版權(quán)說(shuō)明:本文檔由用戶(hù)提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡(jiǎn)介
第七章:培養(yǎng)細(xì)胞中克隆基因的表達(dá)及動(dòng)物基因工程本章概述基因調(diào)控的研究(有關(guān)原核和真核生物的表達(dá)載體、報(bào)告基因等)基因在細(xì)胞系中表達(dá)的方法篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞的遺傳標(biāo)記哺乳動(dòng)物中瞬時(shí)轉(zhuǎn)化載體(以SV40為例)基因定點(diǎn)敲除技術(shù)第一節(jié)基因調(diào)控的研究一、表達(dá)載體一類(lèi)在多克隆位點(diǎn)的5‘端含有轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的克隆載體。由于真核生物和原核生物啟動(dòng)子的不同,需要針對(duì)不同的宿主設(shè)計(jì)不同的載體。A、在大腸桿菌中的外源基因表達(dá)載體(1)典型的原核基因以及其RNA的特點(diǎn)轉(zhuǎn)錄終止序列
GC-richinvertedrepeat5’-GTCAAAAGCCTCCGGTCGGAGGCTTTTGACT
CAGTTTTCGGAGGCCAGCCTCCGAAAACTGA-5’RunofAresidues依賴(lài)ρ因子的終止子不依賴(lài)ρ因子的終止子真核基因的啟動(dòng)子不能被原核RNA聚合酶識(shí)別真核基因在原核生物中表達(dá),必須把基因序列置于原核基因的框架內(nèi).(2)真核基因和原核基因的區(qū)別(3)啟動(dòng)子是表達(dá)載體的關(guān)鍵部分——選擇啟動(dòng)子
······TTGACA
·····························TATAAT
····GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATATTGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTAACTACGTGTTGACATAAATACCACTGGCGGTGATACTGACACTTGATACTGTATGAAGCATACAGTATAATTGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTCTGTTGACAATTAATCATCGAACTAGTTTAATGT
-35Region-10GegionConsensuslactrpλPLrecAtacItacII-10和-35堿基序列和通序啟動(dòng)子的強(qiáng)弱與它們與共有序列的相似程度有關(guān)。相似性越高,就越強(qiáng);反之。。。。。序列盒和基因融合在載體上將啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和終止信號(hào)按較合理的置于載體上,這樣的序列叫做序列盒外源基因插入在序列盒中間,通常與細(xì)菌的一段基因形成融合基因,所以在構(gòu)建這類(lèi)載體時(shí),一定需要閱讀框的正確。融合載體的四大優(yōu)點(diǎn):利用大腸桿菌天然序列,可以保證有效地翻譯起始防止外源蛋白被降解可以被輸出到胞外,利于純化可以便于親和層析(4)大腸桿菌中高效表達(dá)基因的策略?xún)?yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)提高稀有密碼子tRNA的表達(dá)作用提高外源基因mRNA的穩(wěn)定性提高外源基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性?xún)?yōu)化發(fā)酵過(guò)程B、在真核細(xì)胞中外源基因表達(dá)載體真核生物的啟動(dòng)子序列包含:1)核心元件(TATA盒,起始子等)2)上游元件(CAAT盒等)3)遠(yuǎn)上游調(diào)控(增強(qiáng)子等)B、真核生物的表達(dá)載體通常含有真核基因的啟動(dòng)子序列表達(dá)載體的啟動(dòng)子區(qū)基本表達(dá)組成型表達(dá)細(xì)胞特異表達(dá)調(diào)節(jié)型表達(dá)MCSTATASP1AP1CAAT細(xì)胞特異調(diào)節(jié)型表達(dá)二、報(bào)告基因報(bào)告基因應(yīng)滿(mǎn)足的條件1)編碼特異的蛋白酶活性,宿主細(xì)胞中沒(méi)有2)酶活檢測(cè)應(yīng)快速、簡(jiǎn)便、靈敏等3)報(bào)告蛋白不影響宿主細(xì)胞的正?;钚猿S玫腉FP(YFP)、lacZ、GUS等第二節(jié)基因在細(xì)胞中的表達(dá)方法一、基因轉(zhuǎn)染的策略
一般基因轉(zhuǎn)化的的策略直接轉(zhuǎn)化:用物理的方法直接將外源DNA轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞中去。
轉(zhuǎn)染:用一系列物理和化學(xué)的方法迫使細(xì)胞能從周?chē)慕橘|(zhì)中接受DNA。?轉(zhuǎn)導(dǎo):動(dòng)物病毒animalvirus一、基因轉(zhuǎn)染的策略1.DNA/磷酸鈣共沉淀的方法轉(zhuǎn)化過(guò)程A、將待轉(zhuǎn)染的DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液B、逐滴加入到Hepes-磷酸鹽緩沖液中,形成磷酸鈣-DNA共沉淀C、用吸管將共沉淀物加到培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物單層細(xì)胞表面,會(huì)迅速被細(xì)胞捕獲,頻率約10%(二)脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體(liposomes)是一種人造的脂質(zhì)小泡,外周是脂雙層,內(nèi)部是水腔一、基因轉(zhuǎn)染的策略一、基因轉(zhuǎn)染的策略(三)電穿孔法在高壓電脈沖的作用下使細(xì)胞膜上出現(xiàn)微小的孔洞,從而促使不同細(xì)胞之間發(fā)生原生質(zhì)體融合或促使細(xì)胞吸收外界環(huán)境中的DNA分子一、基因轉(zhuǎn)染的策略(四)、直接轉(zhuǎn)化-微注射真正的顯微注射穿刺一、基因轉(zhuǎn)染的策略二、瞬時(shí)轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)化)外源DNA不與宿主的基因組DNA整合,轉(zhuǎn)化細(xì)胞在較短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。