導(dǎo)師制實(shí)驗(yàn)報(bào)告-腸道菌群檢測(cè)-模板

三級(jí)學(xué)科微生物學(xué)及檢驗(yàn)項(xiàng)目編號(hào)碼_______________項(xiàng)目——導(dǎo)師制實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)名稱:腸道菌群分離培養(yǎng)、鑒定及藥敏分析學(xué)生姓名:曾正勇年級(jí):2013醫(yī)檢1班專業(yè):醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)指導(dǎo)教師:王健教授實(shí)驗(yàn)日期:2015年11月4日安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院二O一五年十一月實(shí)驗(yàn)概述細(xì)菌:廣義的細(xì)菌即為原核生物。是指一大類細(xì)胞核無(wú)核膜包裹，只存在稱作擬核區(qū)（nuclearregion)（或擬核）的裸露DNA的原始單細(xì)胞生物，包括真細(xì)菌（eubacteria）和古生菌（archaea）兩大類群。人們通常所說(shuō)的即為狹義的細(xì)菌，狹義的細(xì)菌為原核微生物的一類，是一類形狀細(xì)短，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，多以二分裂方式進(jìn)行繁殖的原核生物，是在自然界分布最廣、個(gè)體數(shù)量最多的有機(jī)體，是大自然物質(zhì)循環(huán)的主要參與者。腸道菌群是腸道菌群，人體腸道的正常微生物，如雙歧桿菌，乳酸桿菌等能合成多種人體生長(zhǎng)發(fā)育必須的維生素，如B族維生素（維生素B1、B2、B6、B12），維生素K，煙酸、泛酸等，還能利用蛋白質(zhì)殘?jiān)铣杀匦璋被幔缣於T氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸和蘇氨酸等，并參與糖類和蛋白質(zhì)的代謝，同時(shí)還能促進(jìn)鐵、鎂、鋅等礦物元素的吸收。這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)人類的健康有著重要作用，一旦缺少會(huì)引起多種疾病。人體腸道內(nèi)寄生著10萬(wàn)億個(gè)細(xì)菌，它們能影響體重和消化能力、抵御感染和自體免疫疾病的患病風(fēng)險(xiǎn)，還能控制人體對(duì)癌癥治療藥物的反應(yīng).根據(jù)可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量分類在腸道菌群中，可以培養(yǎng)到的細(xì)菌有400余種，依據(jù)其數(shù)量多少可以分為主要(優(yōu)勢(shì))菌群(predominantmieroflora)和次要菌群(sub—dominantmicroflora)。①主要(優(yōu)勢(shì))菌群：指腸道菌群中數(shù)量大或種群密集度大的細(xì)菌，一般在10～10cfu/g以上，包括類桿菌屬、優(yōu)桿菌屬、雙歧桿菌屬、瘤胃球菌屬和梭菌屬等專性厭氧菌，通常屬于原籍菌群。優(yōu)勢(shì)菌群是對(duì)宿主發(fā)揮生理功能的菌群，在很大程度上影響著整個(gè)菌群的功能，決定著菌群對(duì)宿主的生理病理意義。②次要菌群：數(shù)量在10～10cfu/g以下，主要為需氧菌或兼性厭氧菌，如大腸桿菌和鏈球菌等，流動(dòng)性大，有潛在致病性，大部分屬于外籍菌群或過(guò)路菌群。乳桿菌在數(shù)量上歸為次要菌群，在回腸中含量較高，但是其具有較為重要的功能，因此在功能上歸屬于優(yōu)勢(shì)菌群。優(yōu)勢(shì)菌群與微生境的特征密切相關(guān)，以厭氧菌為主的優(yōu)勢(shì)菌群，一般生存在清除速率較低、營(yíng)養(yǎng)豐富的微生境，如結(jié)腸，所以菌群密集度和多樣性高；而兼性或需氧菌群一般生活在清除速率高的微生境，如小腸近端，其菌群密集度和菌群多樣性較低，由于菌群密集度低，很難稱得上是“優(yōu)勢(shì)菌群”；在酸性微生境中，耐酸、產(chǎn)酸的細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)菌群。微生境的改變，可使菌群中的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生替換，如便秘時(shí)大便優(yōu)勢(shì)菌群主要是革蘭陰性厭氧菌，慢性腹瀉時(shí)常見革蘭陽(yáng)性桿菌為優(yōu)勢(shì)菌群，而在嚴(yán)重急性腹瀉時(shí)大便中的優(yōu)勢(shì)菌群為致病性細(xì)菌或某些兼性/需氧細(xì)菌。在腸道中，盡管專性厭氧菌是主要菌群，占據(jù)優(yōu)勢(shì)，但這些菌群又依賴于需氧菌或兼性厭氧菌等次要菌群的存在，因?yàn)楹笳咴谠鲋尺^(guò)程中消耗氧氣，保證前者的生長(zhǎng)條件。一個(gè)生理性組合的腸道菌群是有益的，而病理性組合的腸道菌群是有害的。人體腸道內(nèi)的微生物中，超過(guò)99%都是細(xì)菌，存活著數(shù)量大約有100兆個(gè)，有500～1000個(gè)不同的種類。這些數(shù)目龐大的細(xì)菌大致可以分為三個(gè)大類：有益菌、有害菌和中性菌。