黃瓜的化學(xué)應(yīng)答與黃守瓜的劃圈取食行為

黃瓜的化學(xué)應(yīng)答與黃守瓜的劃圈取食行為

植物和昆蟲之間的相互作用關(guān)系一直是科學(xué)研究的先進(jìn)之一。特別是關(guān)于植物和昆蟲三個(gè)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中化學(xué)關(guān)系的澄清，結(jié)果表明，昆蟲可以喚醒和釋放植物釋放的物質(zhì)。昆蟲可以通過(guò)視覺(jué)、感知和感知與植物相互作用。它是昆蟲捕獲植物最直接的響應(yīng)機(jī)制。一些Acalymma,Aulacophora和Diabrotica屬甲蟲在取食它們的寄主植物時(shí),往往是先用口器在植物葉面劃圈,然后再取食圈內(nèi)的葉組織.對(duì)這些甲蟲有趣的取食行為,有2種不同的解釋:一種解釋認(rèn)為[5~7],當(dāng)甲蟲取食葉面時(shí),寄主植物根部合成貯存的葫蘆素會(huì)迅速遷移到葉面以阻止甲蟲取食,甲蟲為了克服植物的這一化學(xué)防御而采用了劃圈取食的對(duì)策;另一種解釋則認(rèn)為,甲蟲劃圈取食是為了避免葉面的膨壓和分泌的黏質(zhì),與植物的化學(xué)防御不相關(guān).前一種解釋最主要的問(wèn)題在于葫蘆素往往是這些甲蟲取食的引誘物質(zhì),寄主植物葉中的葫蘆素往往刺激甲蟲取食,而不是阻止或防御它們的取食,而后一種解釋目前還缺乏有力的證據(jù)支持.黃足黃守瓜(AulacophorafemoralischinensisWeise)是一種在中國(guó)廣為分布的瓜類植物害蟲,黃守瓜成蟲對(duì)一些瓜類植物就是采用先劃圈后取食圈內(nèi)葉組織的方法.這一有趣的現(xiàn)象早已被發(fā)現(xiàn),但從未有任何機(jī)理方面的研究和解釋.本文從黃守瓜的取食行為和黃瓜(CucumissativusL)的化學(xué)應(yīng)答方面入手,對(duì)這一現(xiàn)象的機(jī)理予以探討.1葫蘆素的測(cè)定(ⅰ)受試材料和藥品.黃瓜選用華南地區(qū)主栽品種粵1號(hào);黃守瓜為單一雌蟲卵孵化培養(yǎng)的第二代成蟲;葫蘆素C和Ⅰ純品通過(guò)液相色譜(HPLC)方法從葫蘆素粗品(天津醫(yī)藥公司)中分離獲得;其他有機(jī)溶劑均為市售色譜純或分析純?cè)噭?(ⅱ)田間調(diào)查.2003年4~7月間分別在廣州和沈陽(yáng)兩地選擇栽種黃瓜、南瓜(Cucurbitamoschata(Duch)Poir)、絲瓜(Luffaacutangula(L)Roxb)、苦瓜(MomordicacharantiaL)和西瓜(Citrulluslanatus(Thunb)Mansfeld)的菜地進(jìn)行(各瓜類作物均為當(dāng)?shù)刂髟云贩N).調(diào)查隨機(jī)抽樣進(jìn)行,每一作物至少抽樣9次,主要觀察田間黃守瓜成蟲對(duì)各種瓜類作物葉面的取食行為和選擇性.(ⅲ)溫室實(shí)驗(yàn).在用50目濾網(wǎng)罩住的籠(15cm×10cm×12cm)中,放入盆栽的子葉期黃瓜幼苗1株或1片離體黃瓜鮮子葉(放在潤(rùn)濕的脫脂棉上).然后每籠放入1頭停止飼喂24h的黃守瓜成蟲,觀察黃守瓜對(duì)活體或離體黃瓜子葉的取食行為.當(dāng)黃守瓜取食30s后,從籠中取出生長(zhǎng)黃瓜幼苗盆或離體鮮葉,放置實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)的時(shí)間間隔后采集子葉測(cè)定它們的葫蘆素含量.