多菌株混合微生態(tài)制劑的研制

多菌株混合微生態(tài)制劑的研制

通過有效的干燥工藝和空腔制備的多株一方面性疾病可以促進(jìn)山羊和小麥的生長，抑制山羊和細(xì)菌的生長，治療山羊和腸道疾病，凈化養(yǎng)殖環(huán)境，減少獸醫(yī)對(duì)環(huán)境的污染，解決抗生素和其他化學(xué)品的抗性和藥物殘留問題。本制劑系由醫(yī)用單菌種微生態(tài)制劑衍生而來,加之使用對(duì)象間在生理特性存在差異,其檢驗(yàn)規(guī)程和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)該對(duì)制劑中多菌種進(jìn)行嚴(yán)格的分株定量檢測(cè)、分類鑒定和安全檢驗(yàn),以避免負(fù)面效應(yīng)。本研究旨在探討多菌株混合微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),為國內(nèi)微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量控制的進(jìn)一步規(guī)范化提供參考。1naoh溶液(1)試劑：多菌株混合微生態(tài)制劑產(chǎn)品、菌株選擇性培養(yǎng)基、9ml無菌生理鹽水、革蘭氏染色液、結(jié)晶紫、pH值試紙、pH值4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液、0.1mol/l的NaOH溶液。95%酒精、稀硫酸(1:10)、1%中性紅溶液、6.5%NaCl溶液、2%NaCl溶液、1%NaCl溶液、0.9%NaCl溶液。(2)儀器用具：超凈工作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、油鏡顯微鏡、電子天平、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫水浴箱、堿式滴定儀、無菌培養(yǎng)皿、瓷盤、1ml無菌吸管、滅菌移液管、試管、50ml具塞刻度試管、三角瓶、燒杯、量筒、溫度計(jì)、酒精燈、接種環(huán)、接種針、鑷子、載玻片、蓋玻片、血球計(jì)數(shù)板、記號(hào)筆、酒精棉球。2多株生殖器主要用于制備制劑中各益生菌的主要生物學(xué)性狀見表1。3選擇性培養(yǎng)和長壽繁殖3.1稀釋液的稀釋、發(fā)酵、菌種的篩選3.1.1本研究優(yōu)選的酵母菌選擇性培養(yǎng)基：通過YPD瓊脂培養(yǎng)基(見表2)接種的酵母菌由1.05×107cfu/ml提高到2.21×107cfu/ml,方差分析表明,采用YPD瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的酵母菌數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的酵母菌數(shù)量有顯著差異。調(diào)節(jié)pH值為6.8±0.2,加熱溶解,分裝后于121℃下高壓滅菌15～20min備用。3.1.3稀釋液制備：準(zhǔn)確稱取8.5g氯化鈉溶解于1000ml蒸餾水中，分別以225ml分裝于內(nèi)含有數(shù)十粒玻璃珠的三角瓶中，以9ml分裝于18mm×180mm的試管中（試管編號(hào)為2～5號(hào)），置于滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌30min，備用。3.1.4稱取樣品25g，放入含有225ml生理鹽水的滅菌三角瓶中，經(jīng)充分振蕩20～30min，制成101～100倍的稀釋液。3.1.5用移液器吸取101～100倍稀釋液1ml于內(nèi)含有9ml生理鹽水的2號(hào)試管中，混合均勻，制成10-2倍稀釋液，依次制成10-2～10-5倍不同梯度的稀釋液。3.1.6每個(gè)樣品選2個(gè)稀釋度，酵母菌選10-4、10-5稀釋度，乳酸桿菌選10-2、10-3稀釋度。吸取1ml菌懸液于相應(yīng)編號(hào)的無菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做2個(gè)平皿，再倒入已冷至45℃的各自培養(yǎng)基15～20ml，邊倒邊搖，使菌液與培養(yǎng)基混合均勻。3.1.7待培養(yǎng)基凝固后,將培養(yǎng)皿倒轉(zhuǎn)過來,酵母菌置于(27±1)℃的生化培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)(48±3)h;乳酸桿菌置于(27±1)℃生化的培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)(72±3)h。3.1.9結(jié)果計(jì)算計(jì)數(shù)后，先分別計(jì)算相應(yīng)的菌數(shù)比例，如挑選的5個(gè)菌落中有4個(gè)符合上述要求，則其菌數(shù)比例4/5，再計(jì)算平均值。