第十章 色譜技術(shù)

第十章色譜技術(shù)目錄第一節(jié)色譜技術(shù)概述第二節(jié)吸附色譜第三節(jié)基于疏水作用的高效液相色譜第四節(jié)體積排阻色譜第五節(jié)親和色譜第六節(jié)離子交換色譜色譜基本理論、基本概念；生物藥品的常用吸附色譜、反相色譜、離子交換色譜以及親和色譜技術(shù)各種色譜技術(shù)中常用的色譜固定相各類色譜技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域針對目標(biāo)藥物體系，熟練選擇合適的色譜技術(shù)對目標(biāo)藥物進(jìn)行分離純化。學(xué)習(xí)目標(biāo)掌握熟悉了解能力要求第一節(jié)色譜技術(shù)概述色譜(Chromatography)技術(shù)又被稱為層析技術(shù)。一、色譜法分類固定相基質(zhì)的形式分離原理

流動相的形式

紙色譜薄層色譜柱色譜吸附色譜分配色譜體積排阻色譜離子交換色譜親和色譜

氣相色譜液相色譜超臨界流體色譜

（一）概述液相色譜主要通過目標(biāo)組分或待分離物在兩相間分配能力或作用力不同而使目標(biāo)組分得以分離，其中一相保持不動，稱為固定相，而另一相移動，被稱為流動相。待分離組分，通過在固定相以及流動相之間各種作用力的矢量和差異而得到分離，這些作用有色散力、氫鍵、離子鍵、親水作用、疏水作用、靜電相互作用、分子擴(kuò)散、親和、絡(luò)合、共價鍵修飾或交換等。二、基本概念加樣和流動相入口洗脫液收集并檢測進(jìn)樣閥檢測器輸液泵貯液瓶進(jìn)樣流出液色譜柱（二）固定相也稱為柱填料，是液相色譜的核心部件。固定相的骨架材料又稱為色譜基質(zhì)利用化學(xué)或其他方法將相應(yīng)特性的分子鍵合至色譜基質(zhì)表面，構(gòu)成鍵合固定相，也稱為鍵合相色譜填料。

多孔硅膠

可控孔徑玻璃

羥基磷灰石氧化鋁、氧化鋯無機(jī)材料有機(jī)高分子1.色譜基質(zhì)

聚苯乙烯-二乙烯苯

聚甲基丙烯酸酯

纖維素葡聚糖及其修飾產(chǎn)物

2.粒徑和結(jié)構(gòu)LC應(yīng)用粒徑（

m）分析型3～10制備型10～40低壓/大規(guī)模制備型40～150極大規(guī)模制備型150～300中孔填料大孔填料微孔填料

3.填料孔徑色譜基質(zhì)的孔徑一般必須是待純化的溶質(zhì)分子大小的5倍以有利于它們通過分子擴(kuò)散進(jìn)入所有的孔。1000到10000?180~500?60~120?

4.鍵合相：是共價鍵合或通過吸附、涂敷等附著于色譜基質(zhì)表面上的提供與流動相中溶質(zhì)分子產(chǎn)生相互作用的分子。

三、色譜效率（一）基本保留原理信號強(qiáng)度tRBtRA半峰寬WAh/2WBh/2WAWB基線峰寬to峰高（h）AB0（樣品注射點(diǎn)）VoVRAVRB（死體積）洗脫體積/時間保留因子或容量因子：k

=(tR-to)/to=(VR-Vo)/Vok

越大，則表明該溶質(zhì)在特定條件下與固定相的作用力越強(qiáng)，對應(yīng)于保留時間來說，其保留時間較長；反之，則保留時間較短。選擇因子：

=kB

/kA

選擇因子

越大，則表明A和B兩種成分于特定條件下在該柱子上越容易被分離開來。柱效：N=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2柱子效率越高表明特定條件下固定相對某溶質(zhì)的分離效果越好。分辨率：Rs=(tRB-tRA)/(WA+WB)1/2=(tRB-tRA)(WAh/2+WBh/2)0.85=(1/4)(

