蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)第二講

蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)

邱德文中國(guó)農(nóng)科院植物保護(hù)研究所2008.3.05蛋白質(zhì)組學(xué)的概念蛋白質(zhì)組學(xué)是研究與基因?qū)?yīng)的蛋白質(zhì)組的學(xué)科，蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）:MarcWilkins20世紀(jì)90年代早期提出的，有“基因組學(xué)”（genomics）和蛋白質(zhì)（protein）組合而成。蛋白質(zhì)組學(xué)的研究是生命科學(xué)進(jìn)入后基因時(shí)代的特征蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)特點(diǎn)內(nèi)容多：蛋白質(zhì)組作圖、蛋白質(zhì)組成分鑒定、蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建、新型蛋白質(zhì)發(fā)掘、蛋白質(zhì)差異顯示、同工體比較、基因產(chǎn)物識(shí)別、基因功能鑒定、基因調(diào)控機(jī)制分析、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化與發(fā)育、腫瘤發(fā)生與發(fā)展、環(huán)境反應(yīng)與調(diào)控、物種進(jìn)化、新型藥物靶分子、人體病理介導(dǎo)分子、病原菌毒性成分、植物信號(hào)識(shí)別、植物誘導(dǎo)抗性、免疫增產(chǎn)激發(fā)子、抗蟲(chóng)蛋白晶體、植物病害毒素、植物致病相關(guān)蛋白等等。蛋白質(zhì)組學(xué)與分析技術(shù)特點(diǎn)分析技術(shù)面廣：氨基酸組分、序列測(cè)定；SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳；毛細(xì)管電泳；高效液相色譜；質(zhì)譜；液質(zhì)聯(lián)儀；毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用；雙向凝膠電泳；蛋白質(zhì)芯片；蛋白質(zhì)生物信息學(xué)；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能；園二色譜；X光衍射；高能輻射；蛋白質(zhì)雜交技術(shù)；蛋白質(zhì)酶學(xué)技術(shù)蛋白質(zhì)作為人類食物主要營(yíng)養(yǎng)成分存在于不同的農(nóng)作物中；蛋白質(zhì)在植物生活中具有不同生物學(xué)功能（細(xì)胞調(diào)亡和細(xì)胞器）；蛋白質(zhì)作為酶在植物生長(zhǎng)代謝中期作重要的作用；蛋白質(zhì)作為生物信號(hào)傳導(dǎo)的受體對(duì)外界信號(hào)在植物生活進(jìn)行傳導(dǎo)；植物中某些蛋白具有抗病蟲(chóng)的生物功能；蛋白質(zhì)及多肽能誘導(dǎo)植物抗逆性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高作物品質(zhì)；蛋白質(zhì)組學(xué)與農(nóng)業(yè)的科學(xué)實(shí)踐蛋白質(zhì)組學(xué)的教學(xué)與其他課程的關(guān)系與基因克隆和基因工程教學(xué)的異同點(diǎn)與儀器分析課程的關(guān)系與生物化學(xué)的異同點(diǎn)與農(nóng)學(xué)、植保、制藥、免疫和疫苗、分子生物學(xué)、作物育種、土壤肥料、家禽飼料等的關(guān)系蛋白質(zhì)組學(xué)分析中蛋白質(zhì)的分離和消化蛋白質(zhì)組分析的基本流程圖蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)路線流程圖蛋白質(zhì)的分離與純化樣品制備原則1，盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失2，細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以防止蛋白的降解樣品裂解液應(yīng)該新鮮制備、并且分裝凍存于-80C,不要反復(fù)凍融已制備好的樣品通過(guò)超速離心清除所有的雜質(zhì)加入尿素之后加溫不要超過(guò)37C,防止氨甲?；揎椀鞍讖纳飿悠烦樘岬鞍踪|(zhì)去污裂解：溶解細(xì)胞膜裂解細(xì)胞如SDS還原劑：用于還原二硫鍵或防止蛋白質(zhì)氧化如巰基乙醇、硫脲變性劑：用于改變?nèi)芤弘x子強(qiáng)度和PH，破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)酶裂解：用酶來(lái)消化細(xì)胞器如溶菌酶、纖維素酶、果膠酶等滲透裂解：用低滲溶液懸浮細(xì)胞凍融裂解：用液氮迅速冷凍細(xì)胞，隨后在37C融化，反復(fù)幾次劇烈的蛋白裂解超聲裂解法：通過(guò)超聲波切應(yīng)力來(lái)裂解細(xì)胞，在劇烈的攪拌狀態(tài)下會(huì)產(chǎn)生剪切效果弗氏壓碎器：在高壓下迫使細(xì)胞穿過(guò)小孔徑產(chǎn)生剪切力裂解細(xì)胞研磨法：組織和細(xì)胞常凍存于液氮中，研磨成粉狀機(jī)械勻漿法：將組織切成小片、勻漿、過(guò)濾或離心獲得裂解液玻璃珠勻漿法：劇烈震蕩的玻璃珠可以打破細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)容物蛋白酶抑制劑防止蛋白裂解苯甲基磺酰氟PMSF:不可逆抑制劑AEBSF：滅活絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶金屬蛋白酶抑制劑乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇雙四乙酸(EGTA)肽蛋白酶抑制劑：亮以酶肽，抑制絲氨酸、半胱氨酸蛋白酶活性，為蛋白酶抑制劑A抑制酸性蛋白酶活性，抑蛋白酶肽抑制絲氨酸蛋白酶，本丁抑制素抑制氨基蛋白酶。