有益菌，也稱之為益生菌，主要是各種雙歧桿菌、乳酸桿菌等，是人體健康不可缺少的要素，可以合成各種維生素，參與食物的消化，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，抑制致病菌群的生長(zhǎng)，分解有害、有毒物質(zhì)等。有害菌，數(shù)量一旦失控大量生長(zhǎng)，就會(huì)引發(fā)多種疾病，產(chǎn)生致癌物等有害物質(zhì)，或者影響免疫系統(tǒng)的功能。中性菌，即具有雙重作用的細(xì)菌，如大腸桿菌、腸球菌等，在正常情況下對(duì)健康有益，一旦增殖失控，或從腸道轉(zhuǎn)移到身體其他部位，就可能引發(fā)許多問(wèn)題。人體的健康與腸道內(nèi)的益生菌群結(jié)構(gòu)息息相關(guān)。腸道菌群在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，通過(guò)個(gè)體的適應(yīng)和自然選擇，菌群中不同種類之間，菌群與宿主之間，菌群、宿主與環(huán)境之間，始終處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)中，形成一個(gè)互相依存，相互制約的系統(tǒng)，因此，人體在正常情況下，菌群結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，對(duì)宿主表現(xiàn)為不致病。有研究指出，體魄強(qiáng)健的人腸道內(nèi)有益菌的比例達(dá)到70%，普通人則是25%，便秘人群減少到15%，而癌癥病人腸道內(nèi)的益生菌的比例只有10%。藥敏試驗(yàn)是指體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AST），是指在體外測(cè)定藥物抑菌或殺菌能力的試驗(yàn)。目前，臨床微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的方法主要有紙片擴(kuò)散法，稀釋法（包括瓊脂和肉湯稀釋法），抗生素濃度梯度法（E-test法），和自動(dòng)化儀器等。本實(shí)驗(yàn)以在校醫(yī)學(xué)生糞便標(biāo)本為樣品，探討腸道菌群的分離、培養(yǎng)、鑒定和藥敏，了解在校醫(yī)學(xué)生腸道菌群分布狀況及對(duì)常用抗生素的敏感性，為預(yù)防腸道細(xì)菌感染和合理使用抗生素提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵饬x1、掌握培養(yǎng)基的配制方法培養(yǎng)基的配置過(guò)程主要包括：調(diào)配、溶化、校正pH值、澄清過(guò)濾、分裝、滅菌及檢定和保存。調(diào)配：溶化：校正pH值：澄清過(guò)濾：分裝：滅菌：鑒定：保存：2、熟悉濕熱滅菌的原理和應(yīng)用濕熱滅菌一般采用高壓蒸汽滅菌，在103.4KPa蒸汽壓下，溫度能達(dá)到121.3℃維持15~20分鐘，就能殺死包括細(xì)菌芽胞在內(nèi)的所有微生物，是一種徹底的滅菌方法。3、掌握腸道標(biāo)本的采集方法標(biāo)本的收集、存放與運(yùn)送的得當(dāng)與否，直接關(guān)系到檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)采取新鮮糞便，盛于潔凈、干燥無(wú)吸水性的有蓋容器內(nèi)，不得混有尿液、水或其他物質(zhì)，以免破壞有形成分，使病原菌死亡和污染腐生性原蟲、真菌孢子、植物種子、花粉易混淆檢驗(yàn)結(jié)果。采集標(biāo)本時(shí)應(yīng)用干凈竹簽選取含有粘液、膿血等病變成分的糞便；外觀無(wú)異常的糞便須從表面、深處及糞端多處取材，其量至少為大拇指末段大?。s5g）。標(biāo)本采集后一般情況應(yīng)于1h內(nèi)檢查完畢，否則可因pH及消化酶等影響導(dǎo)致有形成分破壞分解。4、掌握腸道正常菌群、腸道致病菌和腸道條件致病菌腸道正常菌群：指腸道菌群中數(shù)量大或種群密集度大的細(xì)菌，對(duì)人體有益無(wú)害并與人體保持平衡。腸道致病菌：除大腸正常菌群之外可導(dǎo)致疾病發(fā)生的菌種，主要是沙門氏菌、志賀氏菌變形桿菌、大腸埃希菌耶爾森菌；腸道條件致病菌：與人體共同生活，以兼性厭氧菌為主是腸道非優(yōu)勢(shì)菌群，如腸球菌，腸桿菌，在腸道微生態(tài)平衡時(shí)，對(duì)人體無(wú)害，但在特定條件下會(huì)具有一定的致病性。5、掌握腸道菌群在腸道選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特點(diǎn)腸道菌群在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)特點(diǎn)：腸道菌群需氧或兼性厭氧，菌落中等大小，表面光滑濕潤(rùn)，液體培養(yǎng)基混濁生長(zhǎng)。掌握腸道菌群的生化反應(yīng)+-7、掌握腸道菌群的鑒定要點(diǎn)鑒定腸道菌群首先要保證糞便的新鮮且沒有受到污染，掌握菌落的基本形態(tài)特征，要熟悉各種菌落的生化反應(yīng)的特點(diǎn)。8、掌握細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)體外抗菌藥物敏感性試驗(yàn)簡(jiǎn)稱藥敏試驗(yàn)（AST），是指在體外測(cè)定藥物抑菌或殺菌能力的試驗(yàn)抗菌藥對(duì)細(xì)菌性傳染病的控制起到了非常重要的作用，隨著新型致病菌的不斷出現(xiàn)，抗菌藥的防治效果越來(lái)越差。