每克樣品活菌數(shù)=同一稀釋度各重復(fù)平皿的菌落平均數(shù)×菌數(shù)比例×稀釋倍數(shù)×53.2雙歧桿菌的培養(yǎng)3.2.1本研究優(yōu)選的枯草芽孢桿菌選擇性培養(yǎng)基:通過優(yōu)選的PCA培養(yǎng)基接種的枯草芽孢桿菌由8.32×108cfu/ml提高到3.10×109cfu/ml,方差分析表明,采用PCA培養(yǎng)基(見表4)培養(yǎng)出的枯草芽孢桿菌的數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的枯草芽孢桿菌的數(shù)量有十分顯著的差異。3.2.2本研究優(yōu)選的雙歧桿菌選擇性培養(yǎng)基：通過優(yōu)選改良BBL瓊脂培養(yǎng)基接種的雙歧桿菌由1.98×108cfu/ml提高到3.24×108cfu/ml，方差分析表明，采用改良BBL瓊脂培養(yǎng)基（見表5）培養(yǎng)出的雙歧桿菌的數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的雙歧桿菌的數(shù)量有顯著差異。雙歧桿菌在改良BBL培養(yǎng)基上生長良好，乳酸桿菌在改良BBL培養(yǎng)基上不生長。3.2.3調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH值7.0±0.2，分裝到試管中，在121℃高壓滅菌15min后待冷至55～60℃時(shí)倒入平板，右手持盛培養(yǎng)基的三角瓶置火焰旁邊，用左手將瓶塞輕輕拔出，瓶口保持對(duì)著火焰；然后左手拿培養(yǎng)皿并將皿蓋在火焰附近打開一縫，迅速倒入培養(yǎng)基約15ml，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置在桌面上待凝，培養(yǎng)基凝固后將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。3.2.4稀釋液制備:將經(jīng)過充分混勻的試樣25g,在80℃下滅菌10min,放入含有495ml無菌水帶玻璃珠的滅菌三角瓶內(nèi),靜置20min后置于旋轉(zhuǎn)式搖床上,以200r/min的轉(zhuǎn)速搖5min,即成1%的稀釋液。3.2.6用200μl移液器分別吸取稀釋度為1:1×106、1:1×107、1:1×108的稀釋液100μl，加至平皿內(nèi)的無菌培養(yǎng)基表面，用無菌涂布器將菌懸液均勻地涂布于培養(yǎng)基表面。每一稀釋度重復(fù)3次，同時(shí)加無菌水的空白對(duì)照，37℃培養(yǎng)20～40h，每個(gè)稀釋度取5～10個(gè)菌落的菌體，涂片染色，鏡檢，計(jì)數(shù)菌落。3.2.7按最大稀釋度確定菌落總數(shù)以平板上出現(xiàn)30～300cfu菌落的稀釋度為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)只有一個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)在30～300cfu，則以該平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)；若有兩個(gè)稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30～300cfu，應(yīng)按兩面三刀者菌落總數(shù)之比值來確定；若其比值小于等于2應(yīng)計(jì)數(shù)兩者的平均數(shù)，若大于是則計(jì)數(shù)其中稀釋度較小的菌落總數(shù)；若三個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300cfu，則應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；若三個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30cfu，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)；若三個(gè)稀釋度的平均菌落數(shù)確均不在30～300cfu，則以最近300或30cfu的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)。3.2.8菌落計(jì)數(shù)c每克樣品的活菌數(shù)=同一稀釋度幾次重復(fù)的平均菌落數(shù)×10×稀釋倍數(shù)式中：N———樣品中菌落數(shù)；ΣC———平板菌落數(shù)之和；n1———第一適宜稀釋度（1:100）平板上的菌落數(shù);n2———第二適宜稀釋度（1:1000）平板上的菌落數(shù)；d———第一稀釋度。