水稻褐飛虱sal共生細(xì)菌16srdna序列的初步研究

水稻褐飛虱sal共生細(xì)菌16srdna序列的初步研究

黃褐色頭虱（i類）是水稻生產(chǎn)中的主要害蟲，通過吸收水稻的皮部果汁而成為主要寄生蟲。適應(yīng)性強(qiáng)，易適應(yīng)抗體水生物品種，新的抗性（呂仲賢等，1999）。有研究表明,刺吸危害的昆蟲體內(nèi)普遍存在內(nèi)共生菌,內(nèi)共生菌的存在可以為宿主提供必須的營養(yǎng)物質(zhì)、影響宿主昆蟲適應(yīng)環(huán)境或人為脅迫(如殺蟲劑)的能力(MuradandSvetlana,2009)。它可以通過產(chǎn)生具有抗真菌作用的代謝物來提高宿主對病原真菌的抗性,或產(chǎn)生有毒物質(zhì)保護(hù)宿主免于被捕食(徐紅星等,2009)。另有一些共生菌可以改變宿主昆蟲的種群生態(tài),如在昆蟲生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的Wolbachia(Werren,1997)。因此,對褐飛虱體內(nèi)共生菌種類的鑒定和分析將有助于了解褐飛虱適應(yīng)性強(qiáng)、致害性易于發(fā)生變化的機(jī)制。已報(bào)道的昆蟲內(nèi)共生菌主要集中在酵母類內(nèi)共生菌和真細(xì)菌類內(nèi)共生菌。例如蚜蟲體內(nèi)細(xì)菌類共生菌布赫納氏屬Buehnera,通過分析其全基因組發(fā)現(xiàn)含有幾乎所有必需氨基酸的合成基因,可以為宿主蚜蟲提供多種必需氨基酸(Shigenobuetal.,2000)?；绎w虱體內(nèi)的共生細(xì)菌Wolbachia被證明可以改變宿主的生殖行為,調(diào)節(jié)繁殖能力,使得含有該共生菌的宿主灰飛虱表現(xiàn)出生殖優(yōu)勢(Giordanoetal.,1997)。Wolbachia又稱為立克次氏體(O’Neilletal.,1992),自然界中約16%的昆蟲物種受其感染。在褐飛虱體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在有Wolbachia(甘波誼等,2000)。目前對褐飛虱體內(nèi)共生菌的研究主要集中于類酵母型共生菌(yeast-likesymbiont,YLS),發(fā)現(xiàn)YLS含有高活性的尿酸酶,能夠利用寄主的代謝廢棄物(尿酸)合成褐飛虱生長發(fā)育所必需的氨基酸,YLS還可能為褐飛虱提供維生素B、固醇等營養(yǎng)物質(zhì)(Sasakietal.,1996;王國超等,2005),YLS也可能影響褐飛虱對抗性品種的適應(yīng)性(LeeandHou,1987)由于昆蟲體內(nèi)共生細(xì)菌難以人工培養(yǎng),極大地限制了其研究。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)研究方法和技術(shù)手段的不斷發(fā)展和應(yīng)用,近幾年來關(guān)于昆蟲體內(nèi)共生細(xì)菌的研究有了很大進(jìn)展。細(xì)菌的16SrDNA(編碼16SrRNA的基因)在漫長的進(jìn)化中具有高度的保守性而且其長度適中(約1500個(gè)核苷酸)便于測序,近年來已被細(xì)菌分類學(xué)家廣泛用于細(xì)菌的遺傳特性、分子差異、發(fā)育進(jìn)化和分類學(xué)研究(陳文新,1998)。Arsenophonus屬共生菌在昆蟲體內(nèi)的分布已有廣泛的報(bào)道,但對其功能卻知之甚少(Novákováetal.,2009),殺雄菌屬有致使寄主昆蟲生殖異常的報(bào)道(Ghernaetal.,1991),但相比于Wolbachia,對Arsenophonus共生菌在褐飛虱體內(nèi)的鑒定、分布和功能尚無報(bào)道。本研究通過對16SrDNA的擴(kuò)增和測序,在褐飛虱體內(nèi)鑒定出殺雄菌屬Arsenophonus類共生細(xì)菌,對褐飛虱體內(nèi)與其他昆蟲體內(nèi)該屬共生菌進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育的分析,并對該共生菌在不同褐飛虱地理種群及寄主種群中的分布進(jìn)行了研究。