第七章原核基因的表達調(diào)控

第七章基因的表達與調(diào)控（上）組成型、永久型（constitutive）蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)并不是以相同拷貝數(shù)存在于每個細胞中，有些蛋白質(zhì)的數(shù)目相當(dāng)固定，如糖酵解酶體系、DNA聚合酶、RNA聚合酶等。適應(yīng)型、調(diào)節(jié)型（adaptiveorregulated）蛋白質(zhì)合成速率明顯受環(huán)境影響的蛋白質(zhì)。7.1原核基因表達調(diào)控總論基因表達（geneexpression）是指從DNA到蛋白質(zhì)或功能RNA的過程。對這個過程的調(diào)節(jié)就稱為基因表達調(diào)控（generegulationorgenecontrol）基因表達調(diào)控水平轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控（transcriptionalregulation）轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控（post-transcriptionalregulation）

?mRNA加工成熟水平上的調(diào)控?翻譯水平上的調(diào)控原核基因調(diào)控分類負轉(zhuǎn)錄調(diào)控負控誘導(dǎo)——阻遏蛋白與效應(yīng)物（誘導(dǎo)物）結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄；負控阻遏——阻遏蛋白與效應(yīng)物結(jié)合時，結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄。正轉(zhuǎn)錄調(diào)控正控誘導(dǎo)——效應(yīng)物分子（誘導(dǎo)物）的存在使激活蛋白處于活性狀態(tài)；正控阻遏——效應(yīng)物分子的存在使激活蛋白處于非活性狀態(tài)。大腸桿菌中的б因子（以б70為例）主要包括四個結(jié)構(gòu)域σ70（上）和σ54（下）因子識別并結(jié)合在所調(diào)控基因上游的不同區(qū)域7.2.1DiscoveryofOperon

1961年,F.Jacob&J.Monod提出,此后不斷完善。獲1965年諾貝爾生理學(xué)和醫(yī)學(xué)獎1940年，Monod發(fā)現(xiàn)：細菌在含葡萄糖和乳糖的培養(yǎng)基上生長時，細菌先利用葡萄糖，葡萄糖用完后，才利用乳糖；在糖源轉(zhuǎn)變期，細菌的生長會出現(xiàn)停頓。即產(chǎn)生“二次生長曲線”。FrancisJacob

JacquesMonod

7.2乳糖操縱子1951年，Monod與Jacob合作，發(fā)現(xiàn)兩對基因：Z基因：與合成β-半乳糖苷酶有關(guān)；I基因：決定細胞對誘導(dǎo)物的反應(yīng)。Szilard：I基因決定阻遏物的合成，當(dāng)阻遏物存在時，酶無法合成，只有有誘導(dǎo)物存在，才能去掉該阻遏物。Jacob：結(jié)構(gòu)基因旁有開關(guān)基因（操縱基因），阻遏物通過與開關(guān)基因的結(jié)合，控制結(jié)構(gòu)基因的表達。乙?；D(zhuǎn)移酶半乳糖苷透性酶?-半乳糖苷酶操作位點乳糖操縱子結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因操縱子是一種完整的具有特定功能的細菌基因表達和調(diào)節(jié)的單位，包括調(diào)節(jié)基因，啟動子，操縱位點，結(jié)構(gòu)基因，組成一個控制單元結(jié)構(gòu)基因：產(chǎn)生mRNA,合成蛋白質(zhì)操縱位點operator：阻遏蛋白結(jié)合位點調(diào)節(jié)基因：產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白（與操縱位點結(jié)合）

→結(jié)構(gòu)基因不轉(zhuǎn)錄

誘導(dǎo)物存在時，可與阻遏蛋白結(jié)合

→結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄ControlelementStructuralgenes7.2.2Lac體系受調(diào)控的證據(jù)：酶的誘導(dǎo)現(xiàn)象β-半乳糖苷酶分解底物的酶只有在底物存在時才出現(xiàn)！無乳糖時，幾個β-gal/cell加入乳糖時，105個再去掉乳糖，lacmRNA下降

