第4章 蛋白質(zhì)化學(xué)

蛋白質(zhì)化學(xué)第一節(jié)概述一、蛋白質(zhì)的概念二、蛋白質(zhì)的分類三、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能一、蛋白質(zhì)的概念1．重要性―蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)2．元素組成―蛋自質(zhì)是含氮元素恒定的生命物質(zhì)1．重要性―蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)早在100多年前，恩格斯就指出：“生命是蛋白體的存在方式”,“無論在什么地方，只要我們遇到生命，我們就發(fā)現(xiàn)生命是和某種蛋白質(zhì)相聯(lián)系的”。實(shí)踐證明，蛋白質(zhì)與生命現(xiàn)象是密切相關(guān)的，凡是有生命的地方，基本上都有蛋白質(zhì)在起作用。蛋白質(zhì)是生命的主要體現(xiàn)者。蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)含量最高的組分，酶、抗體、多肽激素、運(yùn)輸分子乃至細(xì)胞的自身骨架都是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，蛋白質(zhì)占許多生物體干重的45％一50％以上。蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)和功能上形式種類最多，也是最為活躍的一類分子，幾乎在一切生命過程中起著關(guān)鍵作用。2．元素組成―蛋自質(zhì)是含氮元素恒定的生命物質(zhì)蛋白質(zhì)的元素組成與糖、脂相比，都含有C、H、O，而蛋白質(zhì)還含有N等元素。從動(dòng)植物組織細(xì)胞中提取的各種蛋白質(zhì)經(jīng)分析得知，蛋白質(zhì)中的主要元素C、H、O、N的含量分別是50％一55％、6％一8％、20％一23％、15％一18%；其中N元素的含量在各種蛋白質(zhì)中很相近，平均為16%，故N為蛋白質(zhì)的特征性元素，即蛋白質(zhì)是一類含氮的生物大分子。除了上述主要元素，蛋白質(zhì)大多數(shù)還含有S(0一4%）、P(0.4％一0.9%）、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+等，個(gè)別的還含有碘。

由于蛋白質(zhì)中含16％的N元素，即每100g蛋白質(zhì)中約含有16g氮。因此，生物樣品中蛋白質(zhì)的含量約等于樣品含氮量×6.25(6.25被稱為蛋白質(zhì)系數(shù)或蛋白質(zhì)因數(shù)，即100/16）。二、蛋白質(zhì)的分類1．分類依據(jù)―蛋白質(zhì)不能按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類2．三種分類方法―按組成分類是常用的分類方法1．分類依據(jù)―蛋白質(zhì)不能按化學(xué)結(jié)構(gòu)分類蛋白質(zhì)分類的依據(jù)有幾個(gè)方面，包括生物來源、理化性質(zhì)、分子形狀、化學(xué)組成、化學(xué)結(jié)構(gòu)與功能等。其中，按照化學(xué)結(jié)構(gòu)來分類應(yīng)該是很理想的，因?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與其功能有密切的關(guān)系；然而迄今我們所知道的蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)尚不多，故這種方法尚不適用于蛋白質(zhì)的分類。2．三種分類方法―按組成分類是常用的分類方法（1）根據(jù)分子的形狀（2）根據(jù)溶解度（3）根據(jù)組成（1）根據(jù)分子的形狀可分為球狀蛋白（globularprotein）和纖維狀蛋白（fibrousprotein）。這是根據(jù)分子軸比（即分子長(zhǎng)度與直徑之比）來區(qū)分的。

球狀蛋白：分子形狀呈球狀，軸比小于10，甚至接近1:1。較易溶解，如血液中的血紅蛋白、而清球蛋白、豆類的球蛋白等。纖維狀蛋白：形狀似纖維，軸比大于10。不溶于水，如指甲、羽毛中的角蛋白和蠶絲中的絲蛋白等。（2）根據(jù)溶解度清蛋白（albumins）：又稱白蛋白，是溶于水的，如血清白蛋白、乳清白蛋白等。精蛋白（spermatins）：溶于水及酸性溶液，含堿性氨基酸多，呈堿性，如鮭精蛋白。組蛋白（histones）：溶于水及稀酸溶液，含堿性氨基酸較多，故呈堿性，它們常是細(xì)胞核染色質(zhì)組成成分。

球蛋白（albumins）：微溶于水而溶于稀的中性鹽溶液，如血清球蛋白、肌球蛋白和大豆球蛋白等。

谷蛋白（glutebins）：不溶于水、醇及中性鹽溶液，但溶于稀酸、稀堿，如麥蛋白。醇溶蛋白（prolamines）：不溶于水，溶于70%一80%乙醇，如玉米蛋白。硬蛋白（scleroproteins）：不溶于水、鹽、稀酸、稀堿溶液，如膠原蛋白、絲蛋白、毛發(fā)及蹄甲中的角蛋白和彈性蛋白等。（3）根據(jù)組成①單純蛋白質(zhì)②結(jié)合蛋白質(zhì)①單純蛋白質(zhì)僅由氨基酸組成的蛋白質(zhì)，水解后產(chǎn)物只有氨基酸。前述中的清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、組蛋白、硬蛋白都屬于單純蛋白質(zhì)。②結(jié)合蛋白質(zhì)除含有氨基酸外，還含有糖、脂肪、核酸、磷酸以及色素等非蛋白質(zhì)成分。故結(jié)合蛋白質(zhì)由兩部分組成：一部分含有各種氨基酸，為蛋白質(zhì)部分；另一部分為非蛋白質(zhì)部分，稱為輔基。主要的結(jié)合蛋白質(zhì)有以下幾類。

核蛋白（nucleoproteins）：由蛋白質(zhì)與核酸組成，在生命活動(dòng)過程中的作用極為重要，存在于一切細(xì)胞中。

色蛋白（chromoproteins）：由蛋白質(zhì)與含金屬的色素物質(zhì)結(jié)合而成，如含鐵的血紅蛋白、肌紅蛋白、細(xì)胞色素，含鎂的葉綠蛋白，含銅的血藍(lán)蛋白等。

糖蛋白（glycoproteins）：由蛋白質(zhì)與糖類物質(zhì)結(jié)合而成。糖類物質(zhì)常常是半乳糖、甘露糖、氨基己糖、葡萄糖醛酸等。如黏性蛋白、軟骨素蛋白等。糖蛋白幾乎存在于所有組織中，如在血液、骨骼、角膜、內(nèi)臟、黏膜等組織及生物膜中都存在大量的各類糖蛋白，并具有多種功能。

脂蛋白（lipoproteins）：由蛋白質(zhì)與脂類結(jié)合而成，主要存在于乳汁、血液、生物膜和細(xì)胞核中，如血漿脂蛋白、膜脂蛋白等。脂蛋白與脂質(zhì)代謝、運(yùn)輸?shù)裙δ苡嘘P(guān)。磷蛋白（phosphoproteins）：由蛋白質(zhì)與磷酸結(jié)合而成，如酪蛋白、卵黃蛋白等。三、蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能1．功能多樣―蛋白質(zhì)功能的多樣性2．功能復(fù)雜―蛋白質(zhì)功能的復(fù)雜性1．功能多樣―蛋白質(zhì)功能的多樣性（1）催化功能生物體的各種組成部分的自我更新是生命活動(dòng)的本質(zhì)，而構(gòu)成新陳代謝的所有化學(xué)反應(yīng)，幾乎都是在一類特殊的生物高分子―酶（enzyme）的催化下進(jìn)行的，目前已發(fā)現(xiàn)的酶基本上都是蛋白質(zhì)。（2）調(diào)節(jié)功能生物體的一切生物化學(xué)反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行，是由于有調(diào)節(jié)蛋白在起作用，調(diào)節(jié)蛋白包括激素（hormone）、受體（receptor）、毒蛋白（toxoprotein）等。（3）結(jié)構(gòu)功能蛋白質(zhì)是一切生物體的細(xì)胞和組織的主要組成成分，也是生物體形態(tài)結(jié)構(gòu)的物質(zhì)基礎(chǔ)。體表和機(jī)體構(gòu)架部分還具有保護(hù)、支持功能。1．功能多樣―蛋白質(zhì)功能的多樣性（4）運(yùn)輸功能生命活動(dòng)中所需要的許多小分子和離子是由蛋白質(zhì)來輸送和傳遞的。比如，O2的運(yùn)輸由紅細(xì)胞中的血紅蛋白來完成，脂質(zhì)的運(yùn)輸由載脂蛋白來完成，鐵離子由運(yùn)鐵蛋白在血液中運(yùn)輸?shù)取＃?）免疫功能生物機(jī)體產(chǎn)生的用以防御致病微生物或病毒的抗體（antibody），就是一種高度專一的免疫蛋白（immunoglohulin），它能識(shí)別外源性生命物質(zhì)并與之結(jié)合，起到防御作用，使機(jī)體免受傷害。（6）運(yùn)動(dòng)功能生物體的運(yùn)動(dòng)也由蛋白質(zhì)來完成。如動(dòng)物的肌肉主要成分就是蛋白質(zhì)，肌肉收縮和舒張是由肌動(dòng)蛋白（actin）和肌球蛋白（myosin）的相對(duì)運(yùn)動(dòng)來實(shí)現(xiàn)的。草履蟲、眼蟲的運(yùn)動(dòng)由纖毛和鞭毛完成，纖毛和鞭毛都是蛋白質(zhì)。1．功能多樣―蛋白質(zhì)功能的多樣性（7）儲(chǔ)藏功能乳液中的酪蛋白、蛋類中的卵清蛋白、植物種子中的醇溶蛋白等，它們有儲(chǔ)藏氨基酸的作用，以備機(jī)體及其胚胎或幼體生長(zhǎng)發(fā)育的需要。（8）生物膜的功能生物膜的通透性、信號(hào)傳遞、遺傳控制、生理識(shí)別、動(dòng)物記憶、思維等多方面的功能都是由蛋白質(zhì)參與完成的。2．功能復(fù)雜―蛋白質(zhì)功能的復(fù)雜性同一種蛋白質(zhì)，其功能也呈現(xiàn)出復(fù)雜性。如糖蛋白的細(xì)胞識(shí)別功能涉及糖蛋白及其相應(yīng)受體、糖基轉(zhuǎn)移酶及其底物或糖苷水解酶及其底物所參與的一系列生化過程。又如酶催化功能受許多因素的影響，并表現(xiàn)出競(jìng)爭(zhēng)性、可調(diào)節(jié)性等。有的酶具有幾種不同的催化功能，以適應(yīng)多變的內(nèi)外環(huán)境。第二節(jié)蛋白質(zhì)的基本單位―氨基酸一、蛋白質(zhì)的水解―產(chǎn)生氨基酸的基本手段二、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征三、氨基酸的分類四、氨基酸的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)的水解―產(chǎn)生氨基酸的基本手段1．酸水解2．堿水解3．蛋白酶水解1．酸水解蛋白質(zhì)在進(jìn)行酸水解時(shí)，通常以5-10倍的20%HCI煮沸回流16-24h，或加壓于120℃水解12h，可將蛋白質(zhì)水解成氨基酸（aminoacid）。用盆酸的優(yōu)點(diǎn)是可加熱蒸發(fā)除去HCI。也可用20%H2SO4水解，然后加Ba2+或Ca2+沉淀除去硫酸根。酸水解的優(yōu)點(diǎn)是水解徹底，水解的最終產(chǎn)物是L-氨基酸，沒有旋光異構(gòu)體產(chǎn)生；缺點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的色氨酸幾乎全部被破壞，而且與含醛基的化合物（如糖）作用生成一種黑色物質(zhì)，稱為腐黑質(zhì)(melanoidins)，因此水解液呈黑色，需進(jìn)行脫色處理。此外，含羥基的絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸也有部分被破壞。此法常用于蛋白質(zhì)的分析與制備。此法是氨基酸工業(yè)生產(chǎn)的主要方法之一，也可用于蛋白質(zhì)的分析。2．堿水解蛋白質(zhì)在進(jìn)行堿水解時(shí)，用6mol/LNaOH或4mol/LBa(OH)2煮沸6h即可完全水解得到氨基酸。此法的優(yōu)點(diǎn)是色氨酸不被破壞，水解液清亮，但缺點(diǎn)是水解產(chǎn)生的氨基酸發(fā)生旋光異構(gòu)作用，產(chǎn)物有D-型和L-型兩類氨基酸。D-型氨基酸不能被人體分解利用，因而營(yíng)養(yǎng)價(jià)值減半；此外，絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、胱氨酸等大部分被破壞，因此，堿水解法一般很少使用。3．蛋白酶水解蛋白質(zhì)在一些蛋白酶（protease）的作用下可發(fā)生水解。這種水解法的優(yōu)點(diǎn)是條件溫和，常溫（36-60℃）、常壓和pH值在2-8時(shí)，氨基酸完全不被破壞，也不發(fā)生旋光異構(gòu)現(xiàn)象；其缺點(diǎn)是水解不徹底，中間產(chǎn)物（短肽等）較多。