1材料和方法1.1褐飛病宿主種群褐飛虱地理種群:分別于2008年4-9月采自我國不同稻區(qū)以及越南和菲律賓等東南亞國家(表1),在室內(nèi)于感蟲水稻品種TN1上飼養(yǎng)1～3代后供試。褐飛虱寄主種群:為本實(shí)驗(yàn)室培育的3個(gè)褐飛虱寄主種群,即TN1種群、Mudgo種群和ASD7種群,分別用感蟲水稻品種TN1和抗蟲水稻品種Mudgo(含抗蟲基因Bph1)、ASD7(含抗蟲基因bph2)連續(xù)飼養(yǎng)了150多代。水稻品種:包括感蟲品種TN1,抗蟲水稻品種Mudgo和ASD7,催芽播種后于溫室水泥池培育到分蘗期備用。1.2u3000酸、堿、聚合劑、提取液、水提取液制備每一種群取10頭成蟲用75%酒精表面消毒,滅菌水清洗5次后提取DNA。先加入150μL提取液(1.0%SDS、0.1mol/LTris-HClpH9.0、0.05mol/LEDTA、0.1mol/LNaCl、6.486%蔗糖)研磨后,再加入450μL提取液,65℃溫浴30min,加入112μL8.0mol/LKAc(pH9.0),冰浴30min。加入等體積的氯仿12000r/min離心15min,上清用2倍體積的冰凍無水乙醇室溫沉淀1h,12000r/min離心15min,沉淀干燥后用100μLTE溶解,定量后儲(chǔ)存于4℃冰箱備用。1.31pcr擴(kuò)增和生物測序取褐飛虱TN1種群DNA100ng,利用16SrDNA通用引物16s-F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(Amannetal.,1995),16s-R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′(Weisburgetal.,1991)在25μL體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為1×PCRbuffer、0.2mmol/LdNTP、0.2μmol/L引物、0.2UTaq酶。反應(yīng)程序:95℃變性5min,94℃30s、52℃1min、72℃1min35個(gè)循環(huán),72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后,對獲得的約1500bp的擴(kuò)增片斷和550bp片斷切膠,參照天根生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的DNA純化回收試劑盒(DP214)說明回收PCR產(chǎn)物。產(chǎn)物參照Invitrogen公司的PCR?2.1-Topo克隆試劑盒(K4500-01)說明進(jìn)行T-A克隆,白斑經(jīng)菌落PCR鑒定后送Invitrogen公司測序。測得序列經(jīng)相互比對后應(yīng)用BLAST程序(/Blast.cgi)進(jìn)行相似性搜索,確定所得序列來源的共生菌類別。在此基礎(chǔ)上,利用獲得的褐飛虱共生菌相關(guān)的16SrDNA序列重新設(shè)計(jì)引物,進(jìn)一步研究不同褐飛虱地理種群和寄主種群中該序列的分布情況。1.4褐飛績效測定將測定的褐飛虱16SrDNA序列和部分NCBI網(wǎng)上下載的其他昆蟲體內(nèi)同一Arsenophonus屬共生細(xì)菌的16SrDNA序列采用ClustalXVersion1.83軟件進(jìn)行多重比對,通過MEGA4.1軟件分析多重比對結(jié)果,并用Neighbor-Joining方法構(gòu)建褐飛虱共生細(xì)菌Arsenophonus屬16SrDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹。1.5水稻篩選中arsenophonus擴(kuò)增引物和種子檢測為了研究Arsenophonus屬共生菌是否廣泛存在于不同褐飛虱地理種群和寄主種群體內(nèi)以及該菌是否存在于飼喂褐飛虱的水稻寄主中,本研究利用Arsenophonus特異的23SrDNA序列引物(ARS23S-F:5′-CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA-3′,ARS23S-R:5′-GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC-3′)(ThaoandBaumann,2004;MuradandSvetlana,2009)對不同水稻品種、不同褐飛虱寄主種群和地理種群的DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系和條件同1.3。1.63定量pcr分析取3種褐飛虱寄主種群的成蟲各40頭分為4組即4個(gè)重復(fù),提取DNA,將DNA定量后稀釋到100ng/μL,利用Arsenophonus屬特異的23SrDNA引物對3種寄主種群中Arsenophonus屬共生菌進(jìn)行了定量PCR分析。以褐飛虱actin基因作為內(nèi)參照基因,其引物設(shè)計(jì)利用DNASTAR軟件,依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中序列EU179846.1設(shè)計(jì),引物序列為Bph-actinF:5′-CCCCATCGAGCACGGTATCATCA-3′,Bph-actinR:5′-TCTGGGTCATCTTCTCACGGTTGG-3′。定量PCR反應(yīng)體系為1×SYBRGreenPCRMasterMix,0.5μmol/L引物,DNA1.0μL,反應(yīng)體積25μL反應(yīng)程序?yàn)?5℃15min,95℃10s、60℃20s、72℃40s45個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析參照Livak和Schmittgen(2001)的方法。1.7數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析不同處理的方差分析與多重比較采用唐啟義和馮明光(2002)的DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。2結(jié)果與分析2.11tn基因突變株的鑒定及克隆測序通過16SrDNA通用引物對褐飛虱TN1種群試蟲的總DNA進(jìn)行擴(kuò)增,獲得了兩種長度不同的擴(kuò)增片斷。較長的片段經(jīng)克隆后共選取10個(gè)克隆進(jìn)行測序,除其中3個(gè)克隆序列與未知細(xì)菌相似外,另7個(gè)克隆的序列長度為1504bp(GenBank登錄號(hào):GU124504),序列比對發(fā)現(xiàn)與木虱科的柑桔木虱Diaphorinacitri(GenBank登錄號(hào):AB038366.1)體內(nèi)的次生共生菌Arsenophonus16SrDNA序列相似度達(dá)99%以上(平均E值0.0),G+C含量53.6%,表明褐飛虱TN1種群體內(nèi)含有Arsenophonus類共生細(xì)菌。較短的片段經(jīng)克隆測序后確定長度為547bp(GenBank登錄號(hào):GU124505),與1504bp長片段的兩頭序列相同,但中間缺失957bp,G+C含量54.5%(圖1)。利用測得的Arsenophonus屬共生細(xì)菌的1504bp的16SrDNA序列重新設(shè)計(jì)引物ARS16s-F2:5′-CCTAACACATGCAAGTCGAG-3′和短片斷缺失交接區(qū)設(shè)計(jì)引物ARS16s-F1:5′-GGACGGGTGATGTTGTGAAATG-3′與16s-R引物在不同褐飛虱寄主種群和地理種群中進(jìn)行擴(kuò)增,其中引物對ARS16s-F2和16s-R能夠擴(kuò)增得到兩條預(yù)期為1465bp、508bp的擴(kuò)增片段,而ARS16s-F1和16s-R則得到預(yù)期為448bp的擴(kuò)增帶(圖2),表明在各褐飛虱種群體內(nèi)共生細(xì)菌Arsenophonus的16SrDNA均存在兩種片段大小不一的序列。