所有處理均設(shè)9個(gè)重復(fù).溫室溫度在20~30℃,相對(duì)濕度為75%~90%.(ⅳ)葫蘆素定性定量分析.依據(jù)預(yù)設(shè)的時(shí)間間隔,分別采集100mg被黃守瓜取食的黃瓜活體或離體子葉,然后加1mL氯仿勻化浸提5min,浸提液離心過(guò)濾,殘?jiān)?×1mL氯仿洗滌后離心過(guò)濾.合并濾液用氮?dú)鉂饪s至1mL,濃縮液加入反相C18SepPak微固相萃取柱(Waters公司)中,萃取柱先后用水和50%甲醇水溶液淋洗(3×1mL).50%甲醇水溶液淋洗相吹氮?dú)鉂饪s至100μL后進(jìn)行定性定量分析.黃瓜子葉浸提液首先在FinniganTSQ-7000型液相色譜/質(zhì)譜(LC/MS)聯(lián)用儀上對(duì)葫蘆素進(jìn)行定性測(cè)定,依據(jù)質(zhì)譜分子量值及特征離子判斷葫蘆素的種類及相應(yīng)的色譜峰位置(葫蘆素C:色譜保留時(shí)間,3.55min;M+-60,500;m/z,482;470;111;43.葫蘆素Ⅰ:色譜保留時(shí)間,2.75min;M+,514;m/z,146;96;43.).LC/MS測(cè)定條件如下:色譜柱為C18反相柱(Hypersil,125×4mm,5μm),色譜流動(dòng)相為甲醇/水溶液(7︰3,體積比),流速為0.5mL/min,紫外檢測(cè)波長(zhǎng)228nm,進(jìn)樣量為10μL.質(zhì)譜采用大氣壓化學(xué)電離(atmosphericpressurechemicalionization,APCI)方式,氮作為碰撞氣體.質(zhì)譜滯留時(shí)間為500ms,持續(xù)時(shí)間10min,停頓時(shí)間5min.所有測(cè)定均在正離子質(zhì)譜模式下進(jìn)行,并采用多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(multiplereactionmonitoringmode,MRM)監(jiān)測(cè)相關(guān)的離子.黃瓜子葉中葫蘆素C和Ⅰ的定量分析在HP-1100型HPLC儀上進(jìn)行,測(cè)定條件與上述LC/MS中的色譜條件基本相同,但流速提高到1.5mL/min,進(jìn)樣量為30μL.HPLC定量分析采用內(nèi)標(biāo)法,分別以準(zhǔn)確配制的葫蘆素C和Ⅰ純品的甲醇溶液進(jìn)樣,以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線.測(cè)試樣品中葫蘆素C和Ⅰ含量分別以它們各自的色譜峰面積為基準(zhǔn)從標(biāo)準(zhǔn)曲線中換算.(ⅴ)生測(cè).將黃瓜子葉1cm直徑的葉碟,分別在實(shí)驗(yàn)設(shè)定濃度的葫蘆素C和I的氯仿溶液中蘸2s,另設(shè)只蘸氯仿的葉碟為對(duì)照.葉碟在氯仿?lián)]發(fā)后放入直徑12cm的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)皿放置一層濾紙,下襯濕紗布.每皿分別放入2片處理和對(duì)照的葉碟(等距離間隔放置),再放入1頭停止飼喂24h的黃守瓜成蟲.