在蛋白質(zhì)的水解過程中，由于水解方法和條件的不同，可得到不同程度的降解物。二、氨基酸的結(jié)構(gòu)特征1．結(jié)構(gòu)特征―氨基酸是氨基取代羧酸2．常見氨基酸―蛋白質(zhì)由20種基本氨基酸構(gòu)成1．結(jié)構(gòu)特征―氨基酸是氨基取代羧酸氨基酸是含有氨基的竣酸，即梭酸中α-碳原子上一個(gè)氫原子被氨基取代而生成的化合其結(jié)構(gòu)通式為：式中，R表示化學(xué)基團(tuán)，因?yàn)樗鼈兂Ｌ幱诘鞍踪|(zhì)鏈狀分子的側(cè)鏈上，故又稱為側(cè)鏈基團(tuán)。R基不同就構(gòu)成不同的氨基酸。這些氨基酸的α-氨基和α-羧酸連在同一個(gè)碳原子上，統(tǒng)稱為α-氨基酸，這是氨基酸在結(jié)構(gòu)上的共同特點(diǎn)。

從結(jié)構(gòu)通式可以看出，除R為氫原子（即甘氨酸）外，所有α-氨基酸的α-碳原子都是不對(duì)稱碳原子，即手征性碳原子，它是α-氨基酸的不對(duì)稱中心。所以，第一，氨基酸都有旋光活性；第一，每種氨基酸都有D-型和L-型兩種立體異構(gòu)體（甘氨酸除外）。在這里構(gòu)型是以α-氨基在空間的排布來區(qū)分的。

2．常見氨基酸―蛋白質(zhì)由20種基本氨基酸構(gòu)成除此之外，還有幾種稀有氨基酸，也是構(gòu)成蛋白質(zhì)的組成成分，但含量少，而且是蛋白質(zhì)合成后形成的。重要的稀有氨基酸有以下幾種。羥脯氨酸（hydroxyproline,Hyp)：是脯氨酸經(jīng)過羥化反應(yīng)生成的。羥脯氨酸在明膠中含量較多，占14%，一般蛋白質(zhì)中含量較少。羥賴氨酸（hydroxylysine,Hyly)：由賴氨酸經(jīng)過羥化反應(yīng)生成，是動(dòng)物組織蛋白成分之一。胱氨酸（cystine,Cys）：由兩個(gè)半胱氨酸氧化后生成，在毛發(fā)、蹄角等蛋白質(zhì)中含量豐富。三、氨基酸的分類1．分類氨基酸的三種分類方法2．非蛋白質(zhì)氨基酸―非蛋白質(zhì)氨基酸也具有生物活性1．分類氨基酸的三種分類方法（1）根據(jù)酸堿性質(zhì)分為3類（2）根據(jù)R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為4類（3）根據(jù)R基團(tuán)的極性分成4類（1）根據(jù)酸堿性質(zhì)分為3類①酸性氨基酸有2種，即谷氨酸和天冬氨酸。它們含有一個(gè)氨基和兩個(gè)羧基。②堿性氨基酸有3種，即精氨酸、賴氨酸和組氨酸。它們含有一個(gè)羧基、兩個(gè)以上的氨基或亞氨基。③中性氨基酸有15種，是含一個(gè)氨基一個(gè)羧基的氨基酸，其中包括兩種酸性氨基酸產(chǎn)生的酰胺。（2）根據(jù)R基的化學(xué)結(jié)構(gòu)分為4類①芳香族氨基酸有3種，即苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。它們的R基含有芳香環(huán)。②雜環(huán)氨基酸只有1種，即組氨酸，其R基中含有咪唑基。③雜環(huán)亞氨基酸1種，即脯氨酸，其R基取代了氨基的一個(gè)氫而形成一個(gè)雜環(huán)，從而使脯氨酸中沒有自由氨基，而只含有個(gè)亞氨基。④脂肪族氨基酸共15種，與中性氨基酸的15種不完全一致。（3）根據(jù)R基團(tuán)的極性分成4類①極性帶正電荷的氨基酸實(shí)為3種堿性氨基酸，是在pH7時(shí)帶凈正電荷的氨基酸。②極性帶負(fù)電荷的氨基酸即兩種酸性氨基酸，在pH6-7時(shí)，帶凈負(fù)電荷。③極性不帶電氨基酸它們的R基中含有不解離的極性基團(tuán)，能與水形成氫鍵。共有6種或7種，包括含羥基的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；含酞胺基的天冬酞胺和谷氨酞胺；含琉基的半胱氨酸；甘氨酸的R基為氫，對(duì)強(qiáng)極性的氨基、羧基影響很小，其極性最弱，有時(shí)將它歸于非極性氨基酸類。④非極性氨基酸它們的R基中含有脂肪烴鏈或芳香環(huán)等，共有8種或9種，其中帶有脂肪烴鏈的有丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；含有芳香環(huán)的有苯丙氨酸和色氨酸；含硫的甲硫氨酸；還有一種亞氨基酸―脯氨酸。非極性氨基酸在水中的溶解度比極性氨基酸小。其中丙氨酸的疏水性最弱，它介于非極性氦基酸和極性不帶電氨基酸之間。2．非蛋白質(zhì)氨基酸―非蛋白質(zhì)氨基酸也具有生物活性除了構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種常見氨基酸外，還有存在于多種組織和細(xì)胞中的非蛋白質(zhì)氨基酸（約180種左右）。這些氨基酸大多是L-型氨基酸的衍生物，它們有β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸。在細(xì)菌中含有多種D-型氨基酸，如D-丙氨酸（細(xì)菌細(xì)胞壁組成）、D-胱氨酸（短桿菌肽D、放線菌素D）、D-亮氨酸（短桿菌肽D、多黏菌肽）、D-天冬氨酸（枯草菌肽A）和D-谷氨酸（細(xì)菌肽聚糖）等。四、氨基酸的性質(zhì)1．兩性性質(zhì)―氨基酸是弱兩性電解質(zhì)2．紫外吸收―芳香族氨基酸具有特征紫外吸收3．化學(xué)性質(zhì)―氨基酸的一些特殊反應(yīng)用于定性與定量1．兩性性質(zhì)―氨基酸是弱兩性電解質(zhì)氨基酸的同一分子中含有堿性的氨基（一NH2）和酸性的羧基（一COOH)，因此，它是兩性電解質(zhì)（ampholytes）。它的一COOH可解離釋放H+，其自身變?yōu)橐籆OO－，釋放出的H+與一NH2結(jié)合，使一NH2基變成一NH3+，此時(shí)氨基酸成為同一分子上帶有正、負(fù)兩種電荷的偶極離子或稱兼性離子，這也是氨基酸在水中或結(jié)晶態(tài)時(shí)的主要存在形式。氨基酸的氨基和羧基的解離情況以及氨基酸本身帶電情況取決于它所處環(huán)境的酸堿性。當(dāng)它處于酸性環(huán)境時(shí)，由于梭基結(jié)合質(zhì)子而使氨基酸帶正電荷；當(dāng)它處于堿性環(huán)境時(shí)，由于氨基的解離而使氨基酸帶負(fù)電荷；當(dāng)它處于某一pH值時(shí)，氨基酸所帶正電荷和負(fù)電荷相等，即凈電荷為零，此時(shí)的pH值稱為氨基酸的等電點(diǎn)（isoelectricpoint），用pI表示。氨基酸的兩性解離式為：

