不同ph對豬肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

不同ph對豬肉肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

0豬肉肌原纖維蛋白與ph的相互作用關(guān)系【研究意義】肌肉原纖維素是肌肉中具有重要生物學功能的鹽溶性蛋白質(zhì)，主要由肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白和調(diào)節(jié)蛋白（原肌球蛋白和肌鈣蛋白）組成。它對肉類的功能特性（如硬度、保水、質(zhì)地等）具有密切的關(guān)系。蛋白質(zhì)的生物功能取決于其特定的三維結(jié)構(gòu)(二級結(jié)構(gòu))。肌原纖維蛋白熱不可逆凝膠形成過程中,蛋白質(zhì)發(fā)生變性聚集,其實質(zhì)是蛋白質(zhì)分子中的次級鍵被破壞,引起蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)解體,其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生一定變化,而所制凝膠呈現(xiàn)一定的保水性、質(zhì)構(gòu)特性(硬度等)以及一定的微觀結(jié)構(gòu),其兩者間可能具有一定相關(guān)性。【前人研究進展】圓二色(circulardichroism,CD)是一種簡單和快捷的獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的手段。圓二色現(xiàn)象是由光學活性物質(zhì)對左右圓偏振光的吸光率之差引起的。蛋白質(zhì)或多肽是由氨基酸通過肽鍵連接而成的,其主要的光學活性生色基團是肽鏈骨架中的肽鍵、芳香氨基酸殘基及二硫鍵。其CD譜遠紫外區(qū)段(190—250nm),主要生色團是肽鏈,這一波長范圍的CD譜包含著生物大分子主鏈構(gòu)象的信息;在近紫外區(qū)(250—300nm),占支配地位的生色團是芳香胺基側(cè)鏈,這一區(qū)域可以給出“局域”側(cè)鏈間相互作用的信息。根據(jù)所測蛋白質(zhì)或多肽的遠紫外CD譜,能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級結(jié)構(gòu)的信息,從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級結(jié)構(gòu)。在CD譜上,α-螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶,在222和208nm處表現(xiàn)出兩個負的肩峰譜帶,是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰,通過峰值的改變可以看出α-螺旋結(jié)構(gòu)的變化。圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法,要求蛋白濃度比較低,而蛋白凝膠形成需要有比較高的濃度,然而Choi和Ma同時利用圓二色譜和拉曼光譜研究普通蕎麥中球蛋白的構(gòu)象,前者取較低的蛋白濃度(0.01%),后者取較高的蛋白濃度(5%),結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用圓二色譜與拉曼光譜所測得的結(jié)果相一致?！颈狙芯壳腥朦c】pH能影響凝膠形成過程中蛋白質(zhì)之間的變化,通過改變氨基酸側(cè)鏈電荷分布,降低或增加蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)相互作用,從而對蛋白結(jié)構(gòu)和凝膠功能性質(zhì)產(chǎn)生影響。在蛋白質(zhì)天然二級結(jié)構(gòu)中,α-螺旋占主要地位,本試驗主要是用圓二色譜測定豬肉肌原纖維蛋白隨pH變化時,其二級結(jié)構(gòu)α-螺旋的變化,同時測定相應(yīng)pH條件下,肌原纖維蛋白熱誘導凝膠所呈現(xiàn)的質(zhì)構(gòu)、保水性及微觀結(jié)構(gòu),確定其相互關(guān)系。