-1)(N1/2)(k

/1+k

)Rs值越大，兩種組分分離的越好。Rs=1，兩組分具有較好的分離，互相沾染約2%，即每種組分的純度約為98%。當(dāng)Rs=1.5時，兩組分基本完全分開，每種組分的純度可達(dá)到99.8%。ab峰不對稱因子=b/a10%峰高信號強(qiáng)度洗脫體積/時間峰不對稱因子（As），主要是反映固定相與組分之間的作用力強(qiáng)弱情況，如果As越大，則表明組分與固定相在特定洗脫條件下相互作用力越大，產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象。（二）柱效柱效：N=16(tR/W)2=5.54(tR/Wh/2)2依據(jù)塔板理論，塔板數(shù)越高，表明溶質(zhì)分子在柱子上的分離效率越高。N已知，柱效可通過柱子的長度（L）與理論塔板高度（H）之間的比值進(jìn)行計(jì)算，即N=L/H。小粒徑色譜填料、低流動相流速和不太粘稠的流動相有利于減小H值。H值小，則N大，此時W也小。（三）樣品負(fù)載量樣品負(fù)載量也稱柱容量，是指可以注入色譜系統(tǒng)而又不會使柱過載的最大可進(jìn)樣品量，通常以每克柱填料對應(yīng)的的最大進(jìn)樣量來表示。它顯示了柱的大小和其對應(yīng)的樣品處理能力，對于分析性色譜來說，樣品負(fù)載量決定了動態(tài)的分析范圍。兩種計(jì)算方法：（1）以非裝柱的形式，通過樣品與對應(yīng)數(shù)量的柱填料之間的平衡，確定最大樣品負(fù)載量；（2）以裝柱的形式，在柱色譜中，當(dāng)進(jìn)樣量達(dá)到柱子的飽和負(fù)載量時，洗脫液中樣品的濃度等于注入樣品的濃度。第二節(jié)吸附色譜吸附是利用吸附劑對液體或氣體中某一組分具有選擇吸附的能力，使其富集在吸附劑表面的過程，被吸附的物質(zhì)稱為吸附質(zhì)。四個步驟：（1）吸附劑通入待分離的料液（或氣體）；（2）吸附質(zhì)被吸附到吸附劑表面（3）料液流出（4）吸附質(zhì)解吸回收，吸附劑再生。一、吸附類型（一）物理吸附——分子間引力（范德華力）特點(diǎn)：（1）無選擇性（2）吸附量可由物系不同相差較大（3）低溫可進(jìn)行（4）單、多分子層吸附均可（5）易達(dá)到吸附平衡狀態(tài)

一、吸附類型（二）化學(xué)吸附——化學(xué)鍵特點(diǎn)：（1）較高溫進(jìn)行（2）放熱（3）單分子吸附（4）不易和解析，平衡慢

（5）選擇性強(qiáng)

一、吸附類型（三）交換吸附——雙電層特點(diǎn)：（1）吸附劑和溶液發(fā)生離子交換（2）吸附力決定于離子所帶電荷二、常用吸附劑吸附劑具備特性：（1）對被分離的物質(zhì)具有很強(qiáng)的吸附能力，即平衡吸附量大；（2）有較高的吸附選擇性；（3）有一定的機(jī)械強(qiáng)度，再生容易；（4）性能穩(wěn)定、價廉易得。（一）、活性炭活性炭按照粒徑大小可分為粉末活性炭、顆?；钚蕴恳约盎诜勰┗钚蕴恐苽涞念w粒型活性炭。

（二）、大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑性質(zhì)與活性炭、硅膠相似，簡稱大網(wǎng)格吸附劑、大孔樹脂吸附劑或吸附樹脂。（1）脫色去臭力與活性炭相當(dāng)，對有機(jī)物質(zhì)具有良好的選擇性（2）性質(zhì)穩(wěn)定，機(jī)械強(qiáng)度好，經(jīng)久耐用，品種多（3）吸附速度快，易解吸，易再生，直徑在0.2~0.8mm之間，不污染環(huán)境，使用方便（4）價格昂貴，吸附效果易受流速和溶質(zhì)濃度等因素影響1.大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑類型和結(jié)構(gòu)名稱樹脂結(jié)構(gòu)極性比表面孔徑孔度骨架密度交聯(lián)劑XAD-1苯乙烯非極性100200371.07二乙烯苯XAD-233090421.07XAD-35264438XAD-475050511.08XAD-54156843XAD-6丙烯酸酯中極性6349849雙