由于氨基酸是兩性電解質(zhì)，在水溶液中，它既可被酸滴定，又可被堿滴定。通過對(duì)氨基酸進(jìn)行的酸堿滴定，可以證明氨基酸的兩性解離性質(zhì)，并可計(jì)算出各種解離基團(tuán)的解離常數(shù)和等電點(diǎn)。例如甘氨酸的酸堿滴定，圖4-1所示為甘氨酸的酸堿滴定曲線，左段是用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸滴定得到的曲線，右段是用標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定得到的曲線。根據(jù)氨基酸的滴定，可以求出各種解離基團(tuán)的解離常數(shù)（pK’）。計(jì)算公式為：2．紫外吸收―芳香族氨基酸具有特征紫外吸收構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，但在紫外光區(qū)，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸具有光吸收能力。苯丙氨酸的最大吸收在259nm處，酪氨酸的最大吸收在278nm處，色氨酸的最大吸收在279nm處。蛋白質(zhì)由于含有這些芳香族氨基酸，所以也有紫外吸收能力，一般采用紫外分光光度計(jì)在280nm波長(zhǎng)處測(cè)最大光吸收的方法來測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。3．化學(xué)性質(zhì)―氨基酸的一些特殊反應(yīng)用于定性與定量（1）由α-氨基參與的反應(yīng)（2）由α-羧基參與的反應(yīng)（3）由α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)（4）側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)（1）由α-氨基參與的反應(yīng)①與亞硝酸反應(yīng)氨基酸的氨基和其他伯胺一樣，在室溫下與亞硝酸作用生成氮?dú)狻?/p>

上述反應(yīng)中所產(chǎn)生的氮?dú)猓∟2）只有一半來自氨基酸的氨基氮，另一半來自亞硝酸。在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定生成的氮?dú)怏w積，即可計(jì)算出氨基酸的量，這就是VanSlyke（范斯萊克）法測(cè)定氨基酸氮的基礎(chǔ)。在生產(chǎn)上，可用此法來進(jìn)行氨基酸定量和蛋白質(zhì)水解程度的測(cè)定。因?yàn)樵谒膺^程中，蛋白質(zhì)的總氮量是不變的，而氨基氮含量卻不斷上升，用氨基氮與總蛋白氮的比例可表示蛋白質(zhì)的水解程度。（1）由α-氨基參與的反應(yīng)②與甲醛反應(yīng)氨基酸在溶液中有如下平衡：

氨基酸分子在溶液中主要是兩性離子。氨基酸的酸性基團(tuán)竣基與堿性基團(tuán)氨基相距很近，當(dāng)用堿滴定竣基時(shí)，由于氨基的影響，致使氨基酸這種兩性離子即使達(dá)到滴定終點(diǎn)也不會(huì)完全分解，因而不能準(zhǔn)確測(cè)定。如果用中性甲醛與氨基酸的氨基化合，將氨基保護(hù)起來使其不生成兩性離子，然后再用堿來滴定氨基酸中的竣基，就能測(cè)定出氨基酸的量。相關(guān)反應(yīng)為：（1）由α-氨基參與的反應(yīng)由于氨基酸的氨基與甲醛的反應(yīng)，使-NH3+解離釋放出H+，從而使溶液酸性增加，據(jù)此就可以酚酞作指示劑用NaOH溶液來滴定。這是生物化工產(chǎn)品、食品和發(fā)酵物等產(chǎn)品中氨基氮的測(cè)定原理和方法，稱為甲醛滴定法（formoltitration）。（1）由α-氨基參與的反應(yīng)③與2,4-二硝基氟苯的反應(yīng)在弱堿溶液中，氨基酸的α-氨基很容易與2,4-二硝基氟苯（DNFB）作用，生成穩(wěn)定的黃色2,4-二硝基苯氨基酸（簡(jiǎn)寫為DNP-氨基酸）。該反應(yīng)可用于鑒定氨基酸，也用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)測(cè)定。因?yàn)榇朔磻?yīng)首先被F.Sanger用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定，所以現(xiàn)在也常將DNFB稱為Sanger試劑。

（1）由α-氨基參與的反應(yīng)④?；磻?yīng)氨基酸與酰氯或酸酐作用時(shí)，氨基中有一個(gè)或兩個(gè)氫原子被?；〈货；?。即：

其中，氨基酸與苯一甲酸配反應(yīng)生成的苯一甲酰氨基酸在人工合成多膚過程中是很有用的保護(hù)α-氨基的中間體。有關(guān)反應(yīng)為：

芐氧酰氯與氨基酸作用生成氨基酸取代的芐氧甲酰氨基酸，這個(gè)反應(yīng)也在人工合成多肚中用于保護(hù)氨基。反應(yīng)如下：（1）由α-氨基參與的反應(yīng)⑤成鹽反應(yīng)氨基酸的氨基與HCI作用產(chǎn)生氨基酸鹽化合物。用HCI水解蛋白質(zhì)制得的氨基酸就是氨基酸鹽酸鹽，反應(yīng)如下：

（1）由α-氨基參與的反應(yīng)⑥形成席夫堿反應(yīng)氨基酸的α-氨基能與醛類化合物反應(yīng)生成弱堿，即所謂席夫堿(Schiff‘sbase)，其反應(yīng)如下：

這是引起食品褐變的反應(yīng)之一。食品中的氨基酸與葡萄糖醛基發(fā)生所謂羰氨反應(yīng)，生成席夫堿，進(jìn)一步轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)，這是非酶促褐變的一種機(jī)制。（1）由α-氨基參與的反應(yīng)⑦脫氨基反應(yīng)氨基酸在生物體內(nèi)經(jīng)酶催化可脫去α-氨基而轉(zhuǎn)變成α-酮酸。即：（2）由α-羧基參與的反應(yīng)①成鹽反應(yīng)氨基酸的α-羧基可以和堿作用生成鹽。例如：如果與重金屬離子形成的鹽則不溶于水。（2）由α-羧基參與的反應(yīng)②成酯反應(yīng)在干燥氯化氫氣體存在下，氨基酸可與醇酯化形成相應(yīng)的酯。例如：

羧基被酷化后，可增強(qiáng)氨基的化學(xué)活性，使氨基更易發(fā)生?；磻?yīng)，生成酰胺或酰肼。所以在蛋白質(zhì)人工合成中可通過成酯反應(yīng)將氨基酸活化。成酯反應(yīng)也可用于氨基酸的分離純化，因?yàn)楦鞣N氨基酸與醇所成的酯的沸點(diǎn)不同，故可進(jìn)行分級(jí)蒸餾而分離。另外，在曲酒釀造中，不同氨基酸所生成的酯具有不同芳香味。（2）由α-羧基參與的反應(yīng)③?；磻?yīng)氨基酸羧基中的羥基可以被鹵素取代，所生成的化合物稱為酰鹵。由于氨基酸中氨基與羧基相距很近，難于直接形成酰鹵，所以常先用一種?；瘎ㄈ缏纫阴＃被Ｗo(hù)起來，然后再用另一種?；瘎ㄈ鏟Cl5、PCl3等）使羧基酰化：

該反應(yīng)可使氨基酸的羧基活化，使之易與另一氨基酸的氨基結(jié)合，在肽的合成中常用到。（2）由α-羧基參與的反應(yīng)④脫竣基反應(yīng)生物體內(nèi)的氨基酸經(jīng)脫竣酶作用放出CO2，并產(chǎn)生相應(yīng)的胺。即：生物體內(nèi)的胺主要由氨基酸脫羧產(chǎn)生，具有一定的生理效能。（2）由α-羧基參與的反應(yīng)⑤疊氮反應(yīng)氨基酸可以通過?；王セ葘⒆杂砂被嶙?yōu)轷；被峒柞?，然后與聯(lián)氨和HNO2作用變成疊氮化合物（反應(yīng)如下）:

此反應(yīng)能使氨基酸的羧基活化，在人工合成膚的過程中也是常用的。（3）由α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)①與茚三酮（ninhydrin）的反應(yīng)。一氨基酸與水合茚三酮溶液一起加熱，經(jīng)過氧化脫氨、脫羧作用，生成藍(lán)紫色物質(zhì)。其反應(yīng)如下：（3）由α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)（3）由α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)脯氨酸和羧脯氨酸與茚三酮反應(yīng)不釋放NH3而直接生成黃色物質(zhì)。其他所有α-氨基酸與茚三酮反應(yīng)均產(chǎn)生藍(lán)紫色物質(zhì)。此反應(yīng)非常靈敏，0.5μg氨基酸就能顯色。根據(jù)藍(lán)紫色的深淺，在570nm處進(jìn)行比色，就可以測(cè)定樣品中氨基酸的含量。采用紙色譜、離子交換色譜和電泳等技術(shù)分離氨基酸時(shí)，常用茚三酮溶液作顯色劑，以定性和定量測(cè)定氨基酸。（3）由α-氨基和α-羧基共同參加的反應(yīng)②成膚反應(yīng)一個(gè)氨基酸的氨基與另一個(gè)氨基酸的羧基可以縮合成肽，形成的鍵為酰胺鍵。例如：

多個(gè)氨基酸可按此反應(yīng)方式生成長(zhǎng)鏈狀的肽化合物。（4）側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)①巰基及二硫鍵巰基還原性強(qiáng)，很活潑，可與節(jié)氯、碘乙酰胺等結(jié)合，從而使巰基到保護(hù)而不被破壞，在肽合成中常用到。例如：兩個(gè)-SH通過氧化可失去兩個(gè)氫原子而形成-S-S-，被稱為二硫鍵。例如：兩個(gè)半胱氨酸通過氧化而形成胱氨酸。相反，二硫鍵（-S-S-）也可通過還原作用形成兩個(gè)-SH，如以巰基乙醇作還原劑。所以，-SH和-S-S-組成一個(gè)氧化還原體系。（4）側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)②羥基羥基可與酸生成酯，如絲氨酸或蘇氨酸與乙酸、磷酸反應(yīng)，生成相應(yīng)的酯。磷蛋白中磷酸通常都是與這兩種氨基酸的側(cè)鏈羥基縮合生成磷酸酯。

（4）側(cè)鏈R基參加的反應(yīng)第三節(jié)肽一、肽的概念二、生物活性肽一、肽的概念1．結(jié)構(gòu)―肽由氨基酸構(gòu)成2．肽與氨基酸的區(qū)別―肽可利用其離子化程度加以鑒別

