生化實(shí)驗(yàn)期末考資料

氨基酸的分離鑒定（紙層析法）分配層析：是一種連續(xù)抽提法。一種溶劑通常是被結(jié)合在固定的惰性支持物（柱、膜、紙）上的水，另外一相由流動(dòng)的被水飽和的有機(jī)溶劑構(gòu)成，它流過固定相。如果某一混合物的各組分在這兩相中的分配系數(shù)有足夠的差異，它們就可以被分離。（固定相和流動(dòng)相）分配系數(shù)：在一定條件下，某一組分在固定相和流動(dòng)相中含量（濃度）的比值。紙層析法：是用濾紙作為惰性支持物的分配層析法。層析溶劑由有機(jī)溶劑和水組成。物質(zhì)被分離后在紙層析圖譜上的位置使用R?值（比移）來(lái)表示：影響Rf值的因素：在一定的條件下某種物質(zhì)的Rf值是常數(shù)。Rf值的大小與物質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、溶劑系統(tǒng)、層析濾紙的質(zhì)量和層析溫度等因素有關(guān)。紙層析過程：點(diǎn)樣，擴(kuò)展，顯色，計(jì)算擴(kuò)展劑（展層劑）：4份水飽和的正丁醇和1份醋酸的混合物。將20mL正丁醇和5mL冰醋酸放入分液漏斗中，與15mL水混合，充分振蕩，靜置后分層，放出下層水層，上層即為擴(kuò)展劑。顯色劑：0.1%水合茚三酮正丁醇溶液蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（等電點(diǎn)測(cè)定和顯色反應(yīng)）等電點(diǎn)：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。當(dāng)溶液的pH達(dá)到一定數(shù)值時(shí)，蛋白質(zhì)顆粒上正負(fù)電荷的數(shù)目相等，在電場(chǎng)中，蛋白質(zhì)既不向陰極移動(dòng)，也不向陽(yáng)極移動(dòng)，此時(shí)溶液的pH值稱為此種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。蛋白質(zhì)顆?？梢蚴ル姾珊兔撍恋?。（水化層和雙電層）蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類：可逆的沉淀反應(yīng)（蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生變化。如鹽析作用或在低溫下用乙醇（或丙酮）短時(shí)間作用于蛋白質(zhì)。）不可逆的沉淀反應(yīng)（蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，如加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類)0.4%酪蛋白醋酸鈉溶液：稱取0.4g酪蛋白（干酪素），加少量水在乳缽中仔細(xì)地研磨，將所得的蛋白質(zhì)懸浮液移入200mL錐形瓶?jī)?nèi)，用少量40～50℃的溫水洗滌乳缽，將洗滌液也移入錐形瓶?jī)?nèi)。加入10mL1mol/L醋酸鈉溶液。把錐形瓶放到50℃水浴中，并小心地旋轉(zhuǎn)錐形瓶，直到酪蛋白完全溶解為止。將錐形瓶?jī)?nèi)的溶液全部移至100mL容量瓶?jī)?nèi)，加水至刻度，塞緊玻塞，混勻。0.2mol/LpH4.7醋酸-醋酸鈉的緩沖液：先配制A液與B液，取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸鈉緩沖液3000mL。A液（0.2mol/L醋酸鈉溶液）：稱NaAc?3H2O54.44g，定容至2000mL。B液（0.2mol/L醋酸溶液）：稱優(yōu)級(jí)純醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000mL。透析實(shí)驗(yàn)透析：蛋透析是利用半透膜進(jìn)行的一種選擇性擴(kuò)散操作，通常是將半透膜制成袋狀，將生物大分子樣品溶液置入袋內(nèi)，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內(nèi)，而鹽和小分子物質(zhì)不斷擴(kuò)散透析到袋外，直到袋內(nèi)外兩邊的濃度達(dá)到平衡為止。保留在透析袋內(nèi)未透析出的樣品溶液稱為“保留液”，袋（膜）外的溶液稱為“滲出液”或“透析液”。