并且各種致病菌對(duì)不同的抗菌藥物的敏感性不同，同一細(xì)菌的不同菌株對(duì)不同抗菌藥物的敏感性也有差異。長(zhǎng)期以來(lái)，各種致病菌耐藥性的產(chǎn)生使各種常用抗菌藥物往往失去藥效，以及不能很好的掌握藥物對(duì)細(xì)菌的敏感度，所以一個(gè)正確的結(jié)果，可供臨床醫(yī)師選用抗菌藥物的參考，并提高療效三、實(shí)驗(yàn)應(yīng)具備的物質(zhì)條件1、試劑：革蘭染液，觸酶及氧化酶試劑，蒸餾水等。培養(yǎng)基：ss培養(yǎng)基，麥康凱培養(yǎng)基，普通培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基，克氏雙糖鐵培養(yǎng)基系統(tǒng)生化管：J2026纖維二糖杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20071109J2019木糖杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20080108J2018阿拉伯糖杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20080527J2044七葉苷杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20080102J2016甘露醇生化管杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20070914β-半乳糖苷（OPNG）杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090422麥芽糖杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090331枸櫞酸鹽生化管杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090409賴氨酸脫羧酶生化管杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090325尿素生化管杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090317精氨酸脫羧酶生化管杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090105鳥氨酸脫羧酶生化管杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20090219藥敏紙片：氯霉素（30ug/片）杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20150305慶大霉素（10ug/片）杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20150202環(huán)丙沙星（30ug/片）杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20150210紅霉素（15ug/片）杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20150106青霉素（10ug/片）杭州微生物試劑有限公司批號(hào)20150209儀器：恒溫培養(yǎng)箱，干烤箱，高壓滅菌鍋，半自動(dòng)生化分析儀，水平離心機(jī)，顯微鏡等3、其他：接種環(huán)，酒精燈，火柴，試管架，記號(hào)筆，載玻片四、注意事項(xiàng)1天平的使用：稱量前要注意天平的調(diào)平，應(yīng)先把游碼歸零，放上稱量紙后在調(diào)平天平，稱量時(shí)務(wù)必做到“左物右碼”稱量后把天平放回原處。2在配置半固體（動(dòng)力）培養(yǎng)基和克氏雙糖鐵培養(yǎng)基時(shí)，按參加實(shí)驗(yàn)的人數(shù)配適量的培養(yǎng)液，并注意各種試劑之間和水的比例。3在配置培養(yǎng)基時(shí)注意培養(yǎng)基的pH紙（一般腸道細(xì)菌的最適pH值為7.2~7.6，配置的培養(yǎng)基的pH值應(yīng)為7.4~7.6）。4用手提式壓力蒸汽滅菌器滅菌，在滅菌前應(yīng)核對(duì)排氣閥是否處以開的狀態(tài)，而安全閥應(yīng)處于關(guān)閉的狀態(tài)。5制備克氏雙糖鐵斜面培養(yǎng)基時(shí)，從高壓滅菌鍋中取出趁熱放置成高層斜面，放置過(guò)程中禁止試管滾動(dòng)，待凝固后放入冰箱保存，作無(wú)菌試驗(yàn)備用。6高壓蒸汽滅絕菌鍋的使用原則嚴(yán)格按照高壓蒸汽滅絕菌鍋的使用原則使用，使用前務(wù)必檢查高壓蒸汽滅絕菌鍋中的水是否符合加熱的要求，通電前檢查排氣閥是否開啟，安全閥是否關(guān)閉，待冷氣排盡關(guān)上排氣閥安全閥開始噴漆時(shí)開始計(jì)時(shí)，等指針回到原位時(shí)才能打開蓋子，注意切斷電源。7取糞便細(xì)菌標(biāo)本：要取新鮮的糞便（不能超過(guò)2小時(shí)）份量在1克左右，嚴(yán)禁糞尿混合，正常標(biāo)本取表面，異常標(biāo)本取粘液或膿血部分。8可疑菌落的鑒別：在SS培養(yǎng)基上如果出現(xiàn)可疑菌落如黑色菌落，應(yīng)要鑒定其種屬。