地塞米松磷酸鈉對(duì)大鼠激素性股骨頭壞死模型的影響

地塞米松磷酸鈉對(duì)大鼠激素性股骨頭壞死模型的影響

1957年，彼得格洛伊木和馬斯洛米林首次報(bào)告了使用糖皮質(zhì)激素（以下簡(jiǎn)稱激素）引起的骨壞死的并發(fā)癥。隨著激素的大量使用,人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到大量、長(zhǎng)期地使用激素是導(dǎo)致骨壞死并發(fā)癥的重要原因。激素是繼外傷之后引起股骨頭壞死的第二大原因,約占股骨頭壞死的3%~38%,約25%的激素治療患者會(huì)發(fā)生骨壞死。特別是SARS期間,激素作為不可替代的藥物應(yīng)用于臨床的治療,卻因此造成了大量患者的股骨頭壞死。激素治療造成骨壞死已經(jīng)引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛重視。國(guó)內(nèi)外目前大多利用兔、雞來建立激素性股骨頭壞死模型。本實(shí)驗(yàn)對(duì)成年Wistar大白鼠肌注地塞米松磷酸鈉而建立早期大鼠激素性股骨頭壞死的動(dòng)物模型,觀察激素注射后不同時(shí)期股骨頭病理變化,評(píng)價(jià)大鼠激素性股骨頭壞死特點(diǎn)。1材料和方法1.1周后分組及分組4月齡健康Wistar大白鼠36只,由天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,雌雄各半。適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,隨機(jī)分成兩組:實(shí)驗(yàn)組24只,對(duì)照組12只。精確稱重后,實(shí)驗(yàn)組肌肉注射地塞米松磷酸鈉(10mg/kg),對(duì)照組肌肉注射生理鹽水(2ml/kg),每周1次,共注射14周。兩組均于肌肉注射藥物后2、6、8、10、12、14周處死動(dòng)物,實(shí)驗(yàn)組每次4只,對(duì)照組每次2只。1.2c、形2h-2-甲基苯磺酸鹽取大白鼠雙側(cè)股骨頭,盡量去除股骨頭周圍軟組織后置入10%中性甲醛固定液,固定24h,30%甲酸脫鈣3d,脫鈣完全后,流水沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明處理2h,石蠟包埋。制成4μm厚切片,常規(guī)HE染色,用雙目Olympus光學(xué)顯微鏡分別在40×、100×、400×下觀察,經(jīng)攝像后存于Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)中,分別測(cè)得股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率和骨小梁寬度,最大脂肪細(xì)胞直徑,每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量。1.3以樹膠注染紅色藍(lán)黑色組組織石蠟包埋后,制成4μm厚切片,二甲苯脫蠟后至水,后入重鉻酸鉀-醋酸液1h,水洗后染蘇木素10min。自來水沖洗后,用2%鹽酸乙醇分化,流水沖洗到藍(lán)黑色。1%麗春紅酸性品紅液中染5min,蒸餾水洗。1%磷鉬酸水溶液媒染5min,不經(jīng)水洗入2%淡綠液3min,1%醋酸液分色1min;脫水、透明、中性樹膠封固。100×光鏡下觀察骨小梁內(nèi)膠原分布情況,經(jīng)攝像后存于Image-pro-plus圖像分析系統(tǒng)的計(jì)算機(jī)中,測(cè)得單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量。2結(jié)果2.1骨小梁損傷和骨髓水腫對(duì)照組:骨小梁結(jié)構(gòu)清晰,排列規(guī)則整齊,致密飽滿,見圖1。骨小梁陷窩內(nèi)可見大量骨細(xì)胞,骨細(xì)胞清晰可見,核較大,位于中央,偶可見空骨陷窩,見圖2。實(shí)驗(yàn)組2周:骨細(xì)胞核緊靠一側(cè)骨陷窩壁,固縮,深染,空骨陷窩輕度增多。6周:軟骨下區(qū)骨小梁變細(xì),間距增大,結(jié)構(gòu)紊亂,有斷裂現(xiàn)象。骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多、增大,造血細(xì)胞減少,出現(xiàn)骨髓水腫,見圖3。8周:出現(xiàn)游離骨碎塊。骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞增多、增大明顯,并出現(xiàn)脂肪細(xì)胞互相融合,造血細(xì)胞減少明顯,骨髓水腫面積增大,見圖4。