-甲基丙烯酸二乙醇酯XAD-7

-甲基丙烯酸酯45080551.24XAD-8

-甲基丙烯酸酯140250521.25XAD-9亞砜極性25080451.26XAD-10丙烯酰胺極性69352XAD-11氧化氮類強(qiáng)極性170210411.18XAD-12氧化氮類強(qiáng)極性251300451.172.大孔網(wǎng)狀聚合物吸附劑吸附機(jī)制大孔網(wǎng)狀聚合物吸附能力與樹脂的化學(xué)結(jié)構(gòu)、物理性能、溶質(zhì)及溶液的性質(zhì)有關(guān)。非極性吸附劑適宜于從極性溶劑（如水）中吸附非極性物質(zhì)。高極性吸附劑適宜于從非極性溶劑中吸附極性物質(zhì)。中等極性的吸附劑兩種者均可吸附，在非極性溶劑中吸附時，溶質(zhì)分子以親水性部分吸著在吸附劑上，而當(dāng)它在極性溶媒中可同時吸附溶質(zhì)分子的極性和非極性部分。解析方法32411143低級醇、酮或其水溶液

堿解析弱酸性溶質(zhì)酸解析弱堿性溶質(zhì)水洗其他因素：無機(jī)鹽、孔徑比表面積極性顆粒度孔徑吸附容量大、吸附速度快、機(jī)械強(qiáng)度好

三、影響吸附的因素（一）吸附劑的性質(zhì)固體表面張力越小，液體被吸附越多溶質(zhì)從較易溶解的溶劑中被吸附時，吸附量較小同系列物質(zhì)，吸附量的變化有規(guī)律

極性相似，相吸附預(yù)測相對吸附量（二）吸附質(zhì)的性質(zhì)脫色和除熱原一般用活性炭，去過敏物質(zhì)常用白陶土。（三）溫度放熱。一旦達(dá)到吸附平衡，↑溫度會使吸附量↓。但低溫時，↑溫度↑吸附速度↑吸附量吸熱。在這種情況下，↑溫度↑吸附量考慮熱穩(wěn)定性。酶熱不穩(wěn)定，0℃左右吸附；比較穩(wěn)定，室溫操作

普通吸附蛋白質(zhì)吸附生化物質(zhì)吸附影響吸附的因素鹽的濃度溶液pH吸附物濃度與吸附劑用量實(shí)驗(yàn)確定

等電點(diǎn)附近吸附量最大。有機(jī)酸在酸性下，胺類在堿性下較易為非極性吸附劑所吸附。吸附質(zhì)平衡濃度愈大，吸附量愈大；蛋白質(zhì)、酶分離時，濃度﹤1%，以增強(qiáng)選擇性；吸附劑用量第三節(jié)基于疏水作用的高效液相色譜以疏水作用為基礎(chǔ)的液相色譜分離技術(shù)主要是反相高效色譜（RP-HPLC）和疏水相互作用色譜（HIC）。一、反相高效液相色譜（一）概述

RP-HPLC是指固定相具有疏水性功能團(tuán)構(gòu)成的表面，在高效分離模式中，流動相的極性一般比固定相強(qiáng)，因此稱之為反相高效液相色譜。

應(yīng)用：分析、分離、脫鹽特點(diǎn)：高分辨率、聯(lián)用填料：修飾硅膠、高分子一、反相高效液相色譜（二）流動相的選擇

1.反相色譜：流動相極性大于固定相極性的色譜模式。常用流動相：甲醇、乙腈等0～100%水溶液。根據(jù)需要可使用pH2～pH8的緩沖液、離子對試劑如0.1%的三氟乙酸流動相選擇：相似相溶；溶質(zhì)分子疏水性強(qiáng)，增加有機(jī)相的比例，更換洗脫能力更強(qiáng)的洗脫劑。洗脫能力強(qiáng)弱一般為四氫呋喃>乙腈>甲醇