9生化反應(yīng)的判斷和分析：在做生化鑒定時(shí)應(yīng)注意生化管前后對(duì)照，以便判斷實(shí)驗(yàn)結(jié)果。10藥敏試驗(yàn)分析：在做藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)，采用密集畫線發(fā)，要盡量畫的密，畫的均勻，使之呈均勻分布，放藥敏紙片要注意各個(gè)紙片之間的距離和培養(yǎng)皿壁的距離。測(cè)量結(jié)果是要多次測(cè)量取其平均值。五、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理 1、采用分離劃線法分離培養(yǎng)腸道細(xì)菌平板劃線分離法是指把混雜在一起的微生物或同一微生物群體中的不同細(xì)菌用接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面通過(guò)分區(qū)劃線稀釋而得到較多獨(dú)立分布的單個(gè)細(xì)菌，經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)繁殖成單菌落，通常把這種單菌落當(dāng)作待分離微生物的純種。用于目的微生物的分離，便于得到目的性狀的單克隆。2、采用初步生化反應(yīng)和系統(tǒng)生化反應(yīng)鑒定腸道致病菌和腸道條件致病菌初步生化反應(yīng)和系統(tǒng)生化反應(yīng)鑒定腸道菌群是借助各種腸道細(xì)菌具有的各自酶系統(tǒng)對(duì)底物的分解能力及其代謝產(chǎn)物的不同來(lái)進(jìn)行的。而這些代謝產(chǎn)物又具有不同的生物化學(xué)特性，可利用生物化學(xué)的方法測(cè)定這些代謝產(chǎn)物以鑒定細(xì)菌。初步生化反應(yīng)時(shí)，根據(jù)革蘭染色陰性或者陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行觸酶或者氧化酶反應(yīng)，然后由初步生化結(jié)果再在各種生化反應(yīng)培養(yǎng)基中加入單個(gè)菌落，培養(yǎng)24或者48小時(shí)讀取結(jié)果，根據(jù)各主要菌屬（鐘）之間的一些主要生化特性鑒別菌落。以K-B法檢測(cè)細(xì)菌藥物敏感性將含有定量抗菌藥物的紙片貼在已接種待檢菌的瓊脂平板上，紙片中所含的藥物吸取瓊脂中的水分溶解后會(huì)不斷地向紙片周圍區(qū)域擴(kuò)散，形成遞減的濃度梯度，在紙片周圍抑菌濃度范圍內(nèi)待檢菌的生長(zhǎng)被抑制，從而產(chǎn)生透明的抑菌圈。抑菌圈的大小反映檢測(cè)菌對(duì)測(cè)定藥物的敏感程度，并與該藥對(duì)待檢菌的最低抑菌濃度（MIC）呈負(fù)相關(guān)，即抑菌圈俞大，MIC俞小。六、實(shí)驗(yàn)方法、步驟1、培養(yǎng)基的制備（1）半固體（動(dòng)力）培養(yǎng)基的制備把少量的凝固劑加入到液體培養(yǎng)基中，就制成了半固體培養(yǎng)基。以瓊脂為例，它的用量在0.2~0.7%之間。這種培養(yǎng)基有時(shí)可用來(lái)觀察微生物的動(dòng)力，有時(shí)用來(lái)保藏菌種。1.配料配方換算→在容器中加入少量水〔蒸餾水，自然水〕→按照配方稱取各種藥品〔依次加入〕→加足所需水量《一藥一勺，取藥后立即蓋上瓶蓋》。溶解淀粉溶解：少量冷水調(diào)成糊狀；加熱溶解，特別是加有瓊脂的培養(yǎng)基，一定要煮沸，瓊脂的熔解溫度95～97℃，且需要邊加熱邊攪拌以防止燒焦。調(diào)PH用1N的鹽酸或的1NNaOH把培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到所要求的值。4.過(guò)濾濾紙或棉花進(jìn)行過(guò)濾。5.分裝一般培養(yǎng)基放在三角瓶或試管中滅菌使用。(1)三角瓶若作靜置培養(yǎng)，則100ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，最多不能超過(guò)150ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，否則滅菌時(shí)培養(yǎng)基沸騰容易污染棉塞，造成染菌；若作搖瓶培養(yǎng)，則15～20ml培養(yǎng)基/250ml的三角瓶，保證通氣良好。(2)試管分裝液體培養(yǎng)基一般裝4～5ml，約試管的1/4高度；固體斜面培養(yǎng)基一般裝3～4ml，約試管的1/5高度。6.包扎分裝好后，塞上棉塞，在用牛皮紙將棉塞包裹好，防止滅菌時(shí)水份進(jìn)入把棉塞弄濕。7.滅菌按配方上要求的溫度、壓力進(jìn)行高壓蒸汽滅菌。如果滅菌的溫度太高，營(yíng)養(yǎng)成分會(huì)被破壞，培養(yǎng)基中的糖、氨基酸會(huì)使培養(yǎng)基的顏色變深。8.擺斜面滅菌后需要擺斜面的試管要趁熱斜著擺放，使其凝固成為一個(gè)斜面，約占試管長(zhǎng)度的1/2。9.貯存培養(yǎng)基在30℃下放置一天，無(wú)污染的即可使用。一般用牛皮紙包裹好存放于2-8℃冰箱中備用（2）克氏雙糖鐵培養(yǎng)基的制備成分：蛋白胨20g牛肉膏3g酵母膏3g乳糖10g葡萄糖1g氯化鈉5g檸檬酸鐵銨0.5g硫代硫酸鈉0.5g瓊脂12g酚紅0.025g蒸餾水1000mLpH7.4將除瓊脂和酚紅以外的各成分溶解于蒸餾水中，校正pH。加入瓊脂，加熱煮沸，以溶化瓊脂。