乳糖能激發(fā)lacmRNA的合成

乳糖的誘導(dǎo)作用是由酶前體轉(zhuǎn)化而來，還是誘導(dǎo)新酶合成？培養(yǎng)基（35S-aa,無乳糖）→E.coli繁殖→培養(yǎng)基（無35S-aa,加入乳糖）→β-gal(無35S)gratuitousinducer

安慰誘導(dǎo)物

義務(wù)誘導(dǎo)物可誘導(dǎo)半乳糖苷酶產(chǎn)生，但不是其底物IPTG，異丙基半乳糖苷TMG，巰甲基半乳糖苷ONPG,O-硝基半乳糖苷在研究誘導(dǎo)作用時，很少使用乳糖7.2.3操縱子模型（負控誘導(dǎo)）1調(diào)控區(qū)結(jié)構(gòu)lacI,1040bp，獨立PiP,82bp，－82～＋1O,35bp，－7～＋28lacZYA阻遏狀態(tài)誘導(dǎo)狀態(tài)誘導(dǎo)物2.兩個矛盾生成lac誘導(dǎo)物乳糖代謝Allolctose異構(gòu)乳糖別乳糖細胞內(nèi)β-半乳糖苷酶來源?細胞內(nèi)透過酶來源?3大腸桿菌對乳糖的反應(yīng)E.coli+乳糖本底水平表達的透過酶進入細胞β-半乳糖苷酶異構(gòu)乳糖與阻遏蛋白結(jié)合

釋放操縱區(qū)，lac基因轉(zhuǎn)錄β-半乳糖苷酶透過酶β-半乳糖苷酶更多乳糖分子進入細胞葡萄糖+半乳糖得到碳源和能量一部分4阻遏蛋白的作用機制阻遏蛋白結(jié)構(gòu)38KD，4聚體，一個亞基結(jié)合一個IPTG分子lacI

組成型轉(zhuǎn)錄

Pi弱啟動子，

5－10個／cell具有二重性阻止轉(zhuǎn)錄（與lacO結(jié)合）

開始轉(zhuǎn)錄（與誘導(dǎo)物結(jié)合）

阻遏蛋白的結(jié)構(gòu)域N端1～59aa,頭部片段HTH，與操縱基因DNA的大溝結(jié)合；核心區(qū)：有6個

折疊，誘導(dǎo)物結(jié)合在兩個核心區(qū)之間的裂縫中；

C端為兩組亮氨酸拉鏈，形成四聚體。誘導(dǎo)物的結(jié)合可導(dǎo)致阻遏蛋白產(chǎn)生重要的構(gòu)象改變，兩個分子的誘導(dǎo)物和四聚體阻遏蛋白相結(jié)合就足以使誘導(dǎo)物釋放。阻遏蛋白對RNApol功能的影響阻遏蛋白和RNApol可同時與DNA結(jié)合RNApol與啟動子結(jié)合的平衡常數(shù)1.9X107有阻遏蛋白時,2.5X109結(jié)合著的RNApol不能轉(zhuǎn)錄.但加入誘導(dǎo)物后,釋放出阻遏蛋白,變?yōu)殚_放型啟動子復(fù)合物.阻遏蛋白實際上使RNApol貯存在啟動子上。+glucose-glucoseTime(hr)Unitsof-galactosidase+lactoseGlucoseadded7.2.4lacoperon的正調(diào)控

1葡萄糖對lac操縱子的影響實驗，在lac＋Glu培養(yǎng)基上E.coli只利用G，只有G耗盡時，才會利用lac葡萄糖抑制lacmRNA的轉(zhuǎn)錄：