（白質(zhì)的透析和糖類的透析）蛋白質(zhì)的含量測(cè)定（一）——考馬斯亮藍(lán)染色法分光光度法：是一種利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測(cè)定物質(zhì)的吸收光譜，利用此吸收光譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析和物質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的方法。分光光度計(jì)都包括光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器和顯示裝置（顯示儀表）。在紫外光波區(qū)檢測(cè)選用石英、藍(lán)寶石比色杯；在可見光波區(qū)檢測(cè)可選用有機(jī)玻璃比色杯?？捡R斯亮藍(lán)G-250染色法優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單迅速，靈敏度高，一些陽(yáng)離子如K+、Na+、Mg2+、NH42+以及乙醇等物質(zhì)都不干擾測(cè)定。缺點(diǎn)：但一些去污劑如TritonX-100、SDS等嚴(yán)重干擾測(cè)定，且樣品測(cè)定后不能回收。考馬斯亮藍(lán)G-250原理：（染料結(jié)合法）在游離狀態(tài)下呈棕紅色，當(dāng)它與蛋白質(zhì)通過疏水作用結(jié)合后變?yōu)樗{(lán)色，前者的最大光吸收在465nm，后者在595nm，在一定蛋白質(zhì)濃度范圍內(nèi)（0.01～1.0mg/mL），蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的光吸收與蛋白質(zhì)含量成正比。蛋白質(zhì)的含量測(cè)定（二）——紫外吸收法紫外吸收法的原理：蛋白質(zhì)分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm。在一定波長(zhǎng)處，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。紫外吸收法的優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、靈敏、快速，不消耗樣品，測(cè)定后仍能回收使用；低濃度的鹽和大多數(shù)緩沖液都不干擾測(cè)定，適合柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測(cè)。紫外吸收法的缺點(diǎn)：準(zhǔn)確度較差，干擾物質(zhì)多；在用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差；樣品中若含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會(huì)出現(xiàn)較大的干擾；測(cè)定時(shí)受樣品的pH影響較大，蛋白質(zhì)的性質(zhì)實(shí)驗(yàn)（蛋白質(zhì)及氨基酸的橙呈反應(yīng)）雙縮脲反應(yīng)：尿素加熱至此180℃左右，生成雙縮脲并放出一分子氨。雙縮脲在堿性環(huán)境中能與Cu2+結(jié)合生成紫紅色化合物，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。蛋白質(zhì)分子中有肽鍵，結(jié)構(gòu)與雙縮脲相似，能發(fā)生此反應(yīng)。故該方法可用于蛋白質(zhì)的定性或定量測(cè)定。茚三酮反應(yīng)：所有的α-氨基酸及一切蛋白質(zhì)都能和茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色物質(zhì)，除了脯氨酸、羥脯氨酸和茚三酮反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì)。該反應(yīng)十分靈敏，1﹕1500000濃度的氨基酸水溶液即能給出反應(yīng)，是一種常用的氨基酸定量測(cè)定方法。茚三酮反應(yīng)分為兩步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被還原成還原型茚三酮；第二步是所形成的還原型茚三酮結(jié)合另一分子水合茚三酮和氨縮合生成有色物質(zhì)。黃色反應(yīng)（Pauly反應(yīng)）：含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黃色物質(zhì)，該化合物在堿性溶液中進(jìn)一步形成深橙色的硝醌酸鈉。