一、反相高效液相色譜（二）流動相的選擇

2.正相色譜固定相：未經(jīng)修飾的硅膠、氧化鋁、二氧化鋯等，也可以是經(jīng)過表面修飾后的色譜填料。采用相對較強(qiáng)的洗脫劑。在正相色譜模式中，一般很少使用含水溶劑，在個別情況下，如以硅膠作為固定相時，水可以極微量的形式存在用于飽和硅膠表面上的活性較強(qiáng)的硅羥基位點(diǎn)。正相色譜流動相可以是石油醚、環(huán)己烷、苯、甲苯、乙醇等。二、疏水相互作用色譜HIC主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)或多肽類的分離中。HIC是一種基于蛋白質(zhì)和固定相非極性區(qū)域相互作用的分離過程，HIC是IEC（離子交換色譜）和SEC（體積排阻色譜）的補(bǔ)充，聯(lián)用RP-HPLC可進(jìn)行進(jìn)一步分離純化和脫鹽。HIC分離蛋白質(zhì)通常是在中性條件下以線性遞減的鹽梯度進(jìn)行洗脫。起始緩沖的鹽濃度典型的是在1.5~2.0M硫酸銨，隨著鹽濃度的減小，吸附不強(qiáng)的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來。HIC可以保持蛋白質(zhì)或多肽的生物活性而又可有效對其進(jìn)行分離HIC所選用的基質(zhì)材料通常為硅膠、聚甲基丙烯酸酯、瓊脂糖以及其他相關(guān)高分子，粒徑可以在5～200

m范圍內(nèi)選擇。第四節(jié)體積排阻色譜體積排阻色譜（SEC）是將分子按照其大小進(jìn)行分離的色譜技術(shù)，根據(jù)固定相和使用環(huán)境的不同主要有兩種類型，凝膠過濾色譜（GFC）和凝膠滲透色譜（GPC）。特點(diǎn)柱負(fù)載量可通過固定相的量來控制，利于制備分離。嚴(yán)格按分子流體力學(xué)體積進(jìn)行分離大分子可以測定其分子量和分子量分布固定相惰性，無需梯度洗脫；柱壽命較長；固定相生物相容性好，生物大分子活性回收率高分辨率較低，只適用于分子大小差別較大的體系，其峰容量也較低

一、分離機(jī)制SEC過程是利用固定相的孔徑分布，使分子按照其流體力學(xué)體積在固定相的孔及流動相之間不斷進(jìn)行分配而最終分離的。溶劑分子由于相對于固定相的孔徑來說通常是非常小的，可以自由出入固定相內(nèi)各種孔徑的孔，而溶質(zhì)分子一般僅擴(kuò)散至孔徑比自己大的孔中，大于固定相最大可允許進(jìn)入其孔的大分子，一般只是在構(gòu)成色譜柱的顆粒之間進(jìn)行分配。二、凝膠過濾色譜凝膠過濾色譜是在水相淋洗體系中，對于水溶性大分子化合物按其分子尺寸大小進(jìn)行分離的一種液相色譜技術(shù)。應(yīng)用：水溶性物質(zhì)尤其是高分子量水溶性化合物的分離。在溶質(zhì)分子量相差較大的情況下，GFC方法是目前最簡便的一種分離手段，GFC可用于初級分離、緩沖液交換、有機(jī)溶劑純化，用于高分辨和高效快速分離以及分子量的測定等

（一）多糖型GFC填料產(chǎn)品分離范圍（球蛋白）粒徑/

m耐壓/MPa最高流速/cm/h應(yīng)用特性Superdex75prepgrade3000~7000022~440.390重組蛋白、細(xì)胞色素Superose6prepgrade5000~5×10622~400.440肽類蛋白、多糖、寡核苷酸、病毒SephacylS-200HR5000~25000025~750.260白蛋白、血液抗體、單抗SephacylS-1000HR葡聚糖5×105~1×10840~1050.1300巨大多糖分子；小顆粒分子如膜結(jié)合囊(<300~400nm直徑)或病毒Sephrose6FastFlow10000~4×10645~1650.1250巨大分子如質(zhì)粒DNA、病毒等SephroseCL-6B10000~4×10645~650.0230蛋白、肽類、多糖（二）高聚物型GFC填料名稱基質(zhì)材料粒度/

m排阻極限或分離范圍IonpakS-801磺化PS-DVB1000(多糖)IonpakS-806磺化PS-DVB5×107(多糖)OhpakQ-801聚乙烯醇700(PEG),1800(多糖)OhpakQ-806GMA共聚物1×107(PEG),2.5×107(多糖)Toyopearl系列聚乙烯醇分不同等級7×103~1×107(多糖)TSK-GELDNA-PW親水性高聚物104×104~8×106(PEG)第五節(jié)親和色譜