可阻止誘導(dǎo)物引起的阻遏物失活效應(yīng)僅去掉阻遏物并不能啟動lac基因表達,有其它因素參與CAP,cataboliteactivatorprotein由crp編碼，代謝物激活蛋白CRP,catabolitereceptorproteinGlu↘，cAMP↗；Glu↗,cAMP↘cAMP的濃度受葡萄糖代謝的影響糖酵解途徑中位于葡萄糖-6-磷酸與甘油之間的某些代謝產(chǎn)物是腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制劑。腺苷酸環(huán)化酶基因和crp突變體不能合成lacmRNAcAMP-CAP復(fù)合物2CRP結(jié)合位點CRP為二聚體，45KD，被cAMP激活結(jié)合位點～22bpI-70~-50II-50~-40

3CRP的結(jié)合對DNA構(gòu)型的影響DNA彎曲彎曲點位于CRP結(jié)合位點二重對稱的中心彎曲使CRP能與啟動子上的RNApol接觸（1）CRP結(jié)合位點與轉(zhuǎn)錄起始點的位置CRP與轉(zhuǎn)錄起始點的距離，相距數(shù)個雙螺旋，結(jié)合位點在啟動子的上游.4

CRP對轉(zhuǎn)錄的影響（2）基因轉(zhuǎn)錄對cAMP—CRP系統(tǒng)存在依賴性

cAMP-CRP復(fù)合物的結(jié)合于啟動子上游，能使DNA雙螺旋發(fā)生彎曲，有利于形成開放型啟動子-RNA聚合酶復(fù)合物。CRP直接作用于RNApol

α亞基缺失RNApol

α

亞基的—C末端時，失去受CRP激活的能力7.2.5lacoperon的其它問題1.lacoperon的功能是在正負兩個調(diào)控體系的協(xié)調(diào)作用(coordinateregulation)下實現(xiàn)的。阻遏蛋白封閉轉(zhuǎn)錄時，CRP不發(fā)揮作用；如沒有CRP加強轉(zhuǎn)錄，即使阻遏蛋白從P上解聚仍無轉(zhuǎn)錄活性CRP組成型合成，所以cAMP－CRP復(fù)合物取決于cAMP含量腺苷酸環(huán)化酶位于細胞膜上，其活性與葡萄糖運輸?shù)拿赣嘘P(guān)，因此cAMP－CAP調(diào)控乳糖、半乳糖等糖類代謝有關(guān)的酶

2.A基因及其生理功能編碼β-半乳糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶，使半乳糖苷乙酰化。該酶不參與乳糖代謝！生理意義：在細胞中有許多能被半乳糖苷酶降解的半乳糖苷類物質(zhì)，其分解產(chǎn)物不能進一步代謝，積累，抑制細胞生長。半乳糖苷乙?；螅礋o毒.所以lacA雖不在乳糖降解中起作用，但可抑制有害物質(zhì)的積累3.lac基因產(chǎn)物數(shù)量，1：0.5：0.2不同酶的數(shù)量差異，是由于在翻譯水平上的調(diào)節(jié)。方式有二:核糖體脫離:多順反子的差別性翻譯

內(nèi)切酶作用:在lacmRNA分子內(nèi)部，a基因比z基因更易受內(nèi)切酶作用Summary7.3Trpoperon生物細胞中的氨基酸合成，也受操縱元的調(diào)節(jié)。細胞需要某種氨基酸時，其基因即表達，不需要時基因關(guān)閉，達到經(jīng)濟的原則。trpR,阻遏蛋白P，-40~+18O,-21~+1L,+1~+162結(jié)構(gòu)基因7.3.1基因組成7.3.2Trpoperon的阻遏系統(tǒng)1TrpR四聚體阻遏蛋白＋trp→有活性的阻遏物SNE299＋trpO→不轉(zhuǎn)錄2阻遏蛋白的結(jié)合位點

trpO-21~+1，反向重復(fù)序列trpP-40~+18活性阻遏物與trpO的結(jié)合與RNApol與啟動子的結(jié)合發(fā)生競爭3阻遏系統(tǒng)主管轉(zhuǎn)錄是否啟動，在缺乏TrpR時，mRNA起始合成，但不能自動延伸，一般在trpE之前終止轉(zhuǎn)錄