1．結(jié)構(gòu)―肽由氨基酸構(gòu)成氨基酸通過肽鍵連接形成的鏈狀化合物就稱為膚（peptide）。肽可由氨基酸縮合形成，也可由蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生，另外還有存在于生物體內(nèi)的天然活性肽。

肽鏈中氨基酸間的連接是通過肽鍵（peptidebond）。肽鍵是由一個(gè)氨基酸的。一氨基與另一個(gè)氨基酸的α-羧基縮合失水而形成的酰胺鍵。反應(yīng)過程可表示為：

1．結(jié)構(gòu)―肽由氨基酸構(gòu)成肽鍵這種酰胺鍵和一般酰胺鍵一樣，由于酰胺氮上的孤對(duì)電子與相鄰羧基之間的共振相互作用，從而使C-N鍵具有部分雙鍵的性質(zhì)，使-CO-具有部分單鍵的性質(zhì)。肽鍵的共振結(jié)構(gòu)形式為：

由于肽鍵具有雙鍵性質(zhì)，因而不能沿C-N軸自由轉(zhuǎn)動(dòng)。O-C-N-H4個(gè)原子處于同一個(gè)平面內(nèi)，即：氧和氫分別在C-N軸的兩邊。肽鍵中C-N鍵長(zhǎng)為0.132nm，介于普通C-N單鍵（0.149nm）和C-N雙鍵（0.127nm）之間。因此膚鍵中的C-N鍵比較牢固。雖然肽鍵中的C-N鍵不能自由旋轉(zhuǎn)，但碳基碳原子和α-碳原子之間以及氨基氮原子和。一碳原子之間的鍵是一般的單鍵，可以旋轉(zhuǎn)。2．肽與氨基酸的區(qū)別―肽可利用其離子化程度加以鑒別肽與氨基酸的相同之處在于都含有α-COOH、α-NH2；不同之處在于膚還含有側(cè)鏈R基上的可解離基團(tuán)，且肽的可解離基團(tuán)主要在側(cè)鏈上。

肽鏈中α-COOH與α-NH2間的間隔距離一般比氨基酸大，因此它們之間的靜電引力較弱，可離子化程度較低。不同肽的大小也可利用它的離子化程度高低來加以鑒別，長(zhǎng)的肽鏈的離子化程度比短的肽鏈的離子化程度低。即長(zhǎng)肽鏈完全質(zhì)子化所需pH值比短肽鏈低。肽中的N-末端的α-氨基的pK’值要比游離氨基酸的小一些，而C-末端的。一竣基的pK’值比游離氨基酸的大一些。側(cè)鏈R基的pK’值在兩者之間，差別不大。二、生物活性肽1．谷胱甘肽―參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的重要物質(zhì)2．神經(jīng)肽―神經(jīng)肽與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)3．抗菌肽―細(xì)菌的一種防御武器1．谷胱甘肽―參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)的重要物質(zhì)谷胱甘肽（glutahione）是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成的三肽，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物細(xì)胞中。其結(jié)構(gòu)組成與大多數(shù)肽類不同，第一是谷氨酸的γ-羧基參與反應(yīng)，形成關(guān)肽鍵；第二是谷胱甘肽的側(cè)鏈中含有巰基。由于側(cè)鏈-SH的存在，可由還原型（GSH）脫氫氧化成氧化型（GSSG），即：這在體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)中起重要作用。-SH在體內(nèi)可起保護(hù)作用，保護(hù)含巰基的蛋白質(zhì)，尤其是保護(hù)以-SH為活性基團(tuán)的酶的活性，如臨床上常用它作為治療肝病的藥物。谷胱甘肽還能在氨基酸運(yùn)輸中起載體作用。2．神經(jīng)肽―神經(jīng)肽與神經(jīng)體液調(diào)節(jié)神經(jīng)肽（nervonicpeptide）是首先從腦組織中分離出來并主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)（其他組織也有分布）的一類活性肽。重要的包括腦啡肽、內(nèi)啡肽、強(qiáng)啡肽等一系列腦肽和P-物質(zhì)。因?yàn)檫@些肽類都與痛覺有關(guān)，且具有嗎啡（morphine）一樣的鎮(zhèn)痛作用，所以就把它們稱作腦內(nèi)產(chǎn)生的嗎啡樣肽（腦啡肽，enkephalin）或內(nèi)源性嗎啡樣肽（內(nèi)啡肽，endophin）。3．抗菌肽―細(xì)菌的一種防御武器抗菌肽是一種抗生素（antibiotic），是一類抑制細(xì)菌和其他微生物生長(zhǎng)或繁殖的物質(zhì)，對(duì)傳染性疾病的治療有重要意義?？咕氖怯商囟ㄎ⑸锂a(chǎn)生的，并含有一些通常不在蛋白質(zhì)或肽類中存在的氨基酸，或含有異常的酰胺結(jié)合方式。該類物質(zhì)中最常見的是青霉素(Penicillin)，青霉素的主體結(jié)構(gòu)可以看作是由半胱氨酸和纈氨酸結(jié)合成的二肽衍生物，不過這種結(jié)合為非肽鍵連接。青霉素即氨基酸的二肽衍生物，其側(cè)鏈R基不同，即為不同的青霉素。其結(jié)構(gòu)通式為：3．抗菌肽―細(xì)菌的一種防御武器如果R為苯甲基，即為芐青霉素。青霉素主要破壞細(xì)菌細(xì)胞壁糖肽的合成，引起溶菌。另外，短桿菌肽S(gramicidinS）和短桿菌酪肽（tyrocidine）都是環(huán)狀10肽，分子中含有兩個(gè)D-苯丙氨酸殘基。這些環(huán)狀肽主要作用于革蘭陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜。放線菌素（antinomycin）的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，它有一個(gè)染料基以酰胺的方式分別連接在兩個(gè)5肽的末端氨基處。5肽的末端羧基形成大的內(nèi)酷環(huán)。放線菌素起抗菌和抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，也能抑制細(xì)胞分裂，常被用作RNA合成抑制劑。第四節(jié)蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)一、蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性一、蛋白質(zhì)的共價(jià)結(jié)構(gòu)1．一級(jí)結(jié)構(gòu)概念―一級(jí)結(jié)構(gòu)特指氨基酸的順序2．一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定―氨基酸序列的自動(dòng)程序測(cè)定1．一級(jí)結(jié)構(gòu)概念―一級(jí)結(jié)構(gòu)特指氨基酸的順序（1）蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)曾經(jīng)將蛋白質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)視為一級(jí)結(jié)構(gòu)（PrimaryStructure),包括：①多肽鏈數(shù)目；②每條鏈中氨基酸的數(shù)目、種類及排列順序；③鏈間或鏈內(nèi)鍵的位置和數(shù)目。1969年，理論和應(yīng)用化學(xué)國(guó)際協(xié)會(huì)（IUPAC）為了對(duì)化學(xué)結(jié)構(gòu)和一級(jí)結(jié)構(gòu)加以區(qū)別，特規(guī)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)特指肽鏈中的氨基酸順序。（2）維持一級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵維持一級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵為共價(jià)鍵，主要為肽鍵。所以蛋白質(zhì)分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)稱為共價(jià)結(jié)構(gòu)。（3）一級(jí)結(jié)構(gòu)的書寫方式從N-末端到C-末端，用氨基酸的3字母縮寫符號(hào)或單字母符號(hào)連續(xù)排列。若用3字母符號(hào)，每個(gè)氨基酸之間用圓點(diǎn)隔開，用單字母符號(hào)表示則不用圓點(diǎn)。2．一級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定―氨基酸序列的自動(dòng)程序測(cè)定（1）肽鏈末端分析（2）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離（3）肽鏈的部分水解和肽段的分離（4）肽段的氨基酸序列測(cè)定（5）肽段在多肽鏈中次序的推斷（1）肽鏈末端分析①N-末端測(cè)定②C-末端測(cè)定①N-末端測(cè)定a.DNFB法（Sanger法）由于氨基酸的α-NH2可與鹵素化合物發(fā)生取代反應(yīng)，肽鏈末端的α-NH2也可與二硝基氟苯（DNFB）反應(yīng)，生成二硝基苯衍生物，即DNP-肽鏈。由于新生成的DNP-肽鏈中苯核與氨基之間的鍵比肽鍵穩(wěn)定，不易被酸水解，因此DNP-肽鏈經(jīng)酸水解后，得到一個(gè)DNP-氨基酸和其余所有游離氨基酸的混合液。相關(guān)反應(yīng)為：

DNP-氨基酸為黃色，可用乙醚抽提，然后用紙色譜、薄層色譜或高效液相色譜(HPLC）進(jìn)行分離鑒定和定量測(cè)定，即可知道肽鏈的N-末端是何種氨基酸。F.Sanger首先用此法測(cè)出了牛胰島素分子的N-末端。

①N-末端測(cè)定b.苯異硫腈法（Edman法）肽鏈的末端氨基也能與苯異硫腈（PITC）作用，生成苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-肽鏈）。在溫和酸性條件下，末端氨基酸環(huán)化并釋放出來，即苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸），留下一條完整的、缺少一個(gè)氨基酸殘基的肽鏈。反應(yīng)如下：PTH一氨基酸用乙酸乙酯抽提后，可用紙色譜或薄層色譜鑒定。對(duì)抽提后剩余的肽鏈可多次重復(fù)上迷降解方法，每次從肽鏈的N-末端依次移去一個(gè)氨基酸殘基，最終測(cè)出全部肽鏈或肽段的氨基酸順序。此法目前采用較多。①N-末端測(cè)定c．二甲基氨基萘磺酰氯法（DNS法）二甲基氨基萘磺酰氯簡(jiǎn)稱丹磺酰氯（DNS-Cl）。DNS法的原理與DNFB法相同，只是用DNS代替DNFB試劑。由于丹磺?；哂袕?qiáng)烈的熒光，此法的靈敏度比DNS法高100倍，并且水解后的DNS-氨基酸不需要抽提，可直接通過紙電泳或薄層色譜進(jìn)行鑒定，還可用熒光計(jì)檢測(cè)。反應(yīng)如下：