親和色譜（AffinityChromatography，AFC/AC）是基于分子間的各種特異性相互作用（如抗原-抗體、酶-底物、配體-受體、堿基互補(bǔ)等）的色譜模式。親和色譜基質(zhì)材料：天然或合成高分子，如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等；無機(jī)材料，如可控孔徑硅膠（CPS）、可控孔徑玻璃（CPG）等。親和色譜的洗脫劑:一定pH和離子強(qiáng)度的各類緩沖液。動態(tài)洗脫、靜態(tài)洗脫均可。一、親和色譜基質(zhì)（一）多糖基質(zhì)的AFC填料常用的親和載體：多糖型凝膠，如Sepharose4B與6B、Sepharose4FF與6FF、SepharoseCL-4B與CL-6B多糖表面活性基團(tuán)（如氨基、羧基以及羥基等）可提供親和配基的修飾或鍵合。配體有ProteinA、Heparin、streptavidin、ConA以及LentilLectin等。多糖類可與無機(jī)基質(zhì)形成雜合材料、或者涂敷于無機(jī)基質(zhì)的表面用于改善無機(jī)基質(zhì)材料的生物相容性不好及非特異性吸附問題，用于高效親和色譜模式。（二）以高聚物為基質(zhì)的AFC填料常見基質(zhì)：交聯(lián)聚苯乙烯、交聯(lián)聚甲基丙烯酸酯類、親水性的羥基聚醚、交聯(lián)聚乙烯醇特點(diǎn):粒度均勻、孔徑較大、剛性良好，pH值適應(yīng)性廣泛，但親水性和生物相容性不及多糖基質(zhì)。（三）無機(jī)材料為基質(zhì)的親和色譜填料基質(zhì)材料：多孔硅膠，可控孔徑玻璃（CPG）硅膠孔徑：30~100nm小粒徑無孔硅膠（粒子直徑小于3

m）由于傳質(zhì)阻力小，也被用于AFC填料。二、固定化金屬離子親和色譜親和色譜中必須考慮以下兩個重要因素：（1）選擇的基質(zhì)本身應(yīng)能夠經(jīng)受住柱再生時所使用的劇烈條件，如使用NaOH或脲等；（2）選擇的配基與目標(biāo)分子具有很強(qiáng)的結(jié)合作用以便使其能從復(fù)雜的基體中抓住目標(biāo)分子。固定化金屬離子親和色譜（ImmobilizedMetal-ionAffinityChromatography,IMAC）是基于組氨酸、半胱氨酸和色氨酸側(cè)鏈可以與固定于色譜基質(zhì)（通過亞氨基二乙酸（IDA）固定）上的過度金屬離子（如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+等）相互作用。分布于蛋白質(zhì)表面的這類氨基酸殘基的多少決定了蛋白質(zhì)或多肽與金屬離子親和固定相之間的相互作用強(qiáng)弱，因此很少蛋白質(zhì)會強(qiáng)烈地結(jié)合在固定化金屬離子親和固定相上，這有利于蛋白質(zhì)的分離純化。蛋白質(zhì)解吸可于洗脫液中添加競爭配基如咪唑、組氨酸、氯化銨、組胺或甘氨酸通過逐步洗脫或梯度洗脫的方式進(jìn)行。蛋白質(zhì)吸附條件：pH（7.0~8.5），緩沖液內(nèi)加入0.1~1MNaCl可減少非特異性的靜電相互作用。在IMAC中常用磷酸鹽、Tris、硼酸鹽、HEPES以及乙酸緩沖液，典型濃度是20~100mM。很多添加劑不影響IMAC過程，但一些離子型表面活性劑、疊氮化鈉和螯合試劑通常對IMAC有毒害效應(yīng)。凝集素親和色譜(LectinAffinityChromatography)凝集素是一種糖結(jié)合蛋白，可特異性地與糖基偶合物相互作用。凝集素親和柱特別適合于純化膜蛋白和分泌蛋白，因?yàn)檫@些蛋白常常是糖基化的。在柱中，非糖基化的蛋白質(zhì)首先被洗脫下來，糖基化蛋白可以在固定相上通過水解得到，非糖基化的多肽可以通過進(jìn)一步洗脫得到。凝集素親和色譜可以一批一批的進(jìn)行，