培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱(25±2℃,L︰D=16︰8),4h后用毫米方格紙分別統(tǒng)計(jì)處理和對(duì)照葉碟被取食的面積,結(jié)果以取食指數(shù)(feedingindex,FI)表征:C為對(duì)照葉碟被取食面積,T為處理葉碟被取食面積,FI>0表示刺激取食,FI<0表示拒食.所有生測(cè)均在相同的條件下重復(fù)5次.2結(jié)果2.1黃守瓜的劃圈取食行為廣州和沈陽(yáng)南北兩地區(qū)的田間觀察結(jié)果表明,黃足黃守瓜成蟲主要?jiǎng)澣θ∈滁S瓜和南瓜,而不取食絲瓜、苦瓜和西瓜等其他瓜類植物,而且這種劃圈取食行為可以發(fā)生在黃瓜和南瓜幼苗子葉到成熟植株葉面的各個(gè)階段.黃守瓜成蟲飛到葉面后,以身體為半徑在30s內(nèi)旋轉(zhuǎn)咬食劃圈,然后取食圈內(nèi)葉組織,瓜葉一旦被劃圈取食,其他的黃守瓜在至少24h內(nèi)不再取食.這些田間觀察結(jié)果通過(guò)在溫室內(nèi)以黃瓜為取食植物的實(shí)驗(yàn)得到進(jìn)一步的驗(yàn)證,而且一個(gè)重要的發(fā)現(xiàn)是,黃守瓜的這一劃圈取食行為僅發(fā)生在活體黃瓜葉面,對(duì)離體的黃瓜鮮葉,黃守瓜是直接取食,而不發(fā)生先劃圈后取食圈內(nèi)葉組織的行為(圖1).這顯示黃守瓜的劃圈取食行為明顯地與黃瓜被取食后的響應(yīng)相關(guān).值得一提的是,黃足黑守瓜(AulacophoracattigarensisWeise)主要取食絲瓜,而且?guī)缀醪徊捎脛澣θ∈车姆椒?顯示守瓜屬成蟲,即使非常接近的種不僅對(duì)取食的瓜類植物有選擇性,而且取食行為也有很大的差異.2.2葫蘆素c黃守瓜對(duì)黃瓜活體和離體鮮葉根本不同的取食行為,應(yīng)歸結(jié)于活體黃瓜能對(duì)黃守瓜的取食產(chǎn)生響應(yīng),而離體鮮葉則不能產(chǎn)生相應(yīng)的機(jī)制.如果這種響應(yīng)機(jī)制與化學(xué)防御相關(guān),黃瓜葉面被黃守瓜取食前后的相關(guān)化學(xué)物質(zhì)應(yīng)有顯著的變化.LC/MS和HPLC測(cè)定結(jié)果顯示,當(dāng)黃瓜被黃守瓜劃圈取食后,子葉中葫蘆素C的含量在60min內(nèi)增加10倍以上,15min后子葉中還出現(xiàn)可測(cè)的葫蘆素Ⅰ,并在60min內(nèi)達(dá)到75μg/g鮮重的水平(圖2),而且這一黃瓜子葉中高水平的葫蘆素C和Ⅰ至少持續(xù)24h,但同樣的結(jié)果并沒(méi)有出現(xiàn)在圈內(nèi)葉組織和離體鮮葉的實(shí)驗(yàn)中.黃瓜子葉含有葫蘆素C,一般不含有其他種類的葫蘆素,而且葫蘆素C含量高的黃瓜品種更易被相關(guān)甲蟲取食,這一結(jié)果早已被闡明.雖然一些黃瓜屬的植物如Cucumisprophetarum能合成葫蘆素Ⅰ,但黃瓜子葉在被黃守瓜取食后能產(chǎn)生葫蘆素Ⅰ則沒(méi)有被報(bào)道.很顯然,葫蘆素Ⅰ是黃瓜對(duì)黃守瓜取食的一種重要的化學(xué)響應(yīng)物質(zhì).進(jìn)一步的試驗(yàn)證實(shí),黃守瓜取食前,黃瓜根和子葉中只含有葫蘆素C,而不含有可測(cè)的葫蘆素Ⅰ,葫蘆素Ⅰ只能在黃守瓜取食后的根葉中檢出,而且子葉中葫蘆素Ⅰ的含量高于根組織(圖3).這表明葫蘆素Ⅰ是黃瓜被黃守瓜取食后誘導(dǎo)產(chǎn)生的,而且很可能是葉組織直接合成,而不是從根部合成貯存后遷移到葉面的.2.3葫蘆素c和的混合物對(duì)黃守瓜攝食的抑制效應(yīng)黃瓜在被黃守瓜取食后,子葉中葫蘆素C和Ⅰ含量的顯著變化表明,這2個(gè)化合物與黃守瓜的劃圈取食行為有關(guān).