①N-末端測(cè)定d．氨肽酶法氨肽酶是一類肽鏈外切酶（exopeptidases），它們能從多肽鏈的N-末端逐個(gè)地向內(nèi)切。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和殘基釋放量繪制動(dòng)力學(xué)曲線，就能知道該蛋白質(zhì)的N-末端殘基順序。②C-末端測(cè)定a．肼解法這是測(cè)定C-末端最常用的方法。多肽與肼在無水條件下加熱可以斷裂所有的肽鍵，除C-末端氨基酸外，其他氨基酸都轉(zhuǎn)變成相應(yīng)的酰肼化合物。脫解下來的C-末端氨基酸通過DNFB法或DNS法以及色譜技術(shù)可以進(jìn)行鑒定。脫解法的反應(yīng)如下：此法的缺點(diǎn)是：肼解中天冬酰胺、谷氨酰胺和半胱氨酸等被破壞而不易測(cè)出，精氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸，致使C-末端由這幾種氨基酸組成的肽鏈分析不夠準(zhǔn)確。b．羧肽酶法羧肽酶是一種專門水解并釋放肽鏈C-末端氨基酸的蛋白水解酶。被釋放的氨基酸數(shù)目與種類隨反應(yīng)時(shí)間而變化。目前常用的羧肽酸有A、B、C、Y等幾種。

將多肽在pH8.0、30℃下與羧肽酶一起保溫，按一定時(shí)間間隔取樣分析，用色譜法測(cè)定釋放出來的氨基酸，根據(jù)釋放的氨基酸量（物質(zhì)的量／mol）與反應(yīng)時(shí)間的關(guān)系，就可以知道C-末端氨基酸的排列順序。如圖4-2，可推測(cè)其C-末端順序?yàn)椋?Leu·Glu·Phe·COOH。圖4-2羧肽酶A作用于腎上腺皮質(zhì)激素氨基酸的釋放速度（2）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離如果蛋白質(zhì)分子含有幾條肽鏈，就應(yīng)設(shè)法把這些肽鏈分開，測(cè)定每條肽鏈的氨基酸序列。如果幾條肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^非共價(jià)鍵連接，則可用酸、堿、高濃度的鹽或其他變性劑（如8mol/L脲、6mol/L鹽酸胍）處理，將肽鏈分開；如果幾條肽鏈?zhǔn)峭ㄟ^共價(jià)鍵（二硫鍵）交聯(lián)，或者雖然蛋白質(zhì)分子只由一條肽鏈構(gòu)成，但存在鏈內(nèi)二硫鍵，則必須先將二硫鍵打開。通常采用氧化還原法，即用過量的β-巰基乙醇處理，然后用碘乙酸保護(hù)還原生成的半胱氨酸的琉基，以防它重新被氧化。涉及反應(yīng)如下：（2）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離也可以用發(fā)煙甲酸處理，將二硫鍵氧化成磺酸基而使鏈分開。即：目前較好的方法是用二硫蘇糖醇（dithiothreitol）或二硫赤蘚糖醇（dithioerythritol）還原二硫鍵，本身生成環(huán)化物，而使還原性巰基穩(wěn)定，反應(yīng)如下：（2）二硫鍵的拆開和肽鏈的分離二硫鍵拆開后形成的單個(gè)肽鏈，可用紙色譜、離子交換色譜或電泳等方法進(jìn)行分離。（3）肽鏈的部分水解和肽段的分離由于序列分析一次只能連續(xù)降解分析幾十個(gè)氨基酸殘基，而天然蛋白質(zhì)分子至少有100個(gè)以上的殘基，因此必須先將蛋白質(zhì)裂解成小肽，然后分離并測(cè)定肽段（Peptidefragment）的氨基酸序列。所以經(jīng)分離提純并打開二硫鍵的多肽鏈選用專性強(qiáng)的蛋白水解酶或化學(xué)試劑進(jìn)行有控制的裂解，將肽鏈打斷成些片段。對(duì)肽鏈的部分水解條件的基本要求是：選擇性強(qiáng)，裂解點(diǎn)少，反應(yīng)產(chǎn)率高?；痉椒ㄓ谢瘜W(xué)裂解法和酶解法。化學(xué)裂解法最常用的是嗅化氰裂解和酸水解，酶解法最常用的是胰蛋白酶水解。（3）肽鏈的部分水解和肽段的分離①CNBr裂解CNBr能專一性地切斷肽鏈中甲硫氨酸羧基端的肽鍵。此法專一性強(qiáng)，在肽鏈上切點(diǎn)少且產(chǎn)率高（可達(dá)85%）。蛋白質(zhì)中一般含甲硫氨酸很少，故可獲得較大的片段。產(chǎn)物的N-末端為甲硫氨酸（原來肽鏈的N-末端片段除外）。②部分酸水解此法主要用于測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成，主要采用盆酸進(jìn)行限時(shí)控溫水解。根據(jù)鹽酸濃度不同分為兩種情形：一是稀酸水解：二是濃酸水解。在稀酸條件下，肽鏈中天冬氨酸的羧基端容易斷裂；在濃酸條件下，含羥基氨基酸的氨基端肽鍵容易斷裂。酸水解中有少數(shù)氨基酸遭到部分破壞，且破壞程度與保溫時(shí)間成線性關(guān)系，所以酸水解法常常僅用于小肽的分析。（3）肽鏈的部分水解和肽段的分離③酶水解酶水解是更常用的蛋白質(zhì)部分水解方法。蛋白質(zhì)水解酶對(duì)肽鍵的水解率很高，且不同酶作用位點(diǎn)不同，因此可根據(jù)需要選擇不同的蛋白酶進(jìn)行肽鏈的部分水解。最常用的蛋白水解酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等內(nèi)切酶。胰蛋白酶：主要作用于肽鏈中堿性氨基酸羧基端肽鍵。

胃蛋白酶：專一性低，主要作用于酸性氨基酸及芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。凝乳蛋白酶：作用于芳香族氨基酸及一些有大的非極性側(cè)鏈的氨基酸的羧基端肽鍵。彈性蛋白酶：作用于脂肪族氨基酸的羧基端肽鍵。（4）肽段的氨基酸序列測(cè)定主要采用Edman降解法、酶解法等。酶解法的主要程序?yàn)椋菏紫壤靡环N酶水解產(chǎn)生一個(gè)或兩個(gè)可知末端特征的片段；再用另一種酶作用產(chǎn)生另一組片段；將后一組片段進(jìn)行色譜分離并進(jìn)行末端測(cè)定；最后進(jìn)行片段重疊分析，確定氨基酸序列。（5）肽段在多肽鏈中次序的推斷采用膚段重疊法進(jìn)行對(duì)照推斷。上述蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的方法稱為重疊法。這是F.Sanger第一個(gè)進(jìn)行蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定時(shí)建立的。Sanger小組用此方法花了將近10年測(cè)定了第一個(gè)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)(1955)，他們測(cè)定出牛胰島素（insulin）的結(jié)構(gòu)（圖4-3）。圖4-3牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)二、蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)1．概念―蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)系非共價(jià)結(jié)構(gòu)2．二級(jí)結(jié)構(gòu)―肽鏈的螺旋折疊3．三級(jí)結(jié)構(gòu)―肽鏈非幾何形的進(jìn)一步折疊4．四級(jí)結(jié)構(gòu)―亞基間的相互關(guān)系

1．概念―蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)系非共價(jià)結(jié)構(gòu)（1）含義（2）維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵（3）蛋白質(zhì)分子中膚鏈的空間結(jié)構(gòu)原則（1）含義二級(jí)結(jié)構(gòu)（secondarystructure）指的是多肽鏈借助氫鍵排列成沿一個(gè)方向具有周期性結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。如α-螺旋、浮折疊片等。二級(jí)結(jié)構(gòu)不涉及氨基酸殘基的側(cè)鏈構(gòu)象。三級(jí)結(jié)構(gòu)（tertiarystructure）是指多肽鏈借助各種次級(jí)鍵盤繞成特定的不規(guī)則的球狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象。四級(jí)結(jié)構(gòu)（quaternarystructure）是指寡聚蛋白質(zhì)中各亞基之間排布上的相互關(guān)系或結(jié)合方式。（2）維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵①氫鍵（hydrogenbond）一個(gè)氫原子連接兩個(gè)負(fù)電性強(qiáng)的原子（如氧、氮等），其中一個(gè)為共價(jià)鍵，另一個(gè)即為氫鍵。在α-螺旋和盡折疊片中占有極重要的地位，對(duì)蛋白質(zhì)分子三維構(gòu)象的維護(hù)也很重要。②靜電引力正負(fù)帶電基團(tuán)之間的吸引力。如NH4+與COO－，靜電引力較強(qiáng)，但對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的穩(wěn)定性貢獻(xiàn)不是很大。有時(shí)也稱之為離子鍵（ionichond）或鹽鍵。（2）維持蛋白質(zhì)分子構(gòu)象的化學(xué)鍵③范德華力（vanderwaal’s）偶極子和偶極子之間的微弱引力。這種力是原子團(tuán)相互接近時(shí)誘導(dǎo)所產(chǎn)生的。它瞬息變化，但對(duì)維持蛋白質(zhì)活性中心的構(gòu)象非常重要。④疏水相互作用（hydrophobicbond）是非極性基團(tuán)為了避開水相而群集在一起的作用力。疏水相互作用是蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要決定因素。⑤二硫鍵兩個(gè)硫原了之間形成的共價(jià)鍵。此鍵作用很強(qiáng)，可把不同肽鏈或同一條肽鏈的不同部分連在一起，對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象起重要作用。多數(shù)蛋白質(zhì)分子的二硫鍵斷裂后，活性中心的構(gòu)象會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致其生物活性的喪失。（3）蛋白質(zhì)分子中膚鏈的空間結(jié)構(gòu)原則①肽鍵-CO-NH-帶有部分雙鍵的性質(zhì)，不能沿C-N鍵自由旋轉(zhuǎn)。肽膚鍵亞氨基上的氫原子在pH0-4范圍內(nèi)不解離。②由肽鍵中的4個(gè)原子和它相鄰的兩個(gè)。一碳原子構(gòu)成一個(gè)剛

