食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：微生物細(xì)胞大小的測定和顯微鏡直接計(jì)數(shù)

專業(yè)：食品科學(xué)與工程姓名：專業(yè)：食品科學(xué)與工程姓名：__陳建楊_______學(xué)號(hào)：__3061321040___日期：________________地點(diǎn)：________________課程名稱：食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)老師：_尹源明________成績：__________________實(shí)驗(yàn)名稱：微生物細(xì)胞大小的測定和顯微鏡直接計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)類型：________________同組學(xué)生姓名：__________一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、主要儀器設(shè)備（必填） 四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理 六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）七、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)接目測微計(jì)的校正方法，了解血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和計(jì)數(shù)原理。2、學(xué)習(xí)使用顯微鏡測微尺測定微生物細(xì)胞大小，掌握用血球計(jì)數(shù)板測定微生物細(xì)胞總數(shù)的方法。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理裝訂線1、顯微測微尺由鏡臺(tái)測微尺和目鏡測微尺兩部分組成。后者可直接用于測量細(xì)胞大小。它是一塊圓形玻片，其中央有精確等分到度，測量時(shí)將其放在接目鏡中的隔板上。由于目鏡測微計(jì)所測量的是微生物細(xì)胞經(jīng)過顯微鏡放大之后所成像的大小，刻度實(shí)際代表的長度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數(shù)及鏡筒的長度而改變，所以，使用前須先用鏡臺(tái)測微計(jì)進(jìn)行標(biāo)定，求出某一放大率下，目鏡測微計(jì)每一小格所代表的長度，然后用目鏡測微計(jì)直接測被測對象的大小。鏡臺(tái)測微計(jì)是一塊中央有精確刻玻片，刻度的總長為lmm，等分為100小格，每小格長10um，專用于對目鏡測微計(jì)進(jìn)行標(biāo)定的。裝訂線2、利用血球計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。缺點(diǎn)：不能區(qū)分死菌與活菌；不適于對運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)；需要相對高的細(xì)菌濃度；個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。三、主要儀器設(shè)備1、器械：顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺(tái)測微尺，載玻片、蓋玻片、血球計(jì)算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤、洗瓶、接種環(huán)、酒精燈、火柴、滴管2、材料：培養(yǎng)好的啤酒酵母斜面菌體和菌懸液、染液四、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1、微生物菌體大小的測定①目鏡測微尺的校正：更換目鏡鏡頭：更換目鏡測微尺鏡頭（標(biāo)記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，制成一個(gè)目鏡測微尺的鏡頭。某一倍率下標(biāo)定目鏡刻度：將鏡臺(tái)測微尺置于載物臺(tái)上，使刻度面朝上，先用低倍鏡對準(zhǔn)焦距、看清鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺(tái)測微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器使兩尺重疊，并使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度間的目鏡測微尺的格數(shù)和鏡臺(tái)測微尺的格數(shù)。計(jì)算該倍率下目鏡刻度：目鏡測微尺每格長度=鏡臺(tái)測微尺格數(shù)/目鏡測微尺格數(shù)xl0um標(biāo)定并計(jì)算其他放大倍率下的目鏡刻度：以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測定目鏡測微尺每格代表的實(shí)際長度。如此測定后的測微尺的長度，僅適用于測定時(shí)使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。②菌體大小的測定將啤酒酵母制成水浸片。P.實(shí)驗(yàn)名稱：_______________________________姓名：________________學(xué)號(hào)：__________________P.大小換算：將標(biāo)本先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺測定每個(gè)菌體長度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長和寬。求平均值：一般測量微生物細(xì)胞的大小，用同一放大倍數(shù)在同一標(biāo)本上任意測定l0一20個(gè)菌體后，求出其平均值即可代表該菌的大小。2、用血球計(jì)數(shù)板測定微生物細(xì)胞的數(shù)量①檢查血球計(jì)數(shù)板取血球計(jì)數(shù)板一塊，先用顯微鏡檢查計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著的菌體，若有污物則通過擦洗、沖洗，使其清潔。鏡檢清洗后的計(jì)數(shù)板，直至計(jì)數(shù)室無污物時(shí)才可使用。②