粗調(diào)開關(guān)7.3.3弱化作用

attenuation1弱化子，衰減子，α前導(dǎo)RNA，140bpα弱化子，衰減子，α序列分析發(fā)現(xiàn)，其中4個片段進行配對，形成不同的二級結(jié)構(gòu)Terminator

S3122前導(dǎo)肽14aa3轉(zhuǎn)錄弱化作用LackoftrpLackofaminoacyltRNA

Ribosomepauseattrpcodons,occludingsequence1Form2:3hairpinanti-terminator

TranscriptionintotrpEandbeyond

HightrpTrpisinsertedatthetrpcodonsTranslatetotheendofleadermessageRibosomeoccludesequence2Terminatetranscriptionat(3:4formterminator)弱化子對轉(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵空間結(jié)構(gòu)，10thand11thcodonsencodetrpresidues(rareAA)時間，核糖體停頓在2個Trp密碼子上時，4區(qū)未轉(zhuǎn)錄出來Trp濃度高時，4區(qū)轉(zhuǎn)錄之前核糖體到達2區(qū)。summaryNegative—repressibleoperon可以被最終合成產(chǎn)物所阻遏RPOleadingseq.EDCBAtrp+為什么需要阻遏體系？當(dāng)大量Trp存在時，阻遏系統(tǒng)起作用。阻遏物與之結(jié)合，阻止先導(dǎo)mRNA合成。