性平面，稱為肽平面或酰胺平面（amideplane），如圖4-4所示。肽平面上各原子所構(gòu)成的鍵其鍵長(zhǎng)、鍵角固定不變。圖4-4肽平面③肽平面之間可以旋轉(zhuǎn)，據(jù)此，蛋白質(zhì)多肽主鏈理應(yīng)有許多構(gòu)象，但事實(shí)上，一個(gè)具有生物活性的蛋白質(zhì)多肽鏈在一定條件下往往只有一種或很少幾種構(gòu)象，其原因如下：a．氨基酸殘基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)、極性造成空間位阻，使Ca-C鍵和N-Ca鍵的旋轉(zhuǎn)不能超過0°-±180°范圍；

b.N-H鍵的H原子和另一酰胺平面的C-O鍵的原子間有強(qiáng)吸引力，一者可形成氫鍵；同樣C-O鍵的O原子與另一肽平面的N-H鍵的H原子也可形成氫鍵，因而使Ca-C鍵和N-Ca鍵的旋轉(zhuǎn)也不能超過0°-±180°。2．二級(jí)結(jié)構(gòu)―肽鏈的螺旋折疊(1)α-螺旋(2)β-折疊(3)β-轉(zhuǎn)角(4)無規(guī)則卷曲(1)α-螺旋α-螺旋（α-helix）是蛋白質(zhì)中最常見的一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，是1951年由美國(guó)人PaulingL和CoreyRB根據(jù)對(duì)角蛋白的X射線衍射結(jié)果而提出來的（圖4-5）。①α-螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)

a．多肽鏈的主鏈圍繞一個(gè)“中心軸”螺旋上升，每隔3.6個(gè)氨基酸上升一圈，螺距0.54nm，每個(gè)氨基酸上升0.15nm，每個(gè)氨基酸旋轉(zhuǎn)100°。這種典型的α-螺旋可用3.613來表示。

b．相鄰螺圈之間要形成鏈內(nèi)氫鍵，在每個(gè)氨基酸殘基的氨基與其前面第4個(gè)氨基酸殘基的羰基間形成。氫鍵的取向幾乎與中心軸平行（氧鍵的4個(gè)原子位于一條直線上）,且是維系α-螺旋的主要作用力。

c.R側(cè)鏈在螺旋的外側(cè)。

d．天然蛋白質(zhì)中的α-螺旋大多數(shù)是右手螺旋。

圖4-5α-螺旋膚鏈模式圖(1)α-螺旋②影響α-螺旋形成和穩(wěn)定的因素

a．氨基酸的組成和排列順序例如，不帶電荷的多聚丙氨酸，在pH7的水溶液中能自發(fā)地形成α-螺旋；但多聚賴氨酸在同樣的pH條件下卻不能形成α-螺旋，而是以無規(guī)卷曲形式存在。這是因?yàn)槎嗑圪嚢彼嵩趐H7時(shí)R基具有正電荷，彼此間由于靜電排斥，不能形成氫鍵。又如肽鏈中有脯氨酸殘基時(shí)，由于脯氨酸所含的亞氨基參與了肽鍵的形成，再無H原子用來形成氫鍵，從而使α-螺旋在脯氨酸處產(chǎn)生“結(jié)節(jié)”（螺旋被中斷或拐彎）。b．氨基酸所帶電荷性質(zhì)這與氨基酸的組成相關(guān)。

c.R側(cè)鏈的大小如果在Ca原子附近有較大的R基，造成空間位阻，也不能形成α-螺旋。(2)β-折疊在研究絲蛋白的X射線衍射時(shí)，發(fā)現(xiàn)絲蛋白肽鏈存在一種與α-螺旋不同的結(jié)構(gòu)，Pauling等提出一種折疊式結(jié)構(gòu)，稱為β-折疊（β-pleatedstructure）。β-折疊與α-螺旋相比較，具有以下特點(diǎn)。

①結(jié)構(gòu)要點(diǎn)

a．肽鏈幾乎是完全伸展的。

b．肽鏈呈鋸齒狀，按層平行排列，肽平面呈片狀，稱為折疊片（圖4-6）。c．相鄰肽鏈上的-CO-與-NH-形成氫鍵，氫鍵幾乎垂直于肽鏈，用以維持片層間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

d．肽鏈的R側(cè)鏈基團(tuán)在肽平面的上下交替出現(xiàn)。

e．折疊片分平行式和反平行式兩種類型（圖4-7）。

在兩種β-折疊中，反平行式結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。因?yàn)榉雌叫惺街袣滏I不垂直于膚鍵，角度較大，氫鍵中各原子與主鏈各原子間排斥力較小。圖4-6β-折疊結(jié)構(gòu)示意圖圖4-7β-折疊結(jié)構(gòu)類型(2)β-折疊②β-折疊與α-螺旋的轉(zhuǎn)變?cè)谀承┑鞍踪|(zhì)分子結(jié)構(gòu)中，α-螺旋可與β-折疊互相轉(zhuǎn)變。例如，在加熱條件下，α-螺旋可轉(zhuǎn)變?yōu)棣?折疊。這是由于受熱時(shí)，α-螺旋中氫鍵被破壞，肽鏈伸長(zhǎng)。頭發(fā)（α-角蛋白）在濕熱條件下伸長(zhǎng)，就是由于角蛋白中的。β-折疊。(3)β-轉(zhuǎn)角β-轉(zhuǎn)角（β-turn）是球狀蛋白中廣泛存在的一種結(jié)構(gòu)類型，可占全部氨基酸殘基總數(shù)的1/4左右。β-轉(zhuǎn)角是多肽主鏈回轉(zhuǎn)180°所形成的部分，它使肽鏈的走向發(fā)生改變?chǔ)?轉(zhuǎn)角由4個(gè)連續(xù)的氨基酸殘基組成，第n個(gè)氨基酸殘基的-CO-與第n+3個(gè)氨基酸殘基的-NH-形成氫鍵，氫鍵維持β-轉(zhuǎn)角的穩(wěn)定性（圖4-8）。在這種結(jié)構(gòu)中，Gly和Pro出現(xiàn)頻率高。

(4)無規(guī)則卷曲又稱為自由回轉(zhuǎn)（randomcoil)，是上述幾種結(jié)構(gòu)單元以外的其他松散肽鏈結(jié)構(gòu)形式。3．三級(jí)結(jié)構(gòu)―肽鏈非幾何形的進(jìn)一步折疊蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)是指一條多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步卷曲折疊，構(gòu)成一個(gè)不規(guī)則的特定構(gòu)象，它包括全部主鏈、側(cè)鏈在內(nèi)的所有原子的空間排布，但不包括肽鏈的相互關(guān)系。