3.3培養(yǎng)條件：pse平板3.3.1本研究優(yōu)選的腸球菌選擇性培養(yǎng)基通過PSE瓊脂培養(yǎng)基（見表6）接種的腸球菌由0.81×109cfu/ml提高到2.92×109cfu/ml，方差分析表明，采用PSE瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的腸球菌數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的腸球菌數(shù)量有顯著差異。3.3.2將融化的PSE瓊脂培養(yǎng)于45～50℃保溫，保溫時(shí)間不要超過4h，傾注于平板。3.3.3取25g樣品，放入225ml滅菌生理鹽水中，充分混勻，制成1:10樣品稀釋液。取1ml適當(dāng)稀釋的樣液加入90mm×15mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，傾入12～15ml已融化約45℃的PSE瓊脂培養(yǎng)基，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使樣液與培養(yǎng)基充分混合，讓細(xì)菌均勻分散在培養(yǎng)基內(nèi)。從樣品稀釋液制備至傾注平板時(shí)間不要超過20min。待平板凝固后倒置平皿進(jìn)行培養(yǎng)，PSE平板置（36±1）℃培養(yǎng)（24±2)h。3.3.4菌落計(jì)數(shù)：糞鏈球菌群細(xì)菌在PSE瓊脂平板上形成帶棕色環(huán)的棕黑色菌落。使用有適當(dāng)光源的低倍大視野雙目解剖鏡或效能相當(dāng)?shù)钠渌鈱W(xué)儀器，對(duì)有30～300個(gè)菌落的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。按糞鏈菌群數(shù)/g(ml）報(bào)告結(jié)果。3.4用血球計(jì)數(shù)板測(cè)定了美國曲霉菌的數(shù)量將孢子懸浮液放在血球計(jì)數(shù)板與蓋片之間的計(jì)數(shù)室中，在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)在顯微鏡下觀察到的孢子數(shù)目來計(jì)算單位體積的孢子總數(shù)。3.4.1種曲子的稀釋精確稱取樣品1g(稱準(zhǔn)至0.002g)，倒人盛有玻璃珠的250ml三角瓶內(nèi)，加入95%酒精5ml、無菌水20ml、稀硫酸(1:10)10ml，在旋渦均勻器上充分振蕩，使種曲孢子分散，然后用3層紗布過濾，用無菌水反復(fù)沖洗，使濾渣不含孢子，最后稀釋至500ml。3.4.2稀釋液的u3000加入取潔凈干燥的血球計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，用無菌滴管取孢子稀釋液1小滴，滴于蓋玻片的邊緣處(不宜過多)，讓滴液自行滲入計(jì)數(shù)室中，不可有氣泡產(chǎn)生。3.4.3中央一個(gè)中格的數(shù)目使用16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)板時(shí)，只計(jì)板上4個(gè)角上的4個(gè)中格(即100個(gè)小格)，如果使用25×16規(guī)格的計(jì)數(shù)板，除計(jì)4個(gè)角上的4個(gè)中格外，還需要計(jì)中央一個(gè)中格的數(shù)目(即80個(gè)小格)。每個(gè)樣品重復(fù)觀察計(jì)數(shù)不少于2次，然后取其平均值。3.4.4pbp小格內(nèi)培養(yǎng)液數(shù)16×25規(guī)格的計(jì)數(shù)板：孢子數(shù)（個(gè)/g）=(n/100)×400×10000×（V/m）式中：n———100小格內(nèi)孢子總數(shù)（個(gè)）；V———孢子稀釋液體（ml）;m———樣品質(zhì)量（g）。25×16規(guī)格的計(jì)數(shù)板：孢子數(shù)（個(gè)/g）=(n/80)×400×10000×（V/m）式中：n———80小格內(nèi)孢子總數(shù)（個(gè)）；V———孢子稀釋液體（ml）;m———樣品質(zhì)量（g）。4鹽和氯化鈉的制備本研究優(yōu)選的雜菌選擇性培養(yǎng)基為麥康凱瓊脂（見表7）。用麥康凱瓊脂為腸道致病菌和非發(fā)酵細(xì)菌的選擇性培養(yǎng)基，其中的膽鹽可抑制革蘭陽性細(xì)菌生長，而對(duì)傷寒等沙門菌有促進(jìn)生長的作用。制法如下：(1)將蛋白胨、膽鹽和氯化鈉溶解于400ml蒸餾水中，校正pH值7.2，加入600ml瓊脂，加熱溶解，分裝于三角瓶內(nèi)，在121℃下高壓滅菌15min備用。(2)臨用時(shí)加熱溶化瓊脂，趁熱加入乳糖，冷至50～55℃時(shí)，加入結(jié)晶紫和中性紅水溶液，搖勻后傾注平板。結(jié)晶紫及中性紅水溶液配好后須經(jīng)高壓滅菌。