稀釋樣品將培養(yǎng)后的酵母培養(yǎng)液振蕩振搖混勻，然后作一定倍數(shù)的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數(shù)為宜。一般以每小格內(nèi)含4～5個(gè)菌體的稀釋度為宜。③加樣取出一塊干凈蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板中央。用滴管取1滴菌稀釋懸液注入蓋玻片邊緣，讓菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置5—10分鐘。④鏡檢裝訂線待細(xì)胞不動(dòng)后進(jìn)行鏡檢計(jì)數(shù)。先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室方格后，再用高倍鏡測數(shù)。一般應(yīng)取上下及中央五個(gè)中格的總菌數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)若遇到位于線上的菌體，一般只計(jì)數(shù)格上方（下方）及右方（左方）線上的菌體。每個(gè)樣品重復(fù)3次。裝訂線⑤計(jì)算取以上計(jì)數(shù)的平均值，按下列公式計(jì)算出每毫升菌液中的含菌量。

菌體細(xì)胞數(shù)＝小格內(nèi)平均菌體細(xì)胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)⑥清洗計(jì)數(shù)板用畢后先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若計(jì)數(shù)的樣品是病原微生物，則須先浸泡在5%石炭酸溶被中進(jìn)行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理微生物菌體大小的測定目鏡測微尺的校正目鏡放大倍數(shù)物鏡放大倍數(shù)鏡臺(tái)測微尺格數(shù)目鏡測微尺格數(shù)1010201910402075菌體大小的測定細(xì)菌序號(hào)12345678910長/格22.522.53.13.02.22.41.93.2寬/格0.20.20.20.30.20.30.50.30.20.42、用血球計(jì)數(shù)板測定微生物細(xì)胞的數(shù)量小方格數(shù)44444平均值/個(gè)/格細(xì)菌數(shù)目32292830287.35六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析P.實(shí)驗(yàn)名稱：_______________________________姓名：________________學(xué)號(hào)：__________________P.1、計(jì)算出目鏡測微尺在低、高倍鏡下的刻度值利用公式：目鏡測微尺每格長度=鏡臺(tái)測微尺格數(shù)/目鏡測微尺格數(shù)xl0um，可得低倍鏡下（10*10放大倍數(shù)）目鏡測微尺的刻度值=20/19*10um=10.526um高倍鏡下（10*40放大倍數(shù)）目鏡測微尺的刻度值=20/75*10um=2.667um記錄菌體大小的測定結(jié)果記錄菌體大小的測定結(jié)果由高倍鏡下目鏡測微尺的刻度值可得油鏡下的目鏡測微尺刻度值：2.667*40/100=1.067um細(xì)菌序號(hào)12345678910平均值長/nm3.1342.6683.1342.6683.3083．2012．3472.5612.0273.4142.846寬/um0.2130.2130.2130.3200.2130.3200.5340.3200.2130.4270.2993、計(jì)算樣品中酵母菌濃度裝訂線利用公式：菌體細(xì)胞數(shù)＝小格內(nèi)平均菌體細(xì)胞數(shù)×400×104×稀釋倍數(shù)，可得：裝訂線菌體細(xì)胞數(shù)=7.35*400*104*1=2.94*107于是菌體濃度=菌體細(xì)胞數(shù)/V=2.94*107個(gè)/1mL=2.94*107個(gè)/mL分析油鏡下目鏡測微尺的刻度值用高倍鏡（10*40）的結(jié)果推得，原因是油鏡下若要側(cè)目鏡測微尺的刻度值，則必須在物鏡測微尺上滴香柏油，這樣會(huì)損壞物鏡測微尺。而且從低倍鏡和高倍鏡下目鏡測微尺的刻度值可以看出，由低倍鏡推得高倍鏡的刻度值為10.526*400/100=2.632，與實(shí)際測得的值之間的誤差為△=(2.667-2.632)/2.667*100%=1.31%。因此油鏡條件下由400倍的目鏡測微尺的刻度值推得1000倍放大倍數(shù)下的目鏡測微尺的刻度值是合理的。在實(shí)驗(yàn)中得知，所得的菌體濃度偏低，幾和其他組已經(jīng)稀釋過的菌體濃度相似。原因可能是我們所測得菌體濃度是其他組已經(jīng)稀釋過的菌體（很多組同用一支細(xì)菌懸濁液）。七、討論、心得1、為什么目鏡測微尺必須用鏡臺(tái)測微尺來校正？由于目鏡測微計(jì)所測量的是微生物細(xì)胞經(jīng)過顯微鏡放大之后所成像的大