加入0.2%酚紅水溶液12.5mL，搖勻。分裝試管，裝量宜多些，以便得到比較高的底層。121℃高壓滅菌15min。放置高層斜面?zhèn)溆?。?）SS培養(yǎng)基的制備SS瓊脂為強(qiáng)選擇性培養(yǎng)基。其成分除了有必要的胨、牛肉膏等氮、碳源外，其他則為選擇性抑制劑和緩沖劑?？捎糜谥举R菌和沙門菌的分離。一類是基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還有一類是完全培養(yǎng)基?；A(chǔ)培養(yǎng)基：配方g/L牛肉膏5脙胨5三號(hào)膽鹽3.5瓊脂17溶于1000mL蒸餾水中混合均勻。121℃高壓滅菌15min，保存?zhèn)溆?。完全培養(yǎng)基配方g/L牛肉膏5脙胨5三號(hào)膽鹽3.5瓊脂17乳糖10檸檬酸鈉8.5硫代硫酸鈉8.510%檸檬酸鐵溶液10mL1%中性紅溶液2.5mL0.1%煌綠溶液0.33mL加熱溶化基礎(chǔ)培養(yǎng)基，按比例加入上述染料以外之各成分，充分混合均勻，校正至pH7.0，加入中性紅和煌綠溶液，傾注平板。注：①制好的培養(yǎng)基宜當(dāng)日使用，或保存于冰箱內(nèi)于48h內(nèi)使用。②煌綠溶液配好后應(yīng)在10d以內(nèi)使用。③可以購(gòu)用SS瓊脂的干燥培養(yǎng)基。（4）MacConkey培養(yǎng)基的制備原料成分：蛋白胨

17g脙胨3g豬膽鹽(或牛、羊膽鹽)5g氯化鈉

5g瓊脂

17g蒸餾水

1000ml乳糖

10g0.01%結(jié)晶紫水溶液10mL0.5%中性紅水溶液5mL1將蛋白胨、胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400mL蒸餾水中，校正pH7.2。將瓊脂加入600mL加熱溶解。將兩液合并，分裝于燒瓶?jī)?nèi)，121℃高壓滅菌15min備用。2臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至50～55℃時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。注：結(jié)晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。2、少許新鮮糞便標(biāo)本（1g±）分離培養(yǎng)將新鮮糞便接種于SS或麥康凱平板35℃孵育24h。3、以滅菌接種環(huán)沾取糞便部分少許，分別以3區(qū)劃線法接種于SS、MacConkey平板，37℃溫箱孵育18~24hⅠⅡⅢ①先在火焰上給接種環(huán)滅菌，室溫冷卻。②小心挑取新鮮糞便少許，分別劃線SS、MacConkey平板。③用滅菌的接種環(huán)從1區(qū)劃線分離接種，于1區(qū)線交叉3次左右，為2區(qū)。④同樣方法進(jìn)行第3區(qū)分離劃線。使糞便標(biāo)本細(xì)菌在腸道選擇平板上呈梯度遞減分布態(tài)勢(shì)，以獲取典型的單個(gè)菌落。⑤蓋好皿蓋，倒置（防止水分蒸發(fā)）平皿，置35~37℃恒溫培養(yǎng)箱18~24小時(shí)。⑥取平皿觀察記錄培養(yǎng)結(jié)果，置4℃冰箱備存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4、分別取正常菌落和可疑菌落行Gram’sstain染色、鏡檢，觀察記錄細(xì)菌形態(tài)和染色特征①在培養(yǎng)基中用接種環(huán)分別挑取正常菌落和可疑菌落涂在載玻片上。②固定：細(xì)菌的固定常用火焰加熱法，即將上述已干的涂片在酒精燈火焰中通過(guò)3次。③進(jìn)行革蘭染色：a初染，將結(jié)晶紫染液加于制好的涂片上，染色1min，用細(xì)水沖洗，甩去積水。b媒染，加盧戈碘液作用1min，用細(xì)水沖洗，甩去積水。c脫色，滴加95%酒精數(shù)滴，搖動(dòng)玻片數(shù)秒鐘，使均勻脫色，然后斜持玻片，再滴加酒精，直到流下的酒精無(wú)色為止，用細(xì)流水沖洗，甩去積水。d復(fù)染，加稀釋石炭酸復(fù)紅染0.5min，用細(xì)流水沖洗，甩去積水。④在顯微鏡下（油鏡）觀察腸道細(xì)菌的形態(tài)，并記錄其結(jié)果。5、分別取正常菌落和可疑菌落行KIA、MIU初步生化反由于KIA培養(yǎng)基含乳糖、葡萄糖、硫酸亞鐵銨和酚紅指示劑，用針穿刺，取單個(gè)菌落，穿刺至底部3-5mm處，然后在斜面上往復(fù)劃線。放35度培養(yǎng)18-24小時(shí)。動(dòng)力、吲哚及脲酶（MIU）復(fù)合試驗(yàn)將大腸埃希菌和普通變形桿菌穿刺線接種于MIU培養(yǎng)基，35攝氏度，18-24h，觀察動(dòng)力和脲搜索酶反應(yīng)后，再滴加吲哚試劑。6、分別取正常菌落和可疑菌落行系統(tǒng)生化反應(yīng)用接種針分別取單個(gè)正常菌落和可疑菌落接種兩套的各個(gè)系統(tǒng)生化管，35攝氏度培養(yǎng)18-24小時(shí)觀察系統(tǒng)生化管結(jié)果。7、分別取正常菌落和可疑菌落行單純藥敏試驗(yàn)；①在培養(yǎng)基中用接種針分別挑取正常菌落和可疑菌落分別用密集畫線法接種于MH藥敏培養(yǎng)基，使待檢細(xì)菌在MH培養(yǎng)基上近似均勻分布。慶丁氯‘‘青紅慶丁氯‘‘青紅密集畫線藥敏紙片均勻貼在培養(yǎng)基上慶青丁紅氯‘‘慶青丁紅氯‘‘藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果②在含菌的MH培養(yǎng)皿中均勻貼上不同藥敏紙片（氯霉素藥敏紙片、慶大霉素藥敏紙片、青霉素藥敏紙片、紅霉素藥敏紙片、丁胺卡那藥敏紙片），使藥敏紙片呈梅花狀分布。