膠束毛細(xì)管電泳法分離雙黃酮類化合物

膠束毛細(xì)管電泳法分離雙黃酮類化合物

大多數(shù)側(cè)柏植物用于治療肝炎、膽囊炎、腫瘤和緩慢性腎炎。它也被用作慢性支氣管炎的報(bào)道，具有明顯的效果。雙黃酮類化合物是該屬植物的主要有效化學(xué)成分。到目前為止,從該屬植物中分離并鑒定出的雙黃酮有十幾種,這些雙黃酮具有廣泛的藥理活性,如抗腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性、解痙活性和抗流感病毒活性。因此,控制該屬植物中雙黃酮的含量十分重要。目前,分析雙黃酮含量的方法主要是HPLC法,該方法不適合等度洗脫,且分離效果不理想。高效毛細(xì)管電泳(HPCE)作為一種現(xiàn)代分離模式具有分離柱效高、進(jìn)樣體積小和分析快速等特點(diǎn),尤其是膠束毛細(xì)管電泳(MECC),它提供了一種獨(dú)特的分離模式,并且具有分離中性化合物的能力。因此,選用MECC法進(jìn)行雙黃酮類成分的分析研究。1試劑與藥品、試劑美國(guó)BeckmanP/ACE5500型毛細(xì)管電泳儀,DAD檢測(cè)器,彈性石英毛細(xì)管柱(80cm×75μm,有效長(zhǎng)度70cm,河北永年光導(dǎo)纖維廠)。膽酸鈉(BR,上?？曝S化學(xué)試劑有限公司)、十二烷基磺酸鈉(SDS,純度≥99.9%,德國(guó)Sena公司)及去氧膽酸鈉(BR,上?？曝S化學(xué)試劑有限公司)為生化試劑。其他如硼砂、磷酸二氫鈉均為分析純,乙腈為色譜純。對(duì)照品穗花杉雙黃酮(amentoflavone)、扁柏雙黃酮(hinokiflavone)和銀杏雙黃酮(ginkegetin)為從中華卷柏中分得,并經(jīng)IR、NMR及MS等譜學(xué)鑒定,HPLC峰面積歸一化法測(cè)得純度均大于98.5%。槲皮素(批號(hào):100081-200406)來自中國(guó)藥品生物制品檢定所。實(shí)驗(yàn)供試品均在7～9月份采自河北、云南、福建等省,并由中國(guó)藥品生物制品檢定所張繼副主任藥師鑒定。實(shí)驗(yàn)中配制緩沖液和供試品溶液所用的水均為去離子水(MilliQ)。2柱溫和檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)樣方式,壓力進(jìn)樣1.38×105Pa,9s;運(yùn)行時(shí)間,35min;電壓,20kV(恒壓分析);柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)280nm;運(yùn)行緩沖液為膽酸鈉系統(tǒng)(10mmol·L-1硼酸鈉,15mmol·L-1磷酸二氫鈉,40mmol·L-1膽酸鈉)-乙腈(3:2),pH=7.0。每次運(yùn)行前毛細(xì)管用0.1mmol·L-1氫氧化鈉溶液沖洗2min,去離子水沖洗2min,運(yùn)行緩沖液沖洗2min。3濃縮液制備工藝稱取供試品1g,加甲醇50mL,以索氏提取器回流提取5h,提取液濃縮至25mL。取5mL置10mL量瓶中,加內(nèi)標(biāo)溶液(0.5mg·mL-1的槲皮素甲醇液)1mL,以甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。此供試品溶液過0.45μm的微孔濾膜后注入毛細(xì)管電泳系統(tǒng)。4方法學(xué)的檢驗(yàn)4.1對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)照品穗花杉雙黃酮、卷柏雙黃酮和銀杏雙黃酮適量,用甲醇溶解制成上述3種成分濃度分別為0.2028,0.1680,0.1321mg·mL-1的混合儲(chǔ)備液。分別精密吸取儲(chǔ)備液1,2,4,6,8mL于10mL量瓶中,加0.503mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)溶液(槲皮素甲醇溶液)0.5mL,加甲醇至刻度,搖勻,制成系列的對(duì)照品溶液,進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)量峰面積值。對(duì)照品與內(nèi)標(biāo)峰面積比值Y和各對(duì)照品的濃度X(mg·mL-1)之間呈良好的線性關(guān)系,線性范圍及回歸方程見表1。