10周:骨小梁斷裂現(xiàn)象進(jìn)一步增多,出現(xiàn)不止一塊游離骨碎塊。骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞多、增大明顯。12周:骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞相對(duì)8周減少,可見較多融合脂肪細(xì)胞,并出現(xiàn)脂肪細(xì)胞壞死的溶解現(xiàn)象,造血細(xì)胞減少明顯,骨髓水腫面積進(jìn)一步增大。14周:骨小梁結(jié)構(gòu)十分紊亂,出現(xiàn)大范圍的骨小梁斷裂和明顯的骨小梁連續(xù)性中斷,大量游離骨碎塊,見圖5。骨髓腔內(nèi)脂肪細(xì)胞己近消失,更多的是脂肪細(xì)胞壞死溶解現(xiàn)象,有大面積的骨髓水腫。骨小梁空泡陷窩充滿,空泡陷窩增加明顯,見圖6。2.2素注射2周后開始實(shí)驗(yàn)組股骨頭單位面積內(nèi)骨小梁面積百分率從激素注射2周后開始較對(duì)照組明顯下降(P<0.01),見表1。激素注射6周起實(shí)驗(yàn)組骨小梁寬度較對(duì)照組有顯著差異(P<0.01),見表2。2.3股骨最大脂肪細(xì)胞直徑的測(cè)量實(shí)驗(yàn)組股骨頭內(nèi)脂肪細(xì)胞最大直徑于激素注射6周時(shí)開始較對(duì)照組明顯增大,有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見表3。2.4根據(jù)高倍鏡下空氣泡形成的數(shù)量實(shí)驗(yàn)組每高倍鏡視野下空泡陷窩數(shù)量于激素注射2周后較對(duì)照組增多,有顯著性差異(P<0.01),見表4。2.5激素注射前后膠原分布對(duì)照組:骨小梁間膠原分布均勻,單位骨小梁面積內(nèi)膠原含量較高,見圖7。實(shí)驗(yàn)組:激素注射后膠原分布呈逐步雜亂現(xiàn)象,見圖8。單位面積骨小梁內(nèi)膠原含量從激素注射后6周開始出現(xiàn)減少,較對(duì)照組有顯著性差異(P<0.01),特別是激素注射8周后,見表5。3激素對(duì)骨髓水腫作用的影響股骨頭壞死是指股骨頭內(nèi)的活性成分(骨細(xì)胞、骨髓造血細(xì)胞及脂肪細(xì)胞)死亡所引起的病理過程。在股骨頭內(nèi),出現(xiàn)不同程度的骨小梁及骨髓組織壞死,是股骨頭壞死的本質(zhì)特征。骨小梁壞死在病理學(xué)上表現(xiàn)為骨小梁的骨陷窩內(nèi)原有的骨細(xì)胞消失。骨髓組織壞死的組織病理學(xué)表現(xiàn)為骨髓內(nèi)的造血細(xì)胞以及脂肪細(xì)胞輪廓不清、胞核消失,甚至崩解破裂。由此可以看出股骨頭壞死實(shí)際上是指股骨頭內(nèi)細(xì)胞的死亡。Ficat根據(jù)股骨頭壞死的病理演變過程,將骨壞死的組織學(xué)特征歸納為4種:(1)骨髓造血成分消失,脂肪細(xì)胞水腫,出現(xiàn)泡沫細(xì)胞。(2)骨髓脂肪呈網(wǎng)狀壞死。(3)骨髓及骨小梁完全壞死。(4)在壞死的骨髓及骨小梁周圍,有纖維組織或新骨形成。1996年,骨循環(huán)研究會(huì)(ARCO)將骨壞死的鏡下特征總結(jié)為:骨小梁及骨髓壞死,伴有一定的組織修復(fù)。我們用Wistar大白鼠制造激素性股骨頭壞死的模型,并分別在激素注射后2、6、8、10、12、14周處死動(dòng)物,進(jìn)行脫鈣后的HE染色和Masson染色觀察,發(fā)現(xiàn)不同時(shí)期股骨頭內(nèi)病理學(xué)改變存在較為明顯的特點(diǎn),如2周的骨細(xì)胞變性,骨細(xì)胞核的深染,邊集;6周的脂肪細(xì)胞增多、增大,骨小梁的斷裂,骨髓水腫的出現(xiàn);8周的脂肪細(xì)胞的融合,出現(xiàn)游離的骨碎塊,造血細(xì)胞的明顯減少;12周的骨小梁的明顯紊亂和大面積的斷裂情況,脂肪細(xì)胞壞死而出現(xiàn)溶解現(xiàn)象;14周的骨髓水腫的明顯加劇等特點(diǎn)。激素可引起骨細(xì)胞大量凋亡。Weinstein等對(duì)激素性股骨頭壞死病人和其他類型股骨頭壞死的病人進(jìn)行了骨細(xì)胞凋亡的檢查,結(jié)果顯示激素性股骨頭壞死組中近端股骨頭松質(zhì)骨區(qū)存在大量凋亡的骨細(xì)胞,可見大量骨細(xì)胞的空泡陷窩。成骨細(xì)胞分泌Ⅰ型膠原和無定型基質(zhì),再加上骨細(xì)胞從而構(gòu)成了脫鈣后股骨頭病理切片的骨小梁結(jié)構(gòu),因此我們可以認(rèn)為激素對(duì)骨小梁形態(tài)和膠原的作用可間接反映激素對(duì)成骨細(xì)胞的作用。