療組24h尿白蛋白排泄率、GFR及腎重/體重指數(shù)明顯降低,腎茶大劑量治療組腎皮質(zhì)TGF-β1、FN、Col-Ⅳ的表達程度明顯減輕,腎茶治療前后血糖水平無統(tǒng)計學差異。提示腎茶有降低早期糖尿病腎病大鼠尿白蛋白排泄率及減少過高的GFR、抑制腎組織增生、抑制腎皮質(zhì)TGF-β1、FN、Col-Ⅳ表達等保護作用,但無直接降糖作用。腎茶保護作用的具體機制可能與抗氧化、抗炎、抑制系膜細胞增殖有關(guān)。實驗中觀察到DM組腎組織勻漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA活性明顯升高,抗氧化酶SOD活性明顯降低,提示氧化損傷機制在DN的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。經(jīng)腎茶治療8周后,治療組大鼠腎組織勻漿MDA顯著低于DM對照組,抗氧化酶SOD活性顯著高于DM對照組,提示腎茶能有效地抑制脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生,并提高抗氧化酶SOD的活性,抑制DN的氧化損傷過程。推測其抗氧化作用與迷迭香酸及熊果酸有關(guān)。Kelm等報道RsA在10mmol/L濃度時即有較強的抗氧化活性。陳淑珍等報道RsA能抑制大鼠中性粒細胞超氧陰離子和過氧化氫以及脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛MDA的產(chǎn)生,還能減少溶菌酶及β-葡萄糖醛酸苷酶的釋放,結(jié)果表明RsA能抑制中性粒細胞呼吸爆發(fā)和脂質(zhì)過氧化及通過降低細胞內(nèi)鈣離子濃度而抑制溶酶體的釋放。Andrikopoulos等報道在10～20mmol/L濃度時,熊果酸對銅離子介導的低密度脂蛋白(LPL)抗氧化保護活性為50.5%。Somova等報道熊果酸對鹽敏感性遺傳高血壓伴胰島素抵抗性大鼠有降壓、減輕動脈硬化及改善胰島素抵抗作用,認為其抗氧化作用為機制之一。DN中作為炎癥介質(zhì)的上游因子NF-κβ激活后所產(chǎn)生的炎癥細胞因子如TNF-α、MCP-1、ICAM-1、IL-1等,同時參與了發(fā)病環(huán)節(jié)。系膜細胞作為DN發(fā)病的靶細胞之一,能產(chǎn)生多種細胞外基質(zhì),參與腎小球基底膜的修復與更新,同時也參與腎小球炎癥反應。RsA和熊果酸均能通過抑制5-脂氧酶和環(huán)氧化酶阻斷花生四烯酸代謝,而RsA還有抑制C3轉(zhuǎn)化酶阻斷補體激活的經(jīng)典途徑和旁路途徑,以及抑制炎癥介質(zhì)上游因子NF-κβ及炎癥細胞因子IL-1、MCP-1、TNF-α的作用。已有RsA體外抑制鼠類系膜細胞增殖作用的報道,近來體外實驗證實50～250μg/ml劑量范圍的腎茶煎劑能夠抑制脂多糖誘導的大鼠系膜細胞增殖及系膜細胞分泌白細胞