經(jīng)濟為什么需要弱化子系統(tǒng)？7.4其他操縱子7.4.1半乳糖操縱子大腸桿菌半乳糖操縱子（galactoseoperon）在大腸桿菌遺傳圖上位于17分鐘處，包括3個結(jié)構(gòu)基因：異構(gòu)酶（UDP-galactose-4-epimerase，galE），半乳糖-磷酸尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)移酶（galactosetransferase，galT），半乳糖激酶（galactosekinase，galK），使半乳糖變成葡萄糖-1-磷酸。半乳糖操縱子的調(diào)節(jié)基因是galR，位于遺傳圖上55分鐘處。與lac操縱子所不同的是，galR與galE、T、K及操縱區(qū)O等的距離都很遠，而galR產(chǎn)物對galO的作用與lacI-lacO的作用相同。在galR-和galOc突變體中，E、T、K基因得到永久性表達，gal操縱子的誘導(dǎo)物主要是半乳糖。gal操縱子有兩個特點：①它有兩個啟動子，其mRNA可從兩個不同的起始點開始轉(zhuǎn)錄；②它有兩個O區(qū)，一個在P區(qū)上游-67～-73，另一個在結(jié)構(gòu)基因galE內(nèi)部。1、cAMP-CRP對gal啟動子的作用有些細胞株能在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中高水平合成半乳糖代謝酶類（gal結(jié)構(gòu)基因高效表達），在另一類細胞株中，沒有葡萄糖，gal基因不表達。在gal操縱子P-O區(qū)有兩個相距僅為5bp的啟動子，gal操縱子可以從兩個啟動子分別起始基因轉(zhuǎn)錄，每個啟動子擁有各自的RNA聚合酶結(jié)合位點S1和S2。從S1起始的轉(zhuǎn)錄只有在無葡萄糖時才能順利進行，RNA聚合酶與S1的結(jié)合需要半乳糖、CRP和較高濃度的cAMP。當(dāng)腺苷環(huán)化酶突變（cya-）或cAMP受體蛋白突變（crp-）時，gal操縱子不能從S1起始轉(zhuǎn)錄。當(dāng)有cAMP-CRP時，轉(zhuǎn)錄從S1開始；當(dāng)無cAMP-CRP時，轉(zhuǎn)錄從S2開始。2、雙啟動子的生理功能為什么gal操縱子需要兩個轉(zhuǎn)錄起始位點呢？因為半乳糖不僅可以作為唯一碳源供細胞生長，而且與之相關(guān)的物質(zhì)——尿苷二磷酸半乳糖（UDPgal）是大腸桿菌細胞壁合成的前體，細胞必須隨時合成差向異構(gòu)酶，以保證尿苷二磷酸的供應(yīng)。在沒有外源半乳糖的情況下，細胞通過半乳糖差向異構(gòu)酶（galactoseepimerase，galE基因產(chǎn)物）的作用由UDP-葡萄糖合成UDPgal。如果只有S1一個啟動子，由于這個啟動子的活性依賴于cAMP-CRP，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時就不能合成異構(gòu)酶。如果S2是唯一的啟動子，那么，即使有葡萄糖存在，半乳糖也將使操縱子處于充分誘導(dǎo)狀態(tài)，能量被浪費。7.4.2阿拉伯糖操縱子araB、araA和araD基因參與阿拉伯糖的降解，它們是一個基因簇，簡寫為araBAD。araB基因編碼核酮糖激酶，araA編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶，araD編碼L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構(gòu)酶。araE和araF負責(zé)將阿拉伯糖運入細胞內(nèi)。它們位于遠離這個基因簇的地方，分別編碼一個膜蛋白和一個位于細胞壁與細胞膜之間的阿拉伯糖結(jié)合蛋白。啟動子區(qū)域，與araBAD相鄰兩個操縱區(qū)（O1，O2）調(diào)節(jié)基因araC。cAMP-CRP是正調(diào)節(jié)因子，AraC蛋白同時顯示正、負調(diào)節(jié)因子的功能。Ara操縱子的結(jié)構(gòu)ara操縱子上游調(diào)控區(qū)序列與功能分析ara操縱子是可誘導(dǎo)的。誘導(dǎo)物是阿拉伯糖，cAMP-CRP起正調(diào)控作用。AraC蛋白具有PBAD活性正、負調(diào)節(jié)因子的雙重功能。Pr是起阻遏作用的形式，可與類操縱區(qū)位點相結(jié)合，而Pi是起誘導(dǎo)作用的形式，它通過與PBAD啟動子結(jié)合進行調(diào)節(jié)。a.沒有AraC蛋白時，由Pc啟動子起始araC基因轉(zhuǎn)錄；b.葡萄糖水平較高時，AraC蛋白與操縱區(qū)O2以及araI上半?yún)^(qū)相結(jié)合，形成DNA回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，araBAD基因不表達；c.有阿拉伯糖但無葡萄糖存在時，AraC與阿拉伯糖相結(jié)合，變構(gòu)成為激活蛋白，與araO1和araI區(qū)相結(jié)合，在CRP-cAMP的共同作用下起始結(jié)構(gòu)基因表達。a.培養(yǎng)基含有葡萄糖，無阿拉伯糖時，cAMP-CRP沒有與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白處于Pr形式并與操縱區(qū)O2位點結(jié)合，RNA聚合酶不能與Pc結(jié)合，araC基因受到抑制，整個系統(tǒng)幾乎處于靜止?fàn)顟B(tài)。b.沒有葡萄糖糖，也沒有阿拉伯糖。因為沒有誘導(dǎo)物，盡管有cAMP-CRP與操縱區(qū)位點相結(jié)合，AraC蛋白仍以Pr形式為主，無法與操縱區(qū)O2位點相結(jié)合，無araBADmRNA轉(zhuǎn)錄。c.無葡萄糖，有阿拉伯糖。大量araC基因產(chǎn)物以Pi形式存在，并分別與操縱區(qū)O1