4.2對(duì)照品溶液的制備精密量取含0.04056mg·mL-1穗花杉雙黃酮、0.2016mg·mL-1卷柏雙黃酮、0.0528mg·mL-1銀杏雙黃酮和0.0503mg·mL-1內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品混合溶液,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果表明:穗花杉雙黃酮、卷柏雙黃酮、銀杏雙黃酮與內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD分別為4.1%,3.2%,3.6%。4.3測(cè)定穗花杉、卷柏雙黃酮和銀杏雙黃酮含量的測(cè)定取中華卷柏供試品6份,按“3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2”項(xiàng)條件下測(cè)定穗花杉雙黃酮、卷柏雙黃酮和銀杏雙黃酮的含量。供試品含量的平均值分別為0.960%,0.500%,0.004%;RSD分別為4.6%,4.0%,13.4%。4.4對(duì)照品溶液配制取已知含量的中華卷柏供試品(穗花杉雙黃酮0.90%,卷柏雙黃酮0.501%,銀杏雙黃酮0.0035%)5份,每份0.2g,前3份分別加含2.273mg·mL-1穗花杉雙黃酮和1.968mg·mL-1卷柏雙黃酮的對(duì)照品混合溶液1mL,后2份分別加此對(duì)照品混合溶液2mL。按“3”項(xiàng)下方法制備所需溶液,在“2”項(xiàng)條件下測(cè)定穗花杉雙黃酮、卷柏雙黃酮的含量,計(jì)算回收率。穗花杉雙黃酮低加入量的回收率(n=3)為96.34%(RSD=0.92%),高加入量的回收率(n=2)為97.34%(偏差為1.2%);卷柏雙黃酮低加入量的回收率為101.8%(RSD=4.4%),高加入量的回收率(n=2)為98.50%(偏差為3.4%)。另取該供試品5份,每份0.5g,前3份分別加濃度為0.810mg·mL-1的銀杏雙黃酮對(duì)照品溶液1mL;后2份分別加此對(duì)照品溶液2mL。按“3”項(xiàng)下方法制備所需溶液,在“2”項(xiàng)條件下測(cè)定銀杏雙黃酮的含量,計(jì)算回收率。銀杏雙黃酮低加入量的回收率(n=3)為99.17%(RSD為3.3%),高加入量的回收率(n=2)為96.53%(偏差為1.9%)。4.5峰面積的測(cè)定取供試品溶液,按上述電泳條件于0,0.5,1,2,4,8h分別進(jìn)樣測(cè)定峰面積,穗花杉雙黃酮、卷柏雙黃酮和銀杏雙黃酮峰面積的RSD分別為3.7%,5.1%,4.7%。結(jié)果表明,3個(gè)組分的甲醇提取液在8h內(nèi)穩(wěn)定。5e含量測(cè)定取供試品1g,按“3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2”項(xiàng)條件下測(cè)定,以內(nèi)標(biāo)法計(jì)算穗花杉雙黃酮、卷柏雙黃酮和銀杏雙黃酮的含量。各供試品的含量結(jié)果見表2。6討論6.1去氧膽酸鈉系統(tǒng)的分離和研磨雙黃酮類化合物由于雙黃酮類化合物具有強(qiáng)的疏水特性,用常規(guī)的毛細(xì)管電泳法分離比較困難。所以,選用MECC法進(jìn)行研究。本文比較和優(yōu)化了幾種分離系統(tǒng),包括SDS系統(tǒng)、膽酸鈉系統(tǒng)和去氧膽酸鈉系統(tǒng)。在SDS系統(tǒng)中,試驗(yàn)了不同濃度的SDS及不同比例的添加劑(如硼砂,磷酸二氫鈉,Tris鹽,β-環(huán)糊精等)和有機(jī)改進(jìn)劑(如甲醇、乙醇、正丙醇及乙腈等),pH6～10。結(jié)果表明:SDS系統(tǒng)無法分離強(qiáng)疏水性的雙黃酮類化合物,幾個(gè)成分峰始終疊加在一起;在對(duì)去氧膽酸鈉系統(tǒng)(40mmol·L-1去氧膽酸鈉,10mol·L-1硼酸,pH=8.6,11%的甲醇)的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),這一系統(tǒng)對(duì)于分離雙黃酮有一定的改善。膽酸鈉系統(tǒng)分離效果最好。這可能與膽酸鈉膠束的特殊結(jié)構(gòu)有關(guān),在水溶液中,常規(guī)的SDS膠束呈球狀,而膽酸鈉膠束呈螺旋狀,此種膠束的疏水部分在膠束的外側(cè),親水部分向內(nèi)翻轉(zhuǎn)。