糖皮質(zhì)激素抑制成骨細(xì)胞復(fù)制、減少能夠合成骨膠原的細(xì)胞數(shù)量,并且通過轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后機(jī)制抑制α1Ⅰ型膠原表達(dá),減少Ⅰ型膠原合成。同時(shí),糖皮質(zhì)激素還調(diào)節(jié)骨膠原降解。通過對(duì)臨床標(biāo)本的病理切片觀察以及近期的磁共振圖像分析,已經(jīng)明確激素性股骨頭壞死存在骨髓脂肪化。VandeBerg等研究29例類固醇治療患者及29例健康者,進(jìn)一步證實(shí)糖皮質(zhì)激素治療可引起股骨頭骨髓脂肪化。Li等也從基因調(diào)控水平進(jìn)一步證實(shí)激素能夠誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)細(xì)胞直接向脂肪細(xì)胞分化,減少向成骨細(xì)胞分化。因此脂肪細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量也是激素性股骨頭壞死的重要病理評(píng)估指標(biāo)。很多實(shí)驗(yàn)研究都表明激素會(huì)顯著的影響骨髓,并且主要影響其中的造血細(xì)胞,造成骨髓壞死。Cu等實(shí)驗(yàn)中,6~12周可見骨小梁空骨陷窩和骨髓壞死灶,造血細(xì)胞減少等現(xiàn)象。激素對(duì)骨髓造血細(xì)胞作用目前主要認(rèn)為是間接的作用,比如骨內(nèi)壓增高,骨髓內(nèi)異常凝血機(jī)制,骨髓內(nèi)脂肪細(xì)胞增多等間接造成骨髓造血細(xì)胞的減少,而是否直接有作用少有研究。骨髓水腫病理組織學(xué)表現(xiàn)為骨髓腔內(nèi)間質(zhì)水腫,可見無定形滲出物,纖維組織增生和慢性炎性細(xì)胞浸潤(rùn)[13~15]。而關(guān)于骨髓水腫的發(fā)生機(jī)制目前還不甚清楚,機(jī)械應(yīng)力可能在骨髓水腫發(fā)展方面起重要作用,疼痛一出現(xiàn),承重區(qū)壞死骨小梁骨折,應(yīng)力改變引起骨內(nèi)異常應(yīng)力,從而導(dǎo)致骨髓水腫。Schweitzer等報(bào)道生物力學(xué)的改變是導(dǎo)致骨髓水腫的原因之一,骨髓水腫不代表早期壞死的缺血改變,相反它代表股骨頭塌陷和應(yīng)力改變后的繼發(fā)表現(xiàn)。激素在骨髓水腫的作用可能是影響Na+-K+ATP酶活性,從而產(chǎn)生間質(zhì)水腫,但具體作用機(jī)制不詳。本實(shí)驗(yàn)從6周出現(xiàn)骨髓水腫,到14周后出現(xiàn)明顯的骨髓水腫和骨小梁的斷裂骨折,可見骨髓水腫和機(jī)械應(yīng)力下骨小梁斷裂確有一定的關(guān)系。根據(jù)Ficat的股骨頭壞死的演變過程,我們發(fā)現(xiàn)在本研究中激素性股骨頭壞死的病理表現(xiàn)符合其中的骨髓造血成分消失,脂肪細(xì)胞水腫,出現(xiàn)溶解現(xiàn)象;骨髓脂肪呈網(wǎng)狀壞死;骨髓及骨小梁出現(xiàn)壞死。而至于第4點(diǎn)骨小梁和骨髓壞死周圍的纖維組織或者新骨的形成沒有明顯的表現(xiàn),考慮可能和以下原因有關(guān):(1)激素注射后改變成骨細(xì)胞的分化、數(shù)量和功能;Smith等還報(bào)道激素可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期來影響成骨細(xì)胞增殖;近期還有研究發(fā)現(xiàn)激素可促進(jìn)成骨細(xì)胞凋亡。這些都表明激素對(duì)成骨細(xì)胞的抑制作用。我們知道骨的修復(fù)是需要大量成骨細(xì)胞參與而完成的一個(gè)生理性的過程,因激素導(dǎo)致成骨細(xì)胞數(shù)量、功能的下降,所以我們可以很容易理解為何激素性股骨頭壞死中的修復(fù)反應(yīng)較弱,并較其它原因的股骨頭壞死修復(fù)反應(yīng)出現(xiàn)的晚,甚至難以出現(xiàn)。(2)Wistar大白鼠為四足動(dòng)物,四足分配身體的重量,而且行動(dòng)的時(shí)候股骨頭的受力和人類略有不同,并且在實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar大白鼠活動(dòng)較少,這可能和局部疼痛有關(guān)。Cui等采用雞為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,12~24周可見游離死骨和新生骨修復(fù),雞為直立動(dòng)物,雙股骨頭受力較大白鼠為多。因此我們可以推斷股骨頭壞死中的修復(fù)反應(yīng)是需要在一定的力學(xué)刺激下完成的過程。我們可以看出大鼠激素性股骨頭壞死的病理過程遵循股骨頭壞死的一般過程,病理學(xué)表現(xiàn)也有類似之處,但是其