、I位點相結(jié)合，在cAMP-CRP的共同作用下，araC和araBAD基因大量表達，操縱子充分激活。7.4.3阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應(yīng)答當(dāng)細菌DNA遭到破壞時，細胞內(nèi)會啟動一個被稱為SOS的誘導(dǎo)型DNA修復(fù)系統(tǒng)。參與SOSDNA修復(fù)系統(tǒng)的基因都受LexA阻遏蛋白的抑制，SOS體系的誘導(dǎo)表達過程中LexA阻遏蛋白被移開。一般情況下，約有1000個RecA蛋白單體分散在每個細胞中。當(dāng)DNA嚴(yán)重受損時，單鏈DNA缺口數(shù)量增加，RecA與這些缺口處單鏈DNA相結(jié)合，被激活成為蛋白酶，將LexA蛋白切割成沒有阻遏和操縱區(qū)DNA結(jié)合活性的兩個片段，導(dǎo)致SOS體系（包括recA基因）高效表達，DNA得到修復(fù)。大腸桿菌中受LexA蛋白阻遏的SOSDNA損傷修復(fù)系統(tǒng)操縱子的表達調(diào)控模式7.4.4二組分調(diào)控系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最簡單的細胞信號系統(tǒng)稱為二組分系統(tǒng)（two-componentsystems），由二種不同的蛋白質(zhì)組成：即位于細胞質(zhì)膜上的傳感蛋白（sensorprotein）及位于細胞質(zhì)中的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein）。細菌中參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的二組分調(diào)控系統(tǒng)7.4.5多啟動子調(diào)控的操縱子1、rRNA操縱子rRNA操縱子（rrnE）有兩個啟動子P1和P2。其中，P1為強啟動子。當(dāng)細菌處于緊急狀態(tài)，細胞中ppGpp濃度增加，P1的作用被抑制。為維持細菌最低能量需求，由P2起始rrnE基因轉(zhuǎn)錄。魔斑核苷酸魔斑核苷酸為ppGpp或pppGpp，因其能在色譜上檢測出斑點而被稱為魔斑氨基酸缺乏時，空載tRNA進入A位點。A位點積聚的GTP進入另一反應(yīng)途徑：

GTP+ATP→pppGpp+AMP→ppGpp2、核糖體蛋白S1操縱子核糖體蛋白SI操縱子——rpsA有4個啟動子，P1、P2是強啟動子，平時主要依靠它們來啟動基因的表達，合成S1蛋白。P3、P4是弱啟動子，只有在緊急情況下，P1、P2啟動子受ppGpp的抑制，由P3、P4起始合成的S1蛋白維持了生命的最低需要。3、DnaQ蛋白操縱子DnaQ蛋白是DNA聚合酶全酶的亞基。其操縱子有兩個啟動子，P1為強啟動子，P2為弱啟動子。增殖速度慢時，在細胞中RNA聚合酶活性較低時，操縱子的轉(zhuǎn)錄由弱啟動子P2控制；而RNA聚合酶活性較高時，就開始利用強啟動子P1。7.5固氮基因調(diào)控氮是所有生物的基本組成成分，蛋白質(zhì)、核酸及許多小分子代謝產(chǎn)物都是含氮化合物；直接利用氮源的只有少數(shù)原核生物；

根瘤菌的固氮作用。7.5.1根瘤的產(chǎn)生根瘤菌在豆科植物根際的生長以及與寄主植物根毛幼嫩部位的接觸是感染發(fā)生的第一步。通常情況下，根瘤菌特定小種的寄主范圍都是很狹窄的，如Rhizobium

trifolii主要感染三葉草，R.phaseoli主要感染菜豆，R.Leguminosarum主要感染豌豆。7.5.2固氮酶N2+8H++32ATP→2NH3+H2+32ADP+32Pi固氮酶組分I和III由兩個5.0×104的α亞基和兩個6.0×104的β亞基組成，由nifD和nifK基因編碼。含有4個[4Fe-4S]連接橋和兩個鐵-鉬輔助因子（Fe