雞馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生病、雞傳染性貧血病病毒的檢測

雞馬立克氏病、網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞增生病、雞傳染性貧血病病毒的檢測

近年來，我國出現(xiàn)了以死雞瘦素或高度瘦素為主要臨床特征的傳染病。對這種自然疾病的雞，我們可以看到各種器官的腫瘤變化，胸腺、脾臟和其他免疫器官的明顯腫脹和收縮。也有很大一部分發(fā)病雞僅表現(xiàn)為輕度消瘦,腺胃輕度腫脹或無明顯異常,其它組織器官也未發(fā)現(xiàn)明顯病變,但其生產(chǎn)性能明顯下降,常規(guī)疫苗免疫效果不佳,給養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大損失。針對上述臨床癥狀和病理變化,自2000年以來我們采用核酸探針雜交技術(shù)對來自全國包括臺灣在內(nèi)11個省份42個自然發(fā)病雞群的828只雞的組織樣品進行了MDV、CAV和REV共感染的流行病學調(diào)查,以獲得國內(nèi)免疫抑制病分布狀況的第一手資料,為指導生產(chǎn)提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1表面活性劑提取法從山東、河南、河北、北京、江蘇、廣東、廣西、四川、吉林、遼寧、臺灣11省42個不同雞群收集臨床有發(fā)病表現(xiàn)的828只病、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、腺胃、法氏囊或羽毛囊等。對組織樣品,各取0.1g研磨(如果是羽毛樣品,則剪取12根羽毛囊根,每根約長2mm),加入0.5mLDNA抽提緩沖液(100mmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA,pH8.0,0.5%SDS)和終濃度為100μg/mL的蛋白酶K,55℃消化過夜。次日,按常規(guī)方法提取組織DNA,溶解于適量TE緩沖液中,即為樣品DNA。同時提取SPF雞(由山東濟南斯帕法斯SPF雞場提供)相應組織的DNA作陰性對照。1.2pcr法提取模板dnaⅠ型MDVMd11株pp38基因的特異性片段PCR產(chǎn)物用于標記MDV探針;REVSNV株全基因組cDNA克隆用于標記REV探針;CAVCux-1株全基因組DNA克隆用于標記CAV探針。將完全線性化的REV和CAV質(zhì)粒DNA以及MDVPCR產(chǎn)物用苯酚氯仿抽提后,用乙醇沉淀,溶于15μL去離子水中,然后按以下步驟進行探針標記:模板DNA在100℃水浴煮10min,使模板DNA變性,立即置于-20℃保存的冰凍乙醇中冷卻5min;離心后將變性的模板DNA定容至15.0μL,然后加入2.0μL六核苷酸引物,2.0μLdNTP標記混合液,1.0μLKlenow片斷,37℃水浴20h以上;加入2.0μL0.2mol/LEDTA(pH8.0)終止反應;加入2.5μL4mol/LLiCl和75μL無水乙醇,充分混合;置-20℃2h沉淀探針;12000r/min離心10min沉淀探針,用70%乙醇洗滌,充分干燥;將探針DNA溶入50μLTEBuffer(pH8.0)中,-20℃保存?zhèn)溆谩?.3采用斑點分散法檢測sdv、cav和rev1.3.1dna含量檢測取一定量板(1%瓊脂糖凝膠+適量溴化乙錠),用DL2000Marker倍比遞進稀釋作對照,各取樣1μL點板,吸收后,用凝膠成像系統(tǒng)根據(jù)亮度判定樣品DNA含量。所有樣品中DNA含量均大于每微升0.2μg。1.3.2fps雞相應組織的dna表達將3張適當大小硝酸纖維素膜(NC膜)作好標記,取樣品在3張膜上各點1μL。已知含有MDV、CAV、REV核酸的相應組織DNA作陽性對照,用SPF雞相應組織的DNA作陰性對照。將NC膜(點樣面朝上)放于已用變性液(0.5mol/LNaOH,0.5mol/LNaCl)飽和的雙層濾紙上變性10min,放于中和液(0.5mol/LTris-HCl,1.5mol/LNaCl,,pH7.4)飽和的雙層濾紙上中和10min,室溫下自然干燥30min,然后在80℃烤2h以固定DNA。1.3.3抗digoxihenin抗體sc的制備方法將NC膜放入預雜交液(5×SSC,0.5%SDS,1mmol/LEDTA,pH8.0)中,于68℃反應2h,其間經(jīng)常搖動NC膜,然后分別在含有Dig-標記的MDV、CAV、REV核酸探針的雜交液中68℃雜交過夜;放入洗滌液Ⅰ(1×SSC,0.1%SDS)中于室溫下洗滌2×15min;放入洗滌液Ⅱ(0.1×SSC,0.1%SDS)中于68℃洗滌2×15min;在緩沖液I(0.1mol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl,pH7.5)中洗1min;在緩沖液Ⅱ(緩沖液Ⅰ中加入0.5%封閉試劑)中于室溫反應30min進行封閉,用緩沖液Ⅰ洗滌1min;在20mL緩沖液中加入4μL堿性磷酸酶標記的抗Digoxigenin抗體,37℃反應30min;用緩沖液Ⅰ洗膜5×5min;在緩沖液Ⅲ(0.1mol/LTris-HCl,0.1mol/LNaCl,0.05mol/LMgCl2,pH9.5)中平衡30min;10mL緩沖液Ⅲ中加入40μLNBT及35μLBCIP,將NC膜浸入其中避光顯色過夜,清水終止反應。