這種“內(nèi)翻螺旋”結(jié)構(gòu)具有許多色譜特性,除本身具有較強(qiáng)的識(shí)別特性外,還能承受高濃度的有機(jī)改進(jìn)劑,這個(gè)特性對(duì)分析疏水性化合物有著特殊的意義。但這一體系受許多因素制約,如pH不能低于7.0,有機(jī)改進(jìn)劑濃度不能過高等。參照有關(guān)文獻(xiàn),本實(shí)驗(yàn)選擇的運(yùn)行緩沖液為膽酸鈉系統(tǒng)-乙腈。并對(duì)pH、表面活性劑膽酸鈉的濃度以及有機(jī)改進(jìn)劑乙腈的比例進(jìn)行優(yōu)化。6.2緩沖區(qū)緩沖區(qū)優(yōu)化6.2.1ph對(duì)分離選擇性的影響運(yùn)行緩沖液的pH既可改變?nèi)苜|(zhì)的結(jié)構(gòu),使溶質(zhì)電離或呈中性狀態(tài),又可改變電滲流的大小,所以,pH對(duì)CE分離有較大的影響,因此本文在保持其他條件不變的情況下,改變pH(pH用稀氫氧化鈉溶液或稀鹽酸溶液調(diào)節(jié))以研究pH對(duì)分離選擇性的影響,見圖1。由圖可見,不同pH條件下,各個(gè)雙黃酮的遷移時(shí)間有很大變化,pH為7.0時(shí),分離最理想,當(dāng)pH大于7時(shí),峰遷移時(shí)間加長(zhǎng),峰展寬。6.2.2膽酸鈉濃度的選擇在膽酸鈉系統(tǒng)其他條件不變(10mmol·L-1硼砂,15mmol·L-1磷酸二氫鈉,pH=7.0)的情況下調(diào)節(jié)膽酸鈉濃度從10到50mmol·L-1來研究膽酸鈉濃度對(duì)分離選擇性的影響,結(jié)果見圖2。隨著膽酸鈉濃度的升高,各溶質(zhì)的遷移時(shí)間也加長(zhǎng),這是因?yàn)槟懰徕c濃度的升高,也提高了水相中膠束的相比,導(dǎo)致了這些化合物遷移時(shí)間的加長(zhǎng)。然而,當(dāng)膽酸鈉濃度達(dá)到50mmol·L-1時(shí),各色譜峰發(fā)生了變形。所以,選擇40mmol·L-1作為試驗(yàn)濃度。另外,與常規(guī)的SDS系統(tǒng)相反,在膽酸鈉系統(tǒng)中,極性大的溶質(zhì)后出峰,這可能與膽酸鈉膠束的內(nèi)翻結(jié)構(gòu)與極性內(nèi)核有關(guān)。6.2.3膽酸鈉系統(tǒng)表面活性劑的相互作用有機(jī)改進(jìn)劑對(duì)化合物分離有重要的影響,它能影響溶質(zhì)在膠束相和水相中的分布;改變膠束化學(xué)平衡及影響水相-膠束相中改進(jìn)劑、表面活性劑之間的相互作用。在膽酸鈉系統(tǒng)中,膽酸鈉膠束能相容高濃度的有機(jī)改進(jìn)劑,這一點(diǎn)十分有利于強(qiáng)疏水性化學(xué)成分的分析。在保持其他條件不變的前提下,從10%到50%改變乙腈的比例來考察乙腈的量對(duì)分離度的影響,見圖3。從圖中可以看出,隨著乙腈比例的升高,卷柏雙黃酮和穗花杉雙黃酮的遷移時(shí)間加長(zhǎng),而銀杏雙黃酮的遷移時(shí)間縮短。乙腈為40%時(shí),3個(gè)雙黃酮的分離最為理想。6.2.4膽酸鈉系統(tǒng)-乙腈沖液的制備根據(jù)以上優(yōu)化結(jié)果,參照有關(guān)文獻(xiàn),最終確定運(yùn)行緩沖液為膽酸鈉系統(tǒng)(10mmol·L-1硼砂,15mmol·L-1磷酸二氫鈉,40mmol·L-1膽酸鈉)-乙腈(3:2),pH=7.0。6.3樣品提取工藝研究6.3.1供試品溶液的制備方法一:取藥材粉末1g,以氯仿50mL作溶劑,索氏提取器回流提取4h,氯仿提取液蒸干,殘?jiān)蛹状?0mL溶解,作為第1份供試品溶液;氯仿提取后的藥渣繼續(xù)用甲醇50mL提取5h,提取液定容至50mL,作為第2份供試品溶液。方法二:取藥材粉末1g,置于索氏提取器中,加甲醇50mL直接回流提取5h,提取液定容至50mL,作為第3份供試品溶液。取以上3種供試品溶液按“2”項(xiàng)條件分析。結(jié)果證明:第1份供試品溶液的電泳圖基本為一基線,沒有黃酮提出來,第2份供試品溶液和第3份供試品溶液的圖譜基本一致,所以,實(shí)驗(yàn)選擇供試品直接用甲醇提取,不需要脫脂。6.3.2樣品的提取時(shí)間取供試品1g,置索氏提取器中,用甲醇50mL提取,于不同時(shí)間0.5,1,2,3,4,5,6h進(jìn)行取樣分析,結(jié)果供試品在5