目前國內(nèi)尚未見關(guān)于肌原纖維蛋白在此方面研究的報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探討肌原纖維蛋白二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋)含量變化,與其熱誘導凝膠質(zhì)構(gòu)(硬度)、保水性和電鏡微觀結(jié)構(gòu)相關(guān)關(guān)系,找出α-螺旋與凝膠功能特性間的關(guān)系,以利于更好地了解其凝膠機制,為以后開發(fā)高品質(zhì)凝膠肉制品提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1蛋白質(zhì)提取法豬肉腰大肌:購于南京苜蓿園大街農(nóng)貿(mào)市場,剔除可見結(jié)締組織和脂肪,切碎,真空包裝,貯存于-20℃直到蛋白質(zhì)提取。所用試劑最低純度為分析純。1.2儀器和檢測方法圓二色譜儀:J-810,日本JASCO公司;落地式高效冷凍離心機:AvantiJ-E,美國BeckmanCoulter公司;物性測試儀:TA.XT2i,英國StableMicroSystems公司;掃描電鏡:S-3000N,日本Hitachi公司;高速組織打碎機:WaringBlender8010ES,美國Waring公司;高速勻漿機:UltraTurraxT25BASIS,德國IKA公司;pH計:HANNA,葡萄牙;紫外分光光度計:UV-2450,日本島津公司。1.3測試方法1.3.1從肌肉原磷脂酸中提取蛋白質(zhì)肌原纖維蛋白的提取參照韓敏義的方法。所得肌原纖維蛋白質(zhì)濃度用雙縮脲法測定,以牛血清蛋白作標準曲線,計算蛋白質(zhì)濃度。1.3.2蛋白凝膠的制備用磷酸緩沖液(0.6mol·L-1NaCl,50mmol·L-1Na2HPO4/NaH2PO4,pH6.0)將肌原纖維蛋白濃度分別調(diào)整到0.08mg·mL-1和40mg·mL-1,并且將整體離子強度調(diào)整到0.6mol·L-1NaCl,用1mol·L-1HCl或NaOH將蛋白樣品的pH分別調(diào)整到5.0、5.5、6.0、6.5和7.0,其中0.08mg·mL-1樣品用于圓二色譜α-螺旋的測定,40mg·mL-1樣品置于于水浴鍋以大約1℃/min速率從20—70℃線性升溫,而后在70℃保溫20min形成凝膠,于4℃冷庫冷卻過夜,進行質(zhì)構(gòu)、保水性測定和電鏡拍攝。1.3.3蛋白含量測定將制備好的肌原纖維蛋白樣品裝于光路長度為0.1cm的樣品槽,掃描波段為190—250nm,掃描速度為100nm/min,利用水浴鍋將樣品線性升溫加熱到80℃,保溫20min,進行測定。光譜共累計掃描3次取平均值,同時掃描緩沖液,通過差減除去緩沖液信號。α-螺旋含量通過DichroWeb網(wǎng)站(http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/home.shtml)軟件計算而得,使用的算法為K2D,使用的參考蛋白為SP175(Optimizedfor190—240nm#Lessnmrequired),取蛋白平均殘基濃度MRW為110g·mol-1,計算波長范圍為200—250nm。每個樣品共測定3個重復(fù)。1.3.4南、北、中等級ss/1.2回復(fù)突變指數(shù)pps制備的肌原纖維蛋白凝膠用物性測試儀測定硬度,探頭型號:P55mmDiaCylinderStainless。參數(shù)設(shè)定為:測前速度:2mm·s-1,測定速度:1mm·s-1,距離:10.0mm,數(shù)據(jù)獲得速率:200pps。每個處理測定3個重復(fù)。1.3.5肌原纖維蛋白凝膠的制備凝膠保水性的測定基于Kocher和Foegeding的離心法,按照韓敏義的參數(shù)進行測定。將制備的肌原纖維蛋白凝膠稱重后,于0—4℃下經(jīng)10000×g離心10min,去除離出的液體,記錄空離心管的重量以及離心前后離心管與凝膠的總重。根據(jù)下列公式計算凝膠保水性:式中W為離心管重,W1為離心前離心管與凝膠重,W2為離心去液體后離心管與凝膠重。每個處理測定3個重復(fù)。1.3.6掃描電鏡觀察將制備24h的肌原纖維蛋白凝膠,切塊后經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定,清洗,乙醇梯度脫水,乙酸異戊酯置換,干燥,粘樣,鍍膜后于掃描電鏡(scanningelectronmicroscope,SEM)觀察微觀結(jié)構(gòu),加速電壓為20.0kV。