2結(jié)果2.13dv、rev、cav陽性經(jīng)過特異性核酸探針檢測,在828只雞的樣品中,MDV陽性為695只,REV陽性為505只,CAV陽性為474只。部分樣品經(jīng)過MDV、REV、CAV特異性核酸探針檢測后顯色結(jié)果分別見圖1、圖2、圖3。2.23重復感染發(fā)生情況828只自然發(fā)病雞中,有370只發(fā)生MDV、REV和CAV的三重感染,258只發(fā)生了二重感染,127只發(fā)生了單重感染,僅有73只為陰性;42個被檢雞群中的29個存在三重感染,8個雞群存在二重感染,3個雞群只檢測到MDV,僅有2個雞群未檢測到這三種病毒。3種病毒感染狀態(tài)的具體數(shù)字和比例見表1。2.3不同雞群中三種病毒的感染率2001～2002年,對山東某雞場同一發(fā)病雞群分別在125日齡、180日齡和300日齡進行的跟蹤檢測結(jié)果表明,同一雞群中這三種病毒的感染率呈逐漸遞增趨勢,三種病毒的感染率曲線見圖4。3感染情況和種類對雞群的影響近年來,分子生物學的檢測手段在動物病毒病的檢測中得到了普遍的運用。相對于常規(guī)的病毒分離培養(yǎng)技術(shù)而言,PCR技術(shù)和核酸探針雜交技術(shù)均大大提高了檢出的靈敏度,但由于PCR反應過程中影響反應結(jié)果的因素太多,很容易導致假陰性及假陽性結(jié)果出現(xiàn),而核酸探針雜交技術(shù)在靈敏度方面與PCR技術(shù)相當,但其可重復性與特異性更高,結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。自2000年以來我們采用核酸探針雜交技術(shù)對來自全國包括臺灣在內(nèi)11個省份臨床有免疫抑制表現(xiàn)的42個自然發(fā)病雞群的828只雞的組織樣品進行了MDV、CAV和REV共感染的流行病學調(diào)查,結(jié)果表明:發(fā)病雞中這三種病毒的檢出率均相當高,分別為83.94%(MDV)、61.0%(CAV)和57.25%(REV);發(fā)病雞中存在非常嚴重的二重感染(31.16%)和三重感染(44.69%),單重感染和陰性個體僅占15.34%和8.82%;在42個雞群中的29個存在MDV、CAV和REV的三重感染,占雞群總數(shù)的69.05%,5個雞群存在MDV和CAV的共感染,3個雞群存在MDV和REV的共感染,二重感染占雞群總數(shù)的19.05%,僅有7.14%的雞群只檢測到MDV,4.76%的雞群未檢測到這三種病毒。從地域分布來看,十一個省份均檢測到了MDV、REV和CAV,表明了這三種病毒在我國的廣泛分布。總體分析MDV、REV和CAV在自然發(fā)病雞群中的感染率隨年份變化不大,這說明MDV、REV和CAV這三種病毒在我國的廣泛分布已有相當長的時間,并且已經(jīng)達到某種分布的均衡狀態(tài)。但連續(xù)三次對山東某雞場同一雞群進行的跟蹤檢測結(jié)果表明,同一雞群中這三種病毒的感染率呈逐漸遞增趨勢。42個雞群共包括了AA肉雞、AA肉種雞、海賽克斯、褐佳、海蘭褐、海蘭灰、新紅黑、羅曼蛋雞、青腳麻雞、快青麻、優(yōu)黃、土三黃,以及臺灣、江蘇、廣西、山東等地的地方土雞品種,檢測結(jié)果表明不同品種發(fā)病雞MDV、REV和CAV三種病毒的檢出率均相當高,但三種病毒的感染在同一品種的不同雞群中差別非常大,顯示感染與品種之間無明顯相關(guān)性。近年來,在我國雞群中MDV引起的感染仍時有發(fā)生,同以往不同的是,這種感染的發(fā)生常常伴有REV和CAV等其它疾病的混合感染。42個雞群中的40個檢測到了MDV,盡管其中12個雞群曾進行過MDVⅠ型弱毒疫苗的免疫,而用核酸探針雜交技術(shù)并不能區(qū)分MDVⅠ型強毒株和弱毒疫苗株,但我們在對這12個雞群中的7個進行病毒分離時,均得到了區(qū)別于疫苗株的MDV野毒株,這也表明了MDV野毒株感染的普遍存在。REV和CAV的檢出率之高(分別為32/42和34/42)則有些出乎意料,究其原因可能由于CAV和REV不僅能橫向接觸傳染,而且可通過雞蛋垂直傳染。而我國多年來一直普遍使用非SPF雞胚生產(chǎn)的弱毒疫苗造成的CAV和REV的污染和雞群感染可能是二者普遍存在的主要原因。近年來,雞群腫瘤病的發(fā)生原因及臨床表現(xiàn)與病理變化越來越復雜。我國出現(xiàn)的以腺胃高度腫脹為特征的所謂傳染性腺胃病,雖然對其病因眾說不一,但很多時候是由于腺胃發(fā)生腫瘤病變而表現(xiàn)出來的腺胃高度腫脹。由于MDV和REV單獨感染就可以導致腫瘤病變并極有可能表現(xiàn)為腺胃的腫大,二者協(xié)同或與CAV協(xié)同作用導致更