2.2與arsenophonus屬間的共生細(xì)菌屬長度為1504bp的序列經(jīng)比對和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)克隆的16SrDNA序列(GU124504)與木虱科Diaphorinacitri、Glycaspisbrimblecombei和粉虱科Dialeurodeshongkongensis、Tetraleurodesacaciae等其他同翅目昆蟲體內(nèi)的Arsenophonus屬共生細(xì)菌歸為一類,在進(jìn)化上較為接近;而與雙翅目蝠蠅科Trichobiuscaecus、T.longipes、T.yunkeri和虱蠅科Lipoptenacervi體內(nèi)的Arsenophonus屬共生細(xì)菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖3)。2.3褐飛銻相關(guān)細(xì)菌群落的分析利用Arsenophonus特異的23SrDNA引物在不同水稻品種中未檢出Arsenophonus(圖4),而在褐飛虱不同地理種群和寄主種群均檢測出Arsenophonus(圖5),說明Arsenophonus屬共生細(xì)菌廣泛存在于不同種群的褐飛虱體內(nèi),而且此菌并非來源于褐飛虱的食物源(水稻)。2.4熒光定量pcr檢測褐飛虱內(nèi)參基因actin和Arsenophonus23SrDNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的融解曲線均成單峰(圖6:A,B),說明擴(kuò)增產(chǎn)物單一。Tm值為82.6～83℃。3個(gè)褐飛虱寄主種群熒光定量PCR結(jié)果差異顯著,其中TN1種群體內(nèi)Arsenophonus屬共生菌的CT值(ArsCT)、ΔCT值(ArsCT-ActinCT)均最低;TN1種群的2-ΔΔCT值顯著高于Mudgo和ASD7種群,后二者間差異不顯著(表2),表明褐飛虱TN1種群Arsenophonus屬共生菌含量顯著高于ASD7種群和Mudgo種群。3火炬樹葉片中的加害者為一般認(rèn)為,16SrDNA序列同源性小于98%,可認(rèn)為屬于不同的種;16SrDNA序列同源性小于93%～95%,則可認(rèn)為屬于不同屬;低的(G+C)mol%是一個(gè)反映寄生物與寄主在遠(yuǎn)古時(shí)代就結(jié)合的特征,而高的(G+C)mol%則可以反應(yīng)其接近自由生活細(xì)菌(MoranandTelang,1998)。如初生內(nèi)共生菌16SrDNA通常富含(A+T)%,(G+C)mol%為47%左右,說明其與宿主起源的一致性。而次生內(nèi)共生菌16SrDNA富含(G+C)mol%,為53.4%,與能夠人工培養(yǎng)的細(xì)菌的16SrDNA接近(譚周進(jìn)等,2007)。本研究在褐飛虱體內(nèi)克隆到的16SrDNA序列(G+C)mol%為53.6%,說明此類共生細(xì)菌可能為次生共生細(xì)菌,與寄主關(guān)系松散。同源性比發(fā)現(xiàn)該序列與柑桔木虱Diaphorinacitri體內(nèi)的次生共生菌Arsenophonus16SrDNA序列相似度達(dá)99%以上,可認(rèn)為是Arsenophonus類共生細(xì)菌,本研究還進(jìn)一步確認(rèn)該菌普遍存在于不同褐飛虱寄主種群及我國與越南、菲律賓等地的褐飛虱地理種群,此為水稻褐飛虱體內(nèi)存在Arsenophonus屬共生細(xì)菌的首次報(bào)道。Arsenophonus是屬于Proteobacteriaγ亞類腸桿菌科的一類細(xì)菌,廣泛存在于粉虱、木虱、錐蝽等多種昆蟲體內(nèi)(ThaoandBaumann,2004;Novákováetal.,2009)。有關(guān)Arsenophonus在宿主昆蟲體內(nèi)的功能的研究可見于多例報(bào)道。Gherna等(1991)認(rèn)為Arsenophonus屬共生菌可致使寄主昆蟲生殖異常,如殺雄菌A.nasoniae對麗蠅蛹集金小蜂Nasoni