1.3.7多重比較分析用SAS8.12進行相關(guān)分析和方差分析,如果方差分析效應(yīng)顯著,使用Duncanmultiplerangetest進行多重比較(P<0.05)。2結(jié)果2.1肌原纖維蛋白的-螺旋分布不同pH下肌原纖維蛋白α-螺旋變化見圖1。在中性pH時(pH7.0),CD譜在208和222nm處出現(xiàn)兩個小峰,是α-螺旋結(jié)構(gòu)的特征峰。將pH偏離中性會降低208和222nm處的負極摩爾橢圓度,說明α-螺旋結(jié)構(gòu)的丟失。由圖1可見,隨著pH偏離肌原纖維蛋白等電點范圍(肌原纖維蛋白等電點約為5—5.2),向中性條件靠近時,肌原纖維蛋白的α-螺旋呈現(xiàn)升高趨勢。pH6.5時α-螺旋含量達到最高值,為32.0%;pH5.0時達最低值,為6.3%。pH7.0、6.5、6.0和pH5.5、5.0這兩組差異顯著(P<0.05),pH7.0的α-螺旋含量介于pH6.5和6.0之間。Liu等利用圓二色譜研究肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),當pH從7.0降到5.5時,α-螺旋含量很明顯地從87.4%降到15.8%。α-螺旋結(jié)構(gòu)主要是由多肽鏈上羰基(-CO)和氨基(NH-)之間的氫鍵穩(wěn)定。肌原纖維蛋白的等電點約為5—5.2,這說明在中性條件下,蛋白是呈負電荷的,降低pH可能會增加蛋白間因為電荷中和而產(chǎn)生的靜電作用,從而影響氫鍵的穩(wěn)定性。靜電作用和氫鍵穩(wěn)定性的變化會依次引起在酸性條件下α-螺旋的丟失。2.2凝膠的保水性不同pH下肌原纖維蛋白熱誘導凝膠保水性見圖2。pH遠離等電點逐漸升高時,凝膠保水性隨之提高,pH7.0、6.5保水性較高,分別達到89.74%和86.65%,pH6.0介于中間,pH5.0、5.5保水性較低,分別為41.64%和37.10%,這3組之間差異達顯著(P<0.05)。在熱誘導凝膠形成過程中,肌原纖維蛋白主要成分肌球蛋白經(jīng)過變性聚集而后相互交聯(lián)形成有序三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),并把水包含在其中。本試驗所得結(jié)果主要歸因于pH對肌原纖維蛋白凈電荷的影響以及其肌絲間靜電斥力的程度,而這些決定了凝膠的保水性。當pH高于等電點時,負極增加的負電荷網(wǎng)絡(luò)會引起凝膠網(wǎng)絡(luò)中肌球蛋白分子間的靜電斥力,同時凈電荷的增加為周圍水分子提供了更多氫鍵結(jié)合位點,增大了水合作用表面積。高pH時,保水性提高主要歸因于蛋白質(zhì)與水相互作用增多。也有人認為,當pH增大時,肌原纖維伸展,從而使保水性提高。2.3ph對靜電斥力的影響由圖3可見,在pH6.0時,凝膠硬度最大,為75.48g,pH5.0時達最小值,27.91g。pH6.0、6.5,pH5.5、7.0,pH5.0這3組之間差異顯著(P<0.05)。pH6.0、6.5的硬度比中性條件時大,可能是由于pH在6.0和6.5時,靜電斥力比pH7.0時小,從而使蛋白疏水作用和二硫鍵作用增大;在肌原纖維蛋白等電點范圍,由于蛋白-蛋白間作用增強,聚合加快,易獲得弱和容易滲水的凝膠,凝膠硬度降低,在接近等電點時,肌原纖維蛋白可能在未加熱之前即發(fā)生了部分解離,加熱后的蛋白溶液表現(xiàn)為有聚合物存在的棉絮狀,可能是加熱使蛋白質(zhì)發(fā)生了凝聚。2.4ph對凝膠微觀結(jié)構(gòu)的影響由基于SEM技術(shù)得到的凝膠微觀結(jié)構(gòu)圖可見,在接近等電點的酸性條件pH5.0和5.5時,肌原纖維蛋白熱誘導凝膠具有很多棒塊狀或顆粒狀聚合物,pH5.0時無明顯的凝膠孔洞,pH5.5時凝膠孔徑不均一,使酸性條件下的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)比較粗糙、無序;而當pH偏離等電點逐漸增大時,凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)趨于有序,逐漸形成多孔且孔徑均一的細致結(jié)構(gòu),其中pH6.0的孔徑比pH6.5和7.0的稍小(圖4)。pH會影響蛋白質(zhì)分子的離子化作用和凈電荷值,從而影響蛋白分子間的吸引力和排斥力以及蛋白分子與水分子的結(jié)合能力。