甲苯磺酰賴氨酰氯甲酮（TLCK）、甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）:不可逆抑制絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶。Benzamidine:抑制絲氨酸蛋白酶蛋白沉淀步驟硫酸銨沉淀（鹽析）：高鹽溶液中蛋白質(zhì)聚合而沉淀TCA沉淀（三氯醋酸沉淀）：TCA10%-20%，蛋白質(zhì)可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除TCA丙酮沉淀：3倍體積的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，離心沉淀蛋白，丙酮通過(guò)空氣或凍干去除在丙酮中用TCA三氯醋酸沉淀：兩者聯(lián)合使用更有效，10%的TCA在丙酮中重懸裂解樣品溶液用苯酚提取，隨后在甲醇中醋酸銨沉淀：蛋白質(zhì)被提取到飽和酚中，在甲醇中用醋酸銨從酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗清除影響二維電泳圖譜的雜質(zhì)鹽離子、痕量緩沖液和其他帶電荷的小分子：鹽離子會(huì)干擾電泳，可以透析去除內(nèi)源性小分子（如核酸、代謝物和磷酸）：這些物質(zhì)帶負(fù)電荷，發(fā)生偏陽(yáng)極側(cè)聚焦不全，用TCA/丙酮沉淀去除離子去污劑：SDS與多肽形成復(fù)合物，不能正確聚焦，通過(guò)丙酮沉淀可去除SDS核酸（DNA、RNA）：核酸增加樣品的黏度導(dǎo)致背景彌散，核酸通過(guò)電穩(wěn)態(tài)相互作用也蛋白結(jié)合阻礙聚焦，核酸在銀染檢測(cè)中導(dǎo)致高背景多糖：阻礙凝膠孔徑導(dǎo)致沉淀，多糖含有負(fù)電荷與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，用硫酸銨或苯酚/醋酸銨沉淀去除多糖脂類：蛋白質(zhì)與脂類形成復(fù)合物影響等電點(diǎn)和分子量，用強(qiáng)變性劑和去污劑減少蛋白與脂類的相互作用酚類組分：苯酚通過(guò)酶催化的氧化反應(yīng)來(lái)修飾蛋白，用巰基乙醇或硫脲來(lái)滅活多酚氧化酶裂解液的組分為了完成聚焦良好的第一項(xiàng)等電聚焦，蛋白質(zhì)必須完全溶解和解聚經(jīng)過(guò)變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來(lái)溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。SDS作用后不利于穩(wěn)定IEF中的等電點(diǎn)，不宜存在于IEF的樣品溶解液中；只有后兩類表面活性劑是可用的，其中CHAPS和SB3-10最好。常用濃度為在8M尿素溶液中含2-5%的CHAPS，但在含高濃度硫脲的溶液中其作用有限；SB3-10是一種含有長(zhǎng)線性基團(tuán)尾端的兩性去污劑，其作用要強(qiáng)于CHAPS，但在尿素濃度大于5M時(shí)不溶解。完整蛋白質(zhì)的分離1D-SDS2D-SDSIEF(制備等電聚焦)HPLC離子交換或親和層析聚丙烯酰胺凝膠電泳通過(guò)丙烯酰胺單體和N，N，-甲叉雙丙烯酰胺按一定比率混合，在有引發(fā)劑和增速劑存在下聚合形成交叉網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，丙烯酰胺單體聚合生成長(zhǎng)鏈聚合物，甲叉雙丙烯酰胺的雙功能和鏈末端的自由功能基團(tuán)反應(yīng)，發(fā)生交聯(lián)，形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)等電聚焦凝膠，按等電點(diǎn)不同分離蛋白質(zhì)，SDS按相對(duì)分子質(zhì)量大小分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)樣品的制備原則應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時(shí)發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過(guò)程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無(wú)關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測(cè)性。1D-SDS一維等電聚焦電泳蛋白質(zhì)在不同PH值的溶液中帶電荷情況是不同的，在低的PH條件下，蛋白質(zhì)靜電荷為正，在高PH條件下靜電荷為負(fù)，在某一PH的溶液中，蛋白質(zhì)的靜電荷為零，則此PH值為該蛋白的等電點(diǎn)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)取決與氨基酸的組成，是一個(gè)物理化學(xué)常數(shù)如果外加一個(gè)電場(chǎng)，蛋白質(zhì)會(huì)在電場(chǎng)作用下分別向正極和負(fù)極漂移，當(dāng)達(dá)到等電點(diǎn)位置時(shí)，蛋白不帶電，就不在漂移，這就是等電聚焦電泳的基本原理2D-SDS第一向