③將MH培養(yǎng)皿放于37℃恒溫培養(yǎng)箱18~24小時(shí)，并觀察抑菌環(huán)大小，測(cè)量、記錄抑菌環(huán)直徑。8、取可疑菌落做遷徙實(shí)驗(yàn)①用滅菌過(guò)的接種環(huán)取可疑菌落，點(diǎn)狀接種在普通培養(yǎng)基上。②將普通培養(yǎng)基放于37℃恒溫培養(yǎng)箱18~24小時(shí)，并觀察記錄有無(wú)遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象。七、實(shí)驗(yàn)路線及方法變更糞便標(biāo)本（1g±）SS、MacConkey平板18~24h可疑菌落、正常菌落Gram’sstain染色初步生化純培養(yǎng)（SS或MacConkey平板）鏡檢系統(tǒng)生化大腸桿菌質(zhì)粒DNA抽提↙↘驗(yàn)證染色鏡檢在腸道血清學(xué)檢查藥敏試驗(yàn)OD260/OD280比值測(cè)定G-桿菌鑒別診斷價(jià)值單純藥敏試驗(yàn)確定DNA純度聯(lián)合藥敏試驗(yàn)八、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與預(yù)期目標(biāo)1、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容①培養(yǎng)基的制備②糞便細(xì)菌標(biāo)本的分離培養(yǎng)③可疑菌落的染色鏡檢④可疑菌落的生化反應(yīng)⑤細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)⑥遷徙實(shí)驗(yàn)2、預(yù)期目標(biāo)①掌握各種培養(yǎng)基的配置方法和鑒定②學(xué)會(huì)濕熱滅菌和高壓蒸汽滅絕菌鍋的使用方法③掌握腸道細(xì)菌分離培養(yǎng)方法和步驟④掌握腸道細(xì)菌的鑒定方法、鑒定要點(diǎn)和步驟⑤掌握K-B法細(xì)菌藥敏試驗(yàn)九、結(jié)果1、腸道細(xì)菌在腸道選擇培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特點(diǎn)腸道菌群在MacConkey平板呈粉紅色的菌群，呈條狀分布，且分布不規(guī)則均勻；在SS上呈乳白色點(diǎn)狀生長(zhǎng)，從一區(qū)到四區(qū)遞減分布。具體情況見圖13~圖17。2、可疑菌落的涂片、革蘭氏染色、鏡檢可疑菌落在顯微鏡下（油鏡）看到為紅色菌落，是革蘭氏陰性菌，菌體兩端鈍圓，有明顯的多形性，呈球型或絲狀，分布不均勻，成團(tuán)或成簇分布。具體情況見圖25~圖283、腸道細(xì)菌的初步生化反應(yīng)正常菌落的初步生化反應(yīng)結(jié)果：產(chǎn)酸產(chǎn)氣，動(dòng)力實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性；可疑菌落在KIA培養(yǎng)基中呈黑色分布，產(chǎn)硫化氫，培養(yǎng)基底部有小個(gè)空泡，在斜面上呈點(diǎn)狀菌落分布，在MIU培養(yǎng)基中，細(xì)菌沿穿刺線放射生長(zhǎng)，動(dòng)力試驗(yàn)呈陽(yáng)性。具體情況見圖19~圖21。4、腸道細(xì)菌的系統(tǒng)生化反應(yīng)可疑菌落的系統(tǒng)生化反應(yīng)結(jié)果是：甘露醇黃色呈陽(yáng)性，，麥芽糖黃色呈陽(yáng)性，七葉棕色呈陰性，枸櫞酸鹽綠色呈陰性，賴氨酸紫紅色呈陽(yáng)性，精氨酸淺棕色呈陽(yáng)性，鳥氨酸淡黃色呈陽(yáng)性，尿素黃色呈陰性，硫化氫黑色呈陽(yáng)性，蛋白胨水紅色呈陽(yáng)性，纖維二糖藍(lán)色呈陰性，VNPG黃色呈陽(yáng)性。具體情況見圖22~圖24腸道細(xì)菌的K-B法藥敏試驗(yàn)根據(jù)抑菌圈的大?。ú煌股仄湟志Υ笮〉臉?biāo)準(zhǔn)不一致），判斷為敏感（S），耐藥（R）或中介度（I）。用刻度尺量的抑菌圈如下，具體情況見圖29~圖32氯霉素(2.5cm）慶大霉素（R)環(huán)丙沙星(2.8cm）紅霉素(R)青霉素（R)6、可疑菌落的遷徙實(shí)驗(yàn)可疑菌落在普通瓊脂平板上可蔓延波紋狀薄膜布滿整個(gè)培養(yǎng)基表面，遷徙生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)呈陽(yáng)性。具體情況見圖18。腸道細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定圖1：學(xué)生在普通實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)圖2：教師在實(shí)驗(yàn)室指導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)圖3：主要實(shí)驗(yàn)試劑圖4：主要實(shí)驗(yàn)試劑（KIA，自制）圖5：主要實(shí)驗(yàn)儀器-恒溫培養(yǎng)箱、干烤箱圖6：主要實(shí)驗(yàn)儀器-高壓滅菌鍋圖7：主要實(shí)驗(yàn)儀器-半自動(dòng)細(xì)菌生化分析儀圖8：主要實(shí)驗(yàn)儀器-定量PCR儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖9：主要實(shí)驗(yàn)儀器-5415D型速離心機(jī)圖10：主要實(shí)驗(yàn)儀器-Microfuge18型高速離心機(jī)圖11：主要實(shí)驗(yàn)儀器-斜角式離心機(jī)圖12：主要實(shí)驗(yàn)儀器-水平式離心機(jī)腸道菌群分離培養(yǎng)與鑒定圖13：腸道菌群在SS、Mac培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖14：腸道菌群在SS、Mac培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖15：腸道菌群在SS、Mac培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖16：腸道菌群在SS、Mac培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖17：大腸桿菌在分離培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖18：變形桿菌遷徙生長(zhǎng)現(xiàn)象圖19：大腸桿菌接種KIA、MIU培養(yǎng)基（培養(yǎng)前）圖20：大腸桿菌接種KIA、MIU培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況腸道菌群分離培養(yǎng)與鑒定圖21：大腸桿菌在KIA、MIU培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖22：大腸桿菌在KIA、MIU培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖23：大腸桿菌系統(tǒng)生化反應(yīng)結(jié)果（反應(yīng)前）圖24：大腸、變形桿菌在KIA、MIU培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況圖25：大腸桿菌Grame’sstain×1000圖26：大腸桿菌Grame’sstain×1000腸道菌群分離培養(yǎng)與鑒定圖27：大腸桿菌Grame’sstain×1000圖28：大腸桿菌Grame’sstain×1000圖29：MH細(xì)菌藥敏培養(yǎng)基圖30：K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)圖31：K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果-3圖32：K-B法藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果-4十、討論腸道菌群是指一大類存在于人類和動(dòng)物腸道內(nèi)的形態(tài)、生物學(xué)特性十分相似的G-桿菌，大多數(shù)細(xì)菌對(duì)人體有益，廣泛分布在自然界中，包括植物、土壤、水、以及人和動(dòng)物的腸道。多數(shù)是人腸道正常叫菌群的重要成員在機(jī)體的其他部位較少。如大腸桿菌能合成人體所需的VitB12、VitK、葉酸等，它們彼此相互聯(lián)系、相互依存，共同維持腸道內(nèi)微環(huán)境的穩(wěn)定。少數(shù)細(xì)菌可引起人類腹瀉或腸外感染，其中具有肯定致病作用的細(xì)菌有志賀氏菌屬、沙門氏菌屬、耶爾森氏菌屬等；具有條件致病作用的細(xì)菌有枸櫞酸桿菌屬、克雷伯菌屬、腸桿菌屬、粘質(zhì)沙雷氏菌屬、變形菌屬等。當(dāng)宿主抵抗力下降、寄居部位改變或腸道菌群失調(diào)，則可引起腸內(nèi)或腸外感染。1、腸道細(xì)菌在腸內(nèi)的分布特點(diǎn)和功能健康人的胃腸道內(nèi)寄居著種類繁多的微生物，這些微生物稱為腸道菌群。在人類胃腸道內(nèi)的細(xì)菌可構(gòu)成一個(gè)巨大而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，一個(gè)人結(jié)腸內(nèi)就有400個(gè)以上的菌種。從口腔進(jìn)入胃的細(xì)菌絕大多數(shù)被胃酸殺滅，剩下的主要是革蘭氏陽(yáng)性需氧菌。胃內(nèi)細(xì)菌濃度<103CFU/ML（CFU即colonyformingunit菌落形成單位）小腸菌群的構(gòu)成介于胃和結(jié)腸之間。近端小腸的菌叢與胃內(nèi)相近，但常能分離出大腸桿菌和厭氧菌。在遠(yuǎn)段回腸，厭氧之間。近端小腸的菌叢與胃內(nèi)相近，但常能分離出大腸桿菌和厭氧菌。遠(yuǎn)段回腸，厭氧菌的數(shù)量開始超過(guò)需氧菌，其中大腸桿菌恒定存在，厭氧菌如類桿菌屬、雙歧桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬，都有相當(dāng)數(shù)量。在回盲瓣的遠(yuǎn)側(cè)，細(xì)菌濃度急劇上升，結(jié)腸細(xì)菌濃度高達(dá)10.11～10.12CFU/ml，細(xì)菌總量幾乎占糞便干重的1/3。其中厭氧菌達(dá)需氧菌的10.3～10.4倍。主要菌種為糞桿菌屬、雙岐桿菌屬和真桿菌屬。正常菌群的功能：1、吸收水分，糞便較軟，較易排泄。在胃部分解消化的食物，經(jīng)由小腸吸收營(yíng)養(yǎng)后，成為粘稠狀物體送至大腸。