酸性條件下的凝膠微觀結(jié)構(gòu)有序性低于接近中性條件的凝膠微觀結(jié)構(gòu),聚合物較多的原因可能是,離等電點較近時,蛋白分子間減小的靜電斥力有利于其相互間疏水作用的增強,蛋白與水的作用減弱,而蛋白與蛋白作用增強,在熱誘導變性聚集前,蛋白已發(fā)生部分解聚,之后的熱作用又促進解聚分子的重新結(jié)合,從而使蛋白分子混亂、無序;而接近中性條件的蛋白在合適的熱作用下充分變性,聚集,形成細致緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。2.5相關(guān)分析結(jié)果，如ph、-螺旋、保水和硬度pH、α-螺旋、保水性和硬度相關(guān)性結(jié)果見表。由表可見,α-螺旋、pH與保水性三者彼此都顯著相關(guān)(P<0.05)。3ph對豬肉肌原纖維蛋白凝膠保水性和硬度的影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)不管在溶液還是凝膠狀態(tài),都會隨pH的改變而改變。在本試驗中,豬肉肌原纖維蛋白α-螺旋隨pH降低而減少,與Liu等所測豬肉肌球蛋白α-螺旋變化趨勢一致,是因為肌原纖維蛋白主要是以肌球蛋白為主,肌球蛋白的變化起主要作用。肌原纖維蛋白α-螺旋在pH6.5時達最高值,32.0%,在pH7.0時達30.7%,而Liu等測得的肌球蛋白α-螺旋含量在pH7.0時為87.4%,可能是由于他們測定肌球蛋白α-螺旋的條件是15℃,而本試驗測定條件是80℃,而溫度對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)也有很大影響,這與Liu關(guān)于溫度對肌球蛋白影響的結(jié)論相一致:將肌球蛋白(pH7.0)從5℃升溫到90℃,蛋白α-螺旋含量從87.7%降到36.0%,本試驗中肌原纖維蛋白(pH7.0)α-螺旋在80℃時的值比36.0%略低,可能是因為測定條件和樣品差異等引起。本試驗所測凝膠保水性與豬肉肌球蛋白凝膠保水性結(jié)果一致,當pH5.5升到7.0時,豬肉肌球蛋白凝膠保水性顯著提高(P<0.05),從31.2%到73.0%,在pH7.0—9.0間達到最大保水性(72%—73%)。豬肉肌原纖維蛋白凝膠的保水性在pH5.4—7.0時也顯著提高。與低pH(6.4—6.8)相比,雞胸肉凝膠在較高pH(7.0—7.4)時保持水的能力更好,結(jié)果與本試驗結(jié)果類似。這種保水性從等電點范圍向中性條件逐漸增大的趨勢,主要歸因于靜電斥力以及蛋白-水作用的增強。Ishiproshi等通過測定兔肌球蛋白熱誘導凝膠在不同溫度點的剪切力研究pH和鹽濃度對其凝膠的影響,也發(fā)現(xiàn)在60—70℃時,pH6.0形成凝膠最強。Xiong等通過穿刺試驗,發(fā)現(xiàn)雞胸肉肌原纖維在pH6.0時形成凝膠最強,而腿肉肌原纖維在pH5.5時最強。Lefevre等利用應(yīng)變振動測試證明肌原纖維蛋白在pH5.6時形成的凝膠比在pH6.0時的強,主要是通過靜電增強疏水作用和二硫鍵作用引起的。Westphalen等通過流變測試發(fā)現(xiàn)豬肉肌原纖維蛋白在pH5.6和6.0時形成的凝膠較強,G′分別為1860和1311Pa,pH6.5和7.0時都較弱。本試驗也發(fā)現(xiàn),肌原纖維蛋白凝膠硬度從pH5.0到7.0呈現(xiàn)先升高后降低的變化,在pH6.0時達最大值,凝膠強度隨pH的變化趨勢,與Xiong的試驗相吻合:研究pH對雞胸肉勻漿物凝膠特性,發(fā)現(xiàn)雞胸肉凝膠強度從pH5.8到6.3呈升高趨勢,從6.6起又呈降低趨勢,其另外的研究也證明,雞胸肉肌原纖維蛋白從pH6.0到7.0形成凝膠強度降低。熱引起的蛋白質(zhì)凝膠經(jīng)兩步完成:第一步是原生態(tài)蛋白質(zhì)受熱而變性展開;第二步是展開的蛋白質(zhì)因聚合作用而形成較大分子的凝膠體。凝膠基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和物理化學特性取決于變性和聚集的相對速率。蛋白質(zhì)聚集的速率相對于展開的速率越慢,變性鏈可以更好定向,這就有利于形成更細致的凝膠網(wǎng)絡(luò)。當?shù)鞍踪|(zhì)聚集的速率高于展開的速率時,就形成粗糙、無序的凝膠結(jié)構(gòu)或凝結(jié)物。離等電點較近時,蛋白-蛋白作用增強,聚集速率快,所以形成粗糙的微觀結(jié)構(gòu),而在接近中性條件時,靜電斥力以及蛋白與水相互作用使多肽鏈保持在