IEF電泳染色第二向

SDS電泳圖像采集和分析蛋白斑點(diǎn)的切取樣品制備二維電泳原理Smithies和Poulik(1956)最早引入二維電泳技術(shù)，O’Farrell（1975）根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量的特異性將蛋白質(zhì)混合物在第一個(gè)方向上按照等電點(diǎn)高低進(jìn)行分離，在第二個(gè)方向上按照相對(duì)分子質(zhì)量大小進(jìn)行分離二維電泳分離后的蛋白質(zhì)點(diǎn)經(jīng)顯色，通過(guò)圖象掃描存檔，最后是呈現(xiàn)出來(lái)的是二維方向排列的，呈漫天星狀的小原點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)蛋白質(zhì)膠上蛋白的檢測(cè)蛋白質(zhì)檢測(cè)常用考馬斯亮藍(lán)染色銀染負(fù)染熒光標(biāo)記、同位素標(biāo)記，提高靈敏度和自動(dòng)化水平考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)30-100ng的蛋白質(zhì)，考染程序染色：45%甲醇/10%冰醋酸/0.1%考馬斯亮藍(lán),染色30分－1小時(shí)脫色：10%冰醋酸水溶液保存：用保鮮膜包裹或置成干膠銀染銀染是非放射性染色方法中靈敏度最好的，其靈敏度可達(dá)200pg凝膠在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后在AgNO3溶液中浸泡，蛋白與銀結(jié)合，銀顆粒沉淀在蛋白點(diǎn)上，沉淀的銀顆粒產(chǎn)生催化反應(yīng)，提高銀染反應(yīng)靈敏度，使蛋白點(diǎn)顯示棕黃色或棕黑色負(fù)染負(fù)染是一種可逆染色方法，其靈敏度高于考染低于銀染，準(zhǔn)備從膠上回收蛋白可選用此方法，負(fù)染有銅染、鋅-咪唑等，靈敏度可達(dá)50ng。負(fù)染在凝膠表面可產(chǎn)生半透明背景，蛋白質(zhì)以透明的形式被檢測(cè)出來(lái)，凝膠顯示黑色背景或相應(yīng)的底色，染色過(guò)程很快，5-15min即可完成熒光染色利用丙基Cy3和甲基Cy5兩種染料分別對(duì)不同蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記，并在一塊2-D膠上同步運(yùn)行，由于兩種修飾后的染料的激發(fā)波長(zhǎng)不同，在同一塊膠上可用兩個(gè)波長(zhǎng)范圍進(jìn)行掃描，并可得到兩個(gè)樣品的差異，靈敏度比銀染要高3-30倍另一熒光染料是SYPRORuby，它是基于釕的金屬螯和染料，靈敏度為0.25-1ng存在的問(wèn)題低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)高豐度蛋白的去除極酸和極堿性區(qū)蛋白的分離：pH<3或pH>11高分子質(zhì)量區(qū)蛋白的分離：100000Da以上的蛋白質(zhì)很難進(jìn)入膠條膜蛋白的提取和有效分離需要一種真正高通量的膠上蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時(shí)的低豐度蛋白的量，但同時(shí)增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離?，F(xiàn)常用預(yù)分級(jí)＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個(gè)pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。高不溶性蛋白的分離：主要還是要增加蛋白質(zhì)的溶解度，采用順序抽提法進(jìn)行。堿性蛋白：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3－12、4-12或10-12）進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12）的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽(yáng)極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12）等消除了窄范圍膠所需要的專門(mén)水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在常規(guī)Tris/甘氨酸緩沖液中，樣品和緩沖液中游離的SDS離子將持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對(duì)流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困