按總量3%～5%抽樣，最低不少于5件，稱取供試品1g，加到9ml滅菌0.9%氯化鈉溶液或其它適宜稀釋液中,混勻，按10-1、10-2、10-3…10-10稀釋度稀釋，取適宜稀釋度供試液0.1ml加到已備好的麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，以玻璃棒涂勻，一式3份，倒置，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每天觀察結(jié)果，記錄平皿上生長的菌落數(shù)。5家兔的體外藥動(dòng)學(xué)用10億個(gè)菌液皮下注射小白鼠3～5只，觀察7～14d，并用家兔5只，各灌胃口服50億個(gè)菌，觀察5～7d。如引起發(fā)病或出現(xiàn)中毒癥狀，即確定為致病菌，凡染有致病菌的產(chǎn)品一律廢棄。6灌胃自治指標(biāo)取2g制品加入8ml生理鹽水中，混合均勻，用5只體重18～22g小鼠，每只小鼠經(jīng)口灌胃0.5ml，每天1次，連續(xù)3d。自第1日灌胃起，連續(xù)觀察7d，小鼠應(yīng)健康存活、體重增加，判為合格。如不符合規(guī)定，可用10只小鼠復(fù)試1次，判定標(biāo)準(zhǔn)同前。安全試驗(yàn)不合格產(chǎn)品不能出廠。7樣量及樣量每批產(chǎn)品的取樣數(shù)量不得少于5件，每件采樣量為一般為25g。通過以上試驗(yàn)，結(jié)合規(guī)?；a(chǎn)時(shí)的工藝條件，本獸用多菌株混合微生態(tài)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)暫定如表8所述。8活菌生存時(shí)間活菌一般怕光、怕熱，有的怕凍、怕潮濕；溫度越高，濕度越大，活菌生存時(shí)間越短。經(jīng)倉儲(chǔ)試驗(yàn)，產(chǎn)品在2～8℃下冷貯，保質(zhì)期可達(dá)12個(gè)月。也可在37℃以下室溫貯存，但10℃以上時(shí)溫度倉儲(chǔ)，隨著室溫每升高10℃，保質(zhì)期縮短2～3個(gè)月。9腸道致病性菌株的篩選9.1本研究基于優(yōu)選選擇性培養(yǎng)基，實(shí)現(xiàn)制劑中各菌株的分株培養(yǎng)，方法可靠；用血球計(jì)數(shù)板法進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，方法簡便、快捷，可作為同類微生態(tài)制劑產(chǎn)品質(zhì)量控制、安全評(píng)價(jià)的參考。9.2本研究所制訂的“獸用多菌株混合微生態(tài)制劑暫行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)”在雜菌病原性鑒定、安全試驗(yàn)方法等方面有待進(jìn)一步改進(jìn)。應(yīng)進(jìn)一步從亞細(xì)胞和分子水平上研究微生態(tài)制劑的檢測(cè)技術(shù)，避免因菌株變異使制劑可能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的潛在危害。9.3益生活菌對(duì)酸、堿、熱較為敏感，本研究涉及的微生態(tài)制劑系畜禽口服劑，拌入飼料中，經(jīng)口服后其中的益生活菌必須經(jīng)過高酸的胃和高堿、高酶的腸道，消化道對(duì)益生菌有直接的破壞，益生菌在腸道內(nèi)其活性和數(shù)量難免發(fā)生改變，因此，動(dòng)物進(jìn)食微生態(tài)制劑產(chǎn)品后，益生菌的有效活性問題有待進(jìn)一步研究。9.4本研究所采用的麥康凱瓊脂選擇性培養(yǎng)基可對(duì)腸道致病菌和非發(fā)酵細(xì)菌進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，但有少數(shù)革蘭氏陰性菌不生長，對(duì)致病雜菌計(jì)數(shù)存在一定的影響。3.1.2本研究優(yōu)選的乳桿菌選擇性培養(yǎng)基:通過改良MC瓊脂培養(yǎng)基(見表3)接種的乳桿菌由2.11×108cfu/ml提高到4.32×108cfu/ml,方差分析表明,采用改良MC瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)出的乳桿菌的數(shù)量與市面上其它培養(yǎng)基培養(yǎng)出的乳桿菌數(shù)量有顯著差異。按照以上配方稱取試劑置于1000ml蒸餾水中,加熱溶解,調(diào)節(jié)pH值為6.0±0.2,加入中性紅液,分裝于三角瓶中,121℃高壓滅菌15～20min,備用。3.1.8培養(yǎng)結(jié)束后,選擇同一個(gè)稀釋度各個(gè)重復(fù)間的菌落數(shù)相差不太懸殊,且菌落數(shù)量在30～300cfu的培養(yǎng)皿進(jìn)行分別計(jì)數(shù)。在YPD平板和改良MC平板上,各隨機(jī)挑選5個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。平板上菌落如呈革蘭氏陽性,鏡下細(xì)胞大且為圓形、卵圓形的為酵母菌;菌落如呈革蘭氏陽性,