球狀蛋白質(zhì)的構(gòu)象比纖維狀蛋白質(zhì)的構(gòu)象復(fù)雜得多，它們具有多種多樣的生物功能。球狀蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)是由二級(jí)結(jié)構(gòu)單元恰當(dāng)配置（組合、盤繞等）而成的，如有規(guī)律地反復(fù)出現(xiàn)的返折（發(fā)夾彎曲）所形成的螺旋或折疊片段的回折。只有三級(jí)結(jié)構(gòu)才是蛋白質(zhì)生物活性的特征構(gòu)象。例如，鯨肌紅蛋白（myoglobin）是第一個(gè)被闡明三級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，是由KendrewJC等用X射線衍射研究確定的，如圖4-9所示。圖4-9肌紅蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)4．四級(jí)結(jié)構(gòu)―亞基間的相互關(guān)系許多天然球狀蛋白質(zhì)是由兩條或多條肽鏈構(gòu)成的，在這些蛋白質(zhì)分子中，肽鏈間通過非共價(jià)鍵聚集在一起。這種由兩條或兩條以上的具有三級(jí)結(jié)構(gòu)的多肽鏈通過非共價(jià)鍵聚合而成的特定構(gòu)象稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。四級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)中每個(gè)最小共價(jià)單位稱為亞基或亞單位（Subunit）。亞基單獨(dú)存在時(shí)沒有生物活性，只有聚合成四級(jí)結(jié)構(gòu)才具有完整的生物活性。亞基一般由一條肽鏈組成，也有由幾條肽鏈組成（鏈間以二硫鍵連接）的情形。四級(jí)結(jié)構(gòu)涉及亞基的種類和數(shù)目以及各亞基在整個(gè)分子中的空間排布，包括亞基間的接觸位點(diǎn)和相互作用關(guān)系，而不包括亞基本身的構(gòu)象。三、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的統(tǒng)一性1．一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系―氨基酸序列提供重要的化學(xué)信息2．蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系―構(gòu)象決定功能1．一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系―氨基酸序列提供重要的化學(xué)信息（1）同功蛋白質(zhì)氨基酸的種屬差異和分子進(jìn)化（2）同功蛋白質(zhì)中氨基酸序列的個(gè)體差異和分子?。?）一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活（1）同功蛋白質(zhì)氨基酸的種屬差異和分子進(jìn)化同功蛋白質(zhì)是指不同種屬來源的執(zhí)行同種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)。它們?cè)诜肿咏M成上基本相同，但有差異。同功蛋白質(zhì)在氨基酸組成上可區(qū)分為兩部分：一部分是不變的氨基酸序列，它決定蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)與功能，各種同功蛋白質(zhì)的不變氨基酸序列完全一致；另一部分是可變的氨基酸序列，這是同功蛋白質(zhì)的種屬差異的體現(xiàn)。例如，牛、豬、羊、鯨、人等，雖在種屬上差異很大，但它們的胰島素在化學(xué)結(jié)構(gòu)上幾乎完全一致，僅在A鏈的第8位、第9位、第10位上的3個(gè)氨基酸有差異（表4-5)，但這些差異并不影響功能，這些差異可能僅表現(xiàn)其種屬特異性。（1）同功蛋白質(zhì)氨基酸的種屬差異和分子進(jìn)化同功蛋白質(zhì)在組成上的差異也表現(xiàn)出生物進(jìn)化中親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。例如細(xì)胞色素C(cytochromeC）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的含鐵葉琳的色蛋白，大多數(shù)生物的細(xì)胞色素C由104個(gè)氨基酸殘基組成，對(duì)已弄清的近100種生物的細(xì)胞色素C的氨基酸序列進(jìn)行比較（表4-6)，發(fā)現(xiàn)親緣關(guān)系越近，其結(jié)構(gòu)越相似；親緣關(guān)系越遠(yuǎn)，在結(jié)構(gòu)組成上差異越大。根據(jù)同功蛋白質(zhì)在組成上的差異程度，可以斷定它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，可以反映出生物系統(tǒng)進(jìn)化樹，從而辯證地闡明分子進(jìn)化。（2）同功蛋白質(zhì)中氨基酸序列的個(gè)體差異和分子病對(duì)同種生物而言，具有相同生物活性的蛋白質(zhì)稱為同種蛋白質(zhì)，同種蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)在不同生物個(gè)體中比較也存在細(xì)微差異。這種同種蛋白質(zhì)的氨基酸序列的細(xì)微差異稱為個(gè)體差異。這種差異常常引起多種疾病，即分子病。這是由于同種蛋白質(zhì)的氨基酸組成上的個(gè)體差異引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變，從而導(dǎo)致生物學(xué)功能的改變。例如，鐮刀形細(xì)胞貧血病，病人的血紅蛋白分子與正常人血紅蛋白分子比較，主要差異在于β-鏈上第6位氨基酸殘基，正常人為谷氨酸，病人則為纈氨酸。纈氨酸側(cè)鏈與谷氨酸側(cè)鏈的性質(zhì)和在蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)形成中的作用完全不同，所以導(dǎo)致病人的血紅蛋白結(jié)構(gòu)異常。在缺氧時(shí)，病人紅細(xì)胞呈鐮刀狀，使運(yùn)輸氧的能力減弱，引起貧血癥狀。（3）一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活①血液凝固的生化機(jī)理血液中包含著對(duì)立統(tǒng)一的兩個(gè)系統(tǒng)；凝血系統(tǒng)和溶血系統(tǒng)。這兩個(gè)系統(tǒng)相互制約，既保證血液暢流，又保證血管出現(xiàn)創(chuàng)傷時(shí)能及時(shí)堵漏。如果凝血因子都處于活性狀態(tài)，則血液會(huì)隨時(shí)凝固而阻流；如果血液中無凝血因子，則會(huì)出現(xiàn)一旦受創(chuàng)就會(huì)流血不止的情況。動(dòng)物體解決這個(gè)矛盾的有效辦法是凝血因子以前體（precursor）形式存在。一旦動(dòng)物體受到創(chuàng)傷而流血時(shí)，這些前體就在其他因子作用下被激活，這是一個(gè)復(fù)雜的過程。前體纖維蛋白原（fibrinogen）轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白（fibrin），使血液凝固。而正常情況下血液在血管內(nèi)不會(huì)凝固。如何去控制血液在血管內(nèi)發(fā)生凝固（血栓），血液內(nèi)還有另一套系統(tǒng)―纖維蛋白溶酶原（profibrinolysin），激活后變?yōu)槔w維蛋白溶酶（fibrinolysin），它可以溶解血栓。凝血和溶血兩套系統(tǒng)的激活都是蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)通過特異性水解作用，斷裂適當(dāng)片段而實(shí)現(xiàn)的。（3）一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活（3）一級(jí)結(jié)構(gòu)的局部斷裂與蛋白質(zhì)的激活②胰島素原的激活胰島素是由胰島的β細(xì)胞合成的，最初合成的是一個(gè)比較大的單鏈多肽（比胰島素分子大一倍），稱為前胰島素原，它是胰島素原（proinsulin）的前體，而胰島素原是胰島素的前體二胰島素原含有86個(gè)氨基酸殘基（人），分A、B、C三段，被類胰蛋白酶作用后切去C肽而轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚砸葝u素，如圖4-10所示。圖4-10胰島素原的激活2．蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系―構(gòu)象決定功能（1）變構(gòu)現(xiàn)象（2）變性作用（1）變構(gòu)現(xiàn)象有些蛋白質(zhì)在完成其生物功能時(shí)往往空間結(jié)構(gòu)發(fā)生一定的變化，從而改變分子的性質(zhì)，以適應(yīng)生理功能的需要，這種現(xiàn)象稱為變構(gòu)現(xiàn)象，又稱為別構(gòu)現(xiàn)象或變構(gòu)作用（allostery）。（2）變性作用天然蛋白質(zhì)受到各種不同理化因素的影響，由氫鍵、鹽鍵等次級(jí)鍵維系的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，致使生物學(xué)性質(zhì)、物理化學(xué)性質(zhì)改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的變性作用（denaturation）。引起蛋白質(zhì)變性的理化因素包括：溫度、紫外線、X射線、超聲波、機(jī)械攪拌等物理因素；強(qiáng)酸（堿）、尿素、乙醇、三氯乙酸等化學(xué)因素。第五節(jié)蛋白質(zhì)的性質(zhì)一、蛋白質(zhì)分子的大小二、兩性解離和等電點(diǎn)三、膠體性質(zhì)四、沉淀作用五、變性作用六、顏色反應(yīng)

一、蛋白質(zhì)分子的大小1．相對(duì)分子質(zhì)量―蛋白質(zhì)是巨大分子2．測(cè)定方法―蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定1．相對(duì)分子質(zhì)量―蛋白質(zhì)是巨大分子蛋白質(zhì)是大分子物質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量很大，一般為1萬到幾百萬。具體的每種蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的大小是在某種測(cè)試方法下得到的蛋白質(zhì)分子的相對(duì)質(zhì)量。同種蛋白質(zhì)在不同方法下測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量大小不完全相同。表4-7為用超離心沉降法測(cè)得的部分蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）。2．測(cè)定方法―蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定(1)根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量(2)用物理化學(xué)方法來測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量(1)根據(jù)化學(xué)組成測(cè)定最低相對(duì)分子質(zhì)量利用化學(xué)分析定量測(cè)出蛋白質(zhì)中某一特殊元素的含量，并且假設(shè)蛋白質(zhì)分子中只含有一個(gè)被測(cè)元素的原子，則可以計(jì)算出蛋白質(zhì)的最低相對(duì)分子質(zhì)量。例如，血紅蛋白含鐵量為0.335%，其最低相對(duì)分子質(zhì)量為：用其他方法測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量為68000，故血紅蛋白含有4個(gè)鐵原子．其真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量為：16700×4=66800。又如，牛血清白蛋白含色氨酸0.58%，由此計(jì)算所得的最低相對(duì)分子質(zhì)量為35000；而用其他方法測(cè)得的相對(duì)分子質(zhì)量為69000，所以每個(gè)牛血清白蛋白分子中含有2個(gè)色氨酸殘基，真實(shí)相對(duì)分子質(zhì)量為70000(2)用物理化學(xué)方法來測(cè)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量這也是目前測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的常用方法，具體包括：測(cè)質(zhì)點(diǎn)的擴(kuò)散系數(shù)、滲透壓、光散射、沉降超離心與凝膠過濾等。其中，滲透壓測(cè)定法最簡(jiǎn)便，但誤差較大；超離心法最為準(zhǔn)確，但設(shè)備昂貴。超離心法測(cè)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量一般有沉淀速度法和沉降平衡法兩種。二、兩性解離和等電點(diǎn)1．兩性解離―蛋白質(zhì)是多價(jià)解離的兩性電解質(zhì)2．等電點(diǎn)―在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的多種性質(zhì)達(dá)到最低值1．兩性解離―蛋白質(zhì)是多價(jià)解離的兩性電解質(zhì)由于蛋白質(zhì)除了仍然具有α-NH2和α-COOH外，參與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組成的堿性氨基酸、酸性氨基酸殘基側(cè)鏈也有酸性基團(tuán)和堿性基團(tuán)，所以蛋白質(zhì)也是兩性電解質(zhì)。蛋白質(zhì)分子的可解離基團(tuán)主要指?jìng)?cè)鏈的可解離基團(tuán)，因此蛋白質(zhì)的兩性解離情況比氨基酸復(fù)雜。蛋白質(zhì)的可解離基團(tuán)在特定pH范圍內(nèi)解離時(shí)會(huì)產(chǎn)生帶一定電荷的基團(tuán)。但由于蛋白質(zhì)含有多個(gè)可解離基團(tuán)，因此在一定pH條件下可發(fā)生多價(jià)解離。蛋白質(zhì)分子所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量是由蛋白質(zhì)分子中的可解離基團(tuán)的種類和數(shù)目以及溶液的pH值所決定的。2．等電點(diǎn)―在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)的多種性質(zhì)達(dá)到最低值對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，當(dāng)在某一pH值時(shí)，其所帶正負(fù)電荷恰好相等（即凈電荷為零）,這一pH值稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。處于等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)分子在電場(chǎng)中既不向陽極移動(dòng)，也不向陰極移動(dòng)；在pH值低于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)帶正電荷，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；在pH值高于等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向陽極移動(dòng)。如下式所示：三、膠體性質(zhì)1．膠體性質(zhì)―蛋白質(zhì)溶液是親水膠體2．滲析―蛋白質(zhì)的滲析和超濾行為1．膠體性質(zhì)―蛋白質(zhì)溶液是親水膠體由于蛋白質(zhì)分子直徑大，一般在2-20nm的范圍內(nèi)，在膠體（colloid）溶液質(zhì)點(diǎn)大小范圍（1-I00nm）內(nèi)，所以蛋白質(zhì)溶液是

膠體溶液，因而具有布朗運(yùn)動(dòng)、丁達(dá)爾現(xiàn)

象、不能透過半透膜等特性。同時(shí)，蛋白

質(zhì)顆粒表面有許多親水的極性基團(tuán)，因而

蛋白質(zhì)溶液是親水膠體。2．滲析―蛋白質(zhì)的滲析和超濾行為由于蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大，在溶液中形成的顆粒大，因此，不能通過半透膜。利用這種性質(zhì)可將蛋白質(zhì)和一些小分子物質(zhì)分開，這種分離方法稱為滲析（或透析）（dialysis）。即將要純化的蛋白質(zhì)溶液盛入半透膜袋內(nèi)放在流水中讓無機(jī)鹽等小分子物質(zhì)擴(kuò)散人水中而除去的一種分離方法（圖4-11）。超濾（ultrafiltration）是利用外加壓力或離心力使水和其他小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上。超濾是工業(yè)生產(chǎn)中常用的一種蛋白質(zhì)純化方法。滲析和超濾只能分開大分子物質(zhì)和小分子物質(zhì)，而不能分開不同的蛋白質(zhì)。圖4-11透析與超濾裝置四、沉淀作用1．穩(wěn)定因素―蛋白質(zhì)沉淀主要是破壞兩個(gè)穩(wěn)定因素2．沉淀方法―鹽析是常用的沉淀方法1．穩(wěn)定因素―蛋白質(zhì)沉淀主要是破壞兩個(gè)穩(wěn)定因素蛋白質(zhì)溶液這種親水膠體比較穩(wěn)定，其穩(wěn)定因素為：水化層和帶電層。水化層是蛋白質(zhì)分子表面的許多親水基團(tuán)與水分子結(jié)合形成的一層水膜，它使蛋白質(zhì)顆粒不能相互接觸聚集成大顆粒；帶電層是蛋白質(zhì)分子表面的可解離基團(tuán)在一定pH環(huán)境下解離產(chǎn)生的，由于帶同性電荷的蛋白質(zhì)顆粒相互排斥，也使蛋白質(zhì)顆粒不能聚集。