常用于較短時(shí)間的實(shí)驗(yàn),如啟動(dòng)子功能檢測(cè),蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位等三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)化外源基因整合到細(xì)胞染色體中,隨著細(xì)胞的分裂而傳代(或子代的形成),產(chǎn)生穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系(或個(gè)體)。通常用于研究基因的功能或改變生物個(gè)體的性狀。第三節(jié):篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因動(dòng)物細(xì)胞的遺傳標(biāo)記內(nèi)源的選擇標(biāo)記這些基因存在于野生型的細(xì)胞中只能在相關(guān)基因發(fā)生了突變(失去功能)的突變體細(xì)胞中應(yīng)用顯性的選擇標(biāo)記賦予細(xì)胞一個(gè)完全新的表型,可以在多個(gè)細(xì)胞系中進(jìn)行利用。哺乳動(dòng)物受體細(xì)胞常見(jiàn)的遺傳選擇標(biāo)記
遺傳標(biāo)記編碼產(chǎn)物篩選藥物作用機(jī)理APH-氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶G418APH滅活G418DHFR二氫葉酸還原酶氨甲喋呤DHFR突變體抗氨甲喋呤HPH-潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素BHPH滅活潮霉素BTK-胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤TK合成TMPXGPRT-黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶霉酚酸XGPRT合成GMPADA-腺嘌呤核苷脫氨酶腺嘌呤木酮糖苷ADA滅活Xyl-A1.胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)TK-細(xì)胞
把細(xì)胞培養(yǎng)在加有胸苷類(lèi)似物5-溴尿嘧啶脫氧核苷(BUdR)的培養(yǎng)基中,在胸苷激酶(TK)的催化下,BUdR便摻入到細(xì)胞的DNA分子上,致使DNA復(fù)制出現(xiàn)錯(cuò)誤。具有BUdR-DNA的細(xì)胞對(duì)UV特別敏感,被迅速地殺死,而少數(shù)TK-的細(xì)胞便能存活下來(lái)HAT選擇法:在含有次黃嘌呤(Hypoxanthine)、氨基蝶呤(Aminopterin抑制了正常的核苷酸合成)和胸苷(Thymidine)的培養(yǎng)基中篩選TK+細(xì)胞共轉(zhuǎn)化選擇。在磷酸鈣沉淀中,有兩種形體上沒(méi)有連接的DNA組成的混合物,能夠同時(shí)轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞將無(wú)選擇標(biāo)記的DNA與具TK選擇標(biāo)記基因的DNA進(jìn)行混合轉(zhuǎn)化外源DNA可整合到核基因組的任何部位把TK基因先與非選擇標(biāo)記基因連接起來(lái),也能共轉(zhuǎn)化1.胸苷激酶基因選擇系統(tǒng)90%的TK+細(xì)
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無(wú)特殊說(shuō)明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶(hù)所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁(yè)內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒(méi)有圖紙預(yù)覽就沒(méi)有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 人人文庫(kù)網(wǎng)僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶(hù)上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶(hù)上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶(hù)因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 高中化學(xué) 人教版 選修5 5.2 應(yīng)用廣泛的高分子材料 教案2課時(shí)
- 鄂教版勞動(dòng)三年級(jí)下冊(cè) 4 剪個(gè)“?!弊执吧腺N 教案
- 人音版八年級(jí)音樂(lè)上冊(cè)(簡(jiǎn)譜)第四單元《☆沃爾塔瓦河》教學(xué)設(shè)計(jì)
- 安徽省池州一中2025年高三下學(xué)期5月份統(tǒng)考化學(xué)試題含解析
- 木花架梁的制作與安裝方案
- 安徽省“江淮十?!?025年校高三下學(xué)期第一次在線(xiàn)月考化學(xué)試題含解析
- 《城市建成區(qū)高(快)速路交通運(yùn)行風(fēng)險(xiǎn)智能防控技術(shù)規(guī)范》(征求意見(jiàn)稿)
- 年暑假七年級(jí)英語(yǔ)第一講教案
- 車(chē)來(lái)了小班健康教案模板6篇
- 班級(jí)年度工作計(jì)劃范文
- 統(tǒng)編版語(yǔ)文六年級(jí)上冊(cè)第六單元主題閱讀(含答案)
- 2024年離婚合同協(xié)議書(shū)離婚協(xié)議書(shū)合同
- 第3節(jié)-地球的自轉(zhuǎn)公開(kāi)課教案課件
- 2024-2025形勢(shì)與政策:七十五載砥礪奮進(jìn)創(chuàng)輝煌 中國(guó)式現(xiàn)代化繼往開(kāi)來(lái)興偉業(yè)
- “數(shù)字城市”公共智慧底座項(xiàng)目解決方案
- 科學(xué)五年級(jí)上冊(cè)3.2.用水計(jì)量時(shí)間3
- 國(guó)開(kāi)2024年秋《機(jī)電控制工程基礎(chǔ)》形考任務(wù)3答案
- 《語(yǔ)文園地三》(教學(xué)設(shè)計(jì))2024-2025學(xué)年統(tǒng)編版語(yǔ)文一年級(jí)上冊(cè)
- 09 第二部分 一 考點(diǎn)8 主旨要義、話(huà)題判斷(教學(xué)設(shè)計(jì))2025版高中英語(yǔ)聽(tīng)力Ⅰ(高一強(qiáng)化篇)
- 第一單元名著導(dǎo)讀《艾青詩(shī)選》 課件 2024-2025學(xué)年統(tǒng)編版語(yǔ)文九年級(jí)上冊(cè)
- Unit2 More than fun Developing ideas教學(xué)設(shè)計(jì)2024-2025學(xué)年外研版(2024)七年級(jí)英語(yǔ)上冊(cè)
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論