生測(cè)結(jié)果顯示,葫蘆素C在10~250μg/g濃度范圍內(nèi)均刺激黃守瓜取食,250μg/g以上濃度則開(kāi)始顯示抑制取食效應(yīng),而葫蘆素Ⅰ則在50μg/g低濃度就開(kāi)始抑制黃守瓜取食(圖4).這顯示高劑量的葫蘆素能抑制黃守瓜取食.黃守瓜取食黃瓜后,黃瓜子葉中葫蘆素C含量升高的最大值為91μg/g,難以達(dá)到抑制取食的250μg/g門檻,而黃瓜子葉中葫蘆素Ⅰ的含量在取食后60min能達(dá)到75μg/g抑制取食門檻(圖2和4).這表明,黃瓜子葉中的葫蘆素C是黃守瓜取食的刺激物質(zhì),而葫蘆素Ⅰ則是黃守瓜取食的抑制物質(zhì).但黃瓜子葉中被黃守瓜取食誘導(dǎo)合成的葫蘆素Ⅰ含量最大值75μg/g對(duì)黃守瓜的取食抑制效應(yīng)并不顯著(圖4),這樣有理由推測(cè),黃瓜對(duì)黃守瓜取食的抑制作用應(yīng)是兩種葫蘆素的協(xié)同效應(yīng).這樣進(jìn)一步以黃守瓜劃圈取食后60min時(shí),黃瓜子葉葫蘆素C和Ⅰ的含量為濃度進(jìn)行生測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)葫蘆素C和Ⅰ的混合物比相同濃度的單一葫蘆素Ⅰ對(duì)黃守瓜取食的抑制效應(yīng)明顯增強(qiáng)(圖5).3葫蘆素的食性植物的乳液防御(latexdefense)常導(dǎo)致一些昆蟲采用切割葉脈的取食方式,葫蘆科植物分泌的黏質(zhì)及韌皮部確能增加相關(guān)甲蟲取食的困難.但黃守瓜取食黃瓜時(shí),黃瓜子葉能迅速增加葫蘆素的種類,并達(dá)到抑制其取食的濃度,這表明黃瓜對(duì)黃守瓜的取食產(chǎn)生了化學(xué)響應(yīng).黃守瓜為了應(yīng)對(duì)黃瓜的這一化學(xué)響應(yīng)機(jī)制而采用劃圈取食的方法,這不僅阻斷了圈內(nèi)黃瓜葉組織進(jìn)一步合成葫蘆素,也使圈外葉組織合成的葫蘆素不能遷移到圈內(nèi),而離體鮮葉脫離了黃瓜幼苗,不再具備相應(yīng)的化學(xué)應(yīng)答機(jī)制,這就導(dǎo)致圈內(nèi)葉組織和離體鮮葉中葫蘆素的種類和濃度難以發(fā)生變化,從而使得黃守瓜能取食圈內(nèi)的葉組織或直接取食離體鮮葉.另外,黃瓜幼苗子葉在黃守瓜取食后增加的葫蘆素C和Ⅰ的含量,能持續(xù)相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間,使黃守瓜不能取食同一瓜葉,以保證自身在短期內(nèi)不被進(jìn)一步侵食.黃守瓜的取食行為和黃瓜的化學(xué)響應(yīng)是它們?yōu)樯娑纬傻囊环N巧妙的自我保護(hù)策略.上述結(jié)果能夠支持相關(guān)的化學(xué)防御假設(shè)[5~7],但黃瓜對(duì)黃守瓜取食的化學(xué)應(yīng)答不應(yīng)是其防御的全部機(jī)制,只能是主要機(jī)制之一.而黃守瓜劃圈取食行為不發(fā)生在離體黃瓜鮮葉的結(jié)果則顯示葉膨壓與黃守瓜劃圈取食行為關(guān)聯(lián)不大.葫蘆素是一類四環(huán)三萜化合物,對(duì)人及大多數(shù)動(dòng)物均有毒害作用,但一些甲蟲卻突破了葫蘆科和十字花科等植物合成葫蘆素的化學(xué)防御,反而利用取食葫蘆素來(lái)防御自身的天敵.目前已分離鑒定了10余種結(jié)構(gòu)不同的葫蘆素,大量的研究顯示單一的葫蘆素往往刺激一些昆蟲的