蛋白質(zhì)溶液的穩(wěn)定是生物機(jī)體正常新陳代謝所必需的，也是相對(duì)的、暫時(shí)的、有條件的。當(dāng)條件改變時(shí)，穩(wěn)定性就被破壞，蛋白質(zhì)分子相互聚集而從溶液中析出，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)的沉淀作用（precipitation）。

蛋白質(zhì)沉淀主要是破壞了兩個(gè)穩(wěn)定因素，任何破壞水化層和帶電層的因素都能使蛋白質(zhì)分子聚集并沉淀。

2．沉淀方法―鹽析是常用的沉淀方法中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著的影響，當(dāng)濃度較高時(shí)，中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀。這種由于在蛋白質(zhì)溶液中加人大量中性盆，使蛋白質(zhì)沉淀析出的作用稱為鹽析（Saltingout）。鹽析產(chǎn)生的原囚是大量中性鹽既中和了蛋白質(zhì)所帶電荷，又破壞了其水膜，即大量中性鹽破壞了蛋白質(zhì)的兩個(gè)穩(wěn)定因素。

鹽析所需鹽濃度一般較高，但不引起蛋白質(zhì)變性。不同蛋白質(zhì)鹽析時(shí)所需鹽濃度不同，所以在蛋白質(zhì)溶液中逐漸增大中性鹽（常用硫酸按）的濃度，不同蛋白質(zhì)就先后析出，這種方法稱為分段鹽析（fractionalsaltingout）。例如血清中加入50%飽和度的（NH4）SO4時(shí)就可使球蛋白析出，加入100％飽和度的（NH4）SO4可使白蛋白析出。五、變性作用1．變性的本質(zhì)―變性是空間結(jié)構(gòu)的解體2．變性的應(yīng)用―變性作用具有實(shí)際意義1．變性的本質(zhì)―變性是空間結(jié)構(gòu)的解體由于理化因素引起維持蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的次級(jí)鍵被破壞，所以導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)解體。但是維持蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的共價(jià)鍵（主要是肽鍵）沒有被破壞，所以蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)是未改變的，一旦解除引起變性的條件，蛋白質(zhì)又可能重新形成空間結(jié)構(gòu)，并恢復(fù)全部或部分理化特性和生物學(xué)活性，即存在復(fù)性可能。因此蛋白質(zhì)的變性分為可逆變性和不可逆變性兩種類型。一般條件劇烈時(shí)引起的變性常常是不可逆的，反之則可逆。可逆變性一般是三級(jí)以上結(jié)構(gòu)遭到破壞，而不可逆變性則是二級(jí)結(jié)構(gòu)也遭到破壞，因此就不能再恢復(fù)為原來的構(gòu)象了。2．變性的應(yīng)用―變性作用具有實(shí)際意義變性后，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)發(fā)生改變，例如失去結(jié)晶力、溶解度降低（水膜被破壞）、結(jié)構(gòu)松散（空間結(jié)構(gòu)解體）、豁度增加（球狀變?yōu)榫€團(tuán)等）。同時(shí)，生物學(xué)功能減弱或喪失，這是變性蛋白質(zhì)的主要特征，例如酶失去活性、血紅蛋白失去與氧的結(jié)合能力。變性蛋白質(zhì)常常相互凝聚成塊，這種現(xiàn)象稱為凝固（coagulation)，凝固是蛋白質(zhì)變性深化的表現(xiàn)。因此，利用變性的深淺程度，在實(shí)際應(yīng)用中具有重要意義、例如，在防治病蟲害、消毒、滅菌等時(shí)，就應(yīng)利用高溫、高壓、紫外線及高濃度有機(jī)溶劑等促進(jìn)和加深蛋白質(zhì)的變性程度；在生產(chǎn)制備酶制劑等有活性的蛋白質(zhì)產(chǎn)品時(shí)，又要防止蛋白質(zhì)的變性，避免不利因素的影響。六、顏色反應(yīng)1．一般顏色反應(yīng)―蛋白質(zhì)具有氨基酸的顏色反應(yīng)2．特殊顏色反應(yīng)―蛋白質(zhì)還具有氨基酸不具備的顏色反應(yīng)1．一般顏色反應(yīng)―蛋白質(zhì)具有氨基酸的顏色反應(yīng)氨基酸具有的黃色反應(yīng)、米隆反應(yīng)、乙醛酸反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)、坂口反應(yīng)、酚試劑反應(yīng)，蛋白質(zhì)也具有這些反應(yīng)特性，它們可用于蛋白質(zhì)的定性鑒定和定量測(cè)定，酚試劑反應(yīng)還可用于測(cè)定蛋白質(zhì)水解是否徹底（表4-8）。2．特殊顏色反應(yīng)―蛋白質(zhì)還具有氨基酸不具備的顏色反應(yīng)其中最典型的是蛋白質(zhì)能發(fā)生特殊的雙縮脈反應(yīng)（biuretreaction）。雙縮脲生成的反應(yīng)為：所以，在堿性溶液中，雙縮脲與硫酸銅結(jié)合，生成紫紅色或紅色物質(zhì)，這一反應(yīng)稱為雙縮脲兩個(gè)或兩個(gè)以上肽鍵結(jié)構(gòu)的化合物都具有這個(gè)反應(yīng)。蛋白質(zhì)中的肽鍵與雙縮脲的部分結(jié)構(gòu)相似，所以有同樣的反應(yīng)。因而雙縮脈反應(yīng)是肽鍵理論的依據(jù)之一。同時(shí)，雙縮脲反應(yīng)還可用于定性鑒定和定量測(cè)定蛋白質(zhì)（比色波長(zhǎng)為540nm）。第六節(jié)蛋白質(zhì)及氨基酸的分離純化與測(cè)定一、分離純化的一般原則及基本步驟二、分離純化的基本方法三、氨基酸的分離四、蛋白質(zhì)及氨基酸的分析測(cè)定一、分離純化的一般原則及基本步驟1．一般原則―根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來設(shè)計(jì)分離純化方法2．基本步驟―分離純化的戰(zhàn)略1．一般原則―根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)來設(shè)計(jì)分離純化方法①分離純化所用原料的來源要方便，成本要低；目的蛋白質(zhì)含量、相對(duì)活性要高；可溶性和穩(wěn)定性要好；基因分子背景如何，重組DNA的表達(dá)系統(tǒng)、表達(dá)水平、表達(dá)方式都要明確。②破碎細(xì)胞的條件要盡可能溫和（使用極端條件要以目的蛋白質(zhì)的活性和功能不受損害為原則）；盡可能多地去除各種雜質(zhì)、脂類、核酸及毒素，雙液相蛋白質(zhì)萃取技術(shù)可同時(shí)去除這些雜質(zhì)。③分離純化的大部分操作是在溶液中進(jìn)行的。操作緩沖液中物質(zhì)成分要慎重考慮，避免隨意性；還要考慮蛋白水解酶和核酸酶的抑制劑、抑制微生物生長(zhǎng)的殺菌劑、蛋白質(zhì)構(gòu)象穩(wěn)定劑和酶活性的還原劑及金屬離子等。④建立靈敏、特異、精確的檢測(cè)方法2．基本步驟―分離純化的戰(zhàn)略（1）取材選取某種蛋白質(zhì)含量豐富的材料，并要求便于提取。（2）組織細(xì)胞破碎主要有機(jī)械法、物理法、化學(xué)法和酶法4種。

機(jī)械法是用組織分散器、勻漿器、細(xì)菌磨等進(jìn)行破碎。物理法是應(yīng)用超聲波、滲透壓、壓榨等物理原理進(jìn)行破碎；但超聲波的空化作用易使酶等失活，因此超聲波破碎時(shí)需加保護(hù)劑?；瘜W(xué)法如堿性條件下處理對(duì)堿穩(wěn)定的蛋白質(zhì)或酶。酶法如使用溶菌酶、纖維素酶對(duì)細(xì)胞壁等進(jìn)行破壞。

在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)，滲透壓休克法、細(xì)菌磨研磨和壓榨法更適用。（3）提取選用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行提取。

2．基本步驟―分離純化的戰(zhàn)略（4）分離純化根據(jù)待分離蛋白質(zhì)的特異理化性質(zhì)設(shè)計(jì)分離純化方法。（5）結(jié)晶分離提純的蛋白質(zhì)常要制成晶體，結(jié)晶也是進(jìn)一步純化的步驟。結(jié)晶的最佳條件是使溶液略處于過飽和狀態(tài)，可通過控制溫度、加鹽鹽析、加有機(jī)溶劑或調(diào)節(jié)pH值等方法來實(shí)現(xiàn)。（6）鑒定、分析對(duì)所制得的蛋白質(zhì)產(chǎn)品還需進(jìn)行蛋白質(zhì)的純度、含量、相對(duì)分子質(zhì)量等理化性質(zhì)的鑒定和分析測(cè)定，主要方法有電泳法、色譜法、定氮法及分光光度法等。二、分離純化的基本方法1．鹽析與等電點(diǎn)沉淀―根據(jù)溶解度不同的分離方法2．離子交換色譜―根據(jù)電荷性質(zhì)不同的分離方法3．凝膠過濾―根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量不同的分離方法4．親和色譜―根據(jù)特異性親和力不同的分離方法5．高效液相色譜―可用于分配色譜、吸附色譜、離子交換色譜、凝膠過濾1．鹽析與等電點(diǎn)沉淀―根據(jù)溶解度不同的分離方法（1）鹽析大多數(shù)蛋白質(zhì)是水溶性的，其溶解度與它們自身