然后再經(jīng)過(guò)18小時(shí)將水分及礦物質(zhì)吸收，就變成容易排泄的糞便。腸道內(nèi)環(huán)境良好時(shí)，糞便的軟硬適中，排便會(huì)較為順利。2、緩和的蠕動(dòng)，能順利將糞便排出藉由腸的蠕動(dòng)，將糞便緩慢的推送至肛門。如果蠕動(dòng)過(guò)快或太慢，都將影響糞便的構(gòu)成，導(dǎo)致便秘或者腹瀉。而如果腸內(nèi)干凈，則蠕動(dòng)的速度就相當(dāng)?shù)挠幸?guī)律，糞便可順利排出。3、有助維他命的合成。比菲德氏菌等好菌能維護(hù)肌膚的健康，并具有合成有助熱量產(chǎn)生的維他命B1、B2及B6等，以及與止血、骨骼形成有關(guān)的維他命K等之功用。健康的腸道，好菌會(huì)不斷繁殖，維他命的合成也可順利進(jìn)行。4、迅速排出有害物質(zhì)。健康的腸道并非完全沒有壞菌的存在，有害物質(zhì)多少會(huì)產(chǎn)生。當(dāng)然還包括，吃進(jìn)體內(nèi)的食品化學(xué)添加物或是無(wú)法成為營(yíng)養(yǎng)成分的物質(zhì)。只要腸內(nèi)環(huán)境良好，這些物質(zhì)在開始危害身體前就被排出體外。5、避免病原菌的侵害比菲德氏菌等好菌可以刺激并提高身體的免疫機(jī)能，而且易引起食物中毒等病原菌因具怕酸特質(zhì)，所以像是含有好菌的乳酸飲料或健康食品等，都可抑制病原菌在腸內(nèi)繁殖。腸道有菌群除了以上功能之外，對(duì)人體還有營(yíng)養(yǎng)作用，如糖尿病、高血壓、高血脂等。B族維生素和非必需氨基酸對(duì)人類的毛發(fā)具有重要的作用，當(dāng)缺少這些營(yíng)養(yǎng)元素，會(huì)導(dǎo)致頭發(fā)脫落或毛發(fā)發(fā)黃、發(fā)叉，容易折斷等現(xiàn)象。致病菌群的功能：當(dāng)機(jī)體處于有害菌侵襲時(shí)，往往會(huì)腸內(nèi)黏膜粗糙，血液不流通而呈暗紅色。主要表現(xiàn)為1、排泄不順暢，腸內(nèi)囤積糞便為幫助排便，糞便的軟硬程度要適中，但不健康的腸則因膳食纖維的不足，導(dǎo)致糞便囤積大腸，無(wú)法順利排泄；又或者是因壞菌的繁殖引起細(xì)菌感染，而產(chǎn)生腹瀉的發(fā)生。蠕動(dòng)過(guò)快或太慢腸不健康，可能會(huì)影響腸的蠕動(dòng)速度過(guò)快或太慢，妨礙糞便順利排出。糞便更會(huì)因此變太硬或太稀，最終導(dǎo)致便秘，腸道中過(guò)路菌群更因此加速繁殖，如此惡性循環(huán)下去。3、產(chǎn)生有害物質(zhì)。不健康的腸道是壞菌繁殖的絕佳場(chǎng)所，大量的壞菌會(huì)導(dǎo)致阿摩尼亞，硫化水素及糞臭素等有害物質(zhì)的產(chǎn)生。這些物質(zhì)不但是惡臭屁的來(lái)源，更會(huì)加速腸壁的老化，產(chǎn)生導(dǎo)致癌癥的物質(zhì)，成為大腸癌的發(fā)病根源。4、再次地吸收對(duì)身體有害的物質(zhì)。有害物質(zhì)不會(huì)乖乖地待在腸內(nèi)，它會(huì)隨著腸的吸收而跟著血液循環(huán)全身，引起疲倦、肌膚干燥、頭痛、嘔吐等身體不適，會(huì)發(fā)生惡臭的物質(zhì)更會(huì)經(jīng)由血液，透過(guò)嘴巴或身體而散發(fā)出來(lái)。5、病原體容易侵入不健康的腸內(nèi)，乳酸菌等好菌的量會(huì)變少，腸內(nèi)呈堿性。另外，因壞菌所產(chǎn)生的有害物質(zhì)使腸壁所具有的免疫功能下降，導(dǎo)致腸內(nèi)殺菌作用變?nèi)酰?xì)菌或病原菌更容易侵入。2、標(biāo)本采集，分析采集標(biāo)本的影響因素：在臨床上采集糞便標(biāo)本時(shí)應(yīng)用干凈竹簽選取含有粘液、膿血等病變成分的糞便；外觀無(wú)異常的糞便須從表面、深處及糞端多處取材，其量至少為大拇指末段大小，采取新鮮糞便，應(yīng)盛于潔凈、干燥無(wú)吸水性的有蓋容器內(nèi)，不得混有尿液、水或其他物質(zhì)，以免破壞有形成分。采集標(biāo)本的影響因素：在采集糞便時(shí)，糞便和尿液混合，你尿液中的尿酸會(huì)破壞糞便的正常環(huán)境，影響正常糞檢。采集的標(biāo)本如果放在不合適的容器內(nèi)，也會(huì)影響檢驗(yàn)結(jié)果。3、在腸道選擇培養(yǎng)基上菌落特征在培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)無(wú)需添加生長(zhǎng)因子，向培養(yǎng)基中加入伊紅美藍(lán)遇大腸桿菌，菌落呈深紫色，并有金屬光澤，可鑒別大腸桿菌是否存在。4、腸道選擇培養(yǎng)基上菌落Gram’sstain特點(diǎn)選擇培養(yǎng)基菌落革蘭染色后，菌落被染色成紫紅色，菌落散在或者聚集成簇存在。5.細(xì)菌典型生化反應(yīng)及其概率細(xì)菌生化反應(yīng)：各種細(xì)菌所具有的酶系統(tǒng)不盡相同，對(duì)營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的分解能力也不一樣，因而代謝產(chǎn)物或多或少地各有區(qū)別，可供鑒別細(xì)菌之用。用生化試驗(yàn)的方法檢測(cè)細(xì)菌對(duì)各種基質(zhì)的代謝作用及其代謝產(chǎn)物，從而鑒別細(xì)菌的種屬，稱之為細(xì)菌的生化反應(yīng)。6.細(xì)菌的鑒定要點(diǎn)（1）細(xì)菌的