多數(shù)蛋白質(zhì)分子含有帶苯環(huán)的氨基酸，所以有黃色反應(yīng)，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量濃硫酸才有黃色反應(yīng)。肌糖原的酵解作用用乳酸的生成來(lái)檢查糖原或淀粉的酵解作用：糖類和蛋白質(zhì)干擾乳酸的測(cè)定，因此在除去蛋白質(zhì)與糖后，乳酸可與硫酸共熱產(chǎn)生乙醛，后者再與對(duì)羥基聯(lián)苯反應(yīng)產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)。此法比較靈敏，每毫升溶液含1～5μg乳酸即可檢出。酵母核糖核酸的分離及組分鑒定：RNA可溶于堿性溶液，在堿提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。酵母核糖核酸的分離步驟:1、將5g酵母粉懸浮于30mL0.04mol/LNaOH溶液中，并在乳缽中研磨均勻。2、將懸浮液轉(zhuǎn)移至100mL錐形瓶中，在沸水浴中加熱30min，冷卻。3、將懸液轉(zhuǎn)入離心管中，3000r/min離心15min，將上清液緩緩傾入10mL酸性乙醇溶液中。（注意：要一邊攪拌一邊緩緩傾入。）4、待核糖核酸沉淀完全后，3000r/min離心3min，棄去清液。5、用95%乙醇洗滌沉淀2次，乙醚洗滌沉淀1次后，用乙醚轉(zhuǎn)移沉淀至布氏漏斗中，抽濾。6、沉淀在空氣中干燥，得到酵母核糖核酸。核糖核酸組分：含有核糖、嘌呤堿和磷酸各組分。加硫酸煮沸可使其水解。測(cè)定核糖的常用方法是苔黑酚法（又稱地衣酚，3，5-二羥基甲苯）（Orcinol反應(yīng)）。測(cè)定脫氧核糖常用的方法是二苯胺法。核糖核酸組分的鑒定:稱取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加熱10min，制成水解液。嘌呤堿的鑒定：取水解液1mL加入過量的濃氨水，然后加入約1mL0.1mol/L硝酸銀溶液，觀察有無(wú)嘌呤堿的銀化合物沉淀。核糖的鑒定：取1支試管，加入1mL水解液、2mL三氯化鐵濃鹽酸溶液和0.2mL苔黑酚乙醇溶液，置沸水浴中10min。（注意：溶液變成綠色說(shuō)明核糖的存在。）磷酸的鑒定：取1支試管，加入1mL水解液和1mL定磷試劑，在水浴中加熱，觀察溶液變成藍(lán)色，說(shuō)明磷酸的存在。酪蛋白的制備原理：牛乳中主要的蛋白質(zhì)是酪蛋白，含量約為35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白質(zhì)的混合物，等電點(diǎn)為4.7。利用等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低的原理，將牛乳的pH調(diào)至4.7時(shí)，酪蛋白就沉淀出來(lái)。用乙醇洗滌沉淀物，除去脂類雜質(zhì)后便可得到純的酪蛋白。酶的特性溫度對(duì)酶活性的影響：酶的催化作用受溫度的影響，在最適溫度下，酶的反應(yīng)速度最高。酶對(duì)溫度的穩(wěn)定性與其存在形式有關(guān)，有些酶的干燥制劑雖加熱到100℃，其活性并無(wú)明顯的改變，但在100℃的溶液中卻很快地完全失去活性。低溫能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH對(duì)酶活性的影響：唾液淀粉酶的最適pH約為6.8。唾液淀粉酶的活化和抑制：氯離子為唾液淀粉酶的活化劑，銅離子為其抑制劑。酶的專一性：唾液淀粉酶水解淀粉生成有還原性的麥芽糖，用Benedict試劑檢查糖的還原性。用碘液檢查淀粉水解情況：淀粉和可溶性淀粉遇碘呈藍(lán)色。糊精按其分子的大小遇碘可呈藍(lán)色、紫色、暗褐色或紅色。最簡(jiǎn)單的糊精遇碘不呈顏色，麥芽糖遇碘也不呈色。在不同溫度下，淀粉被唾液淀粉酶水解的程度可由水解混合物遇碘呈現(xiàn)的顏色來(lái)判斷。Benedict試劑：無(wú)水硫酸銅17.4g溶于100mL熱水中，冷卻后稀釋至150mL。取檸檬酸鈉173g，無(wú)水碳酸鈉100g和600mL水共熱，溶解后冷卻并加水至850mL。再將冷卻的150mL硫酸銅溶液傾入。本試劑可長(zhǎng)久保存。血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳影響泳動(dòng)速度的因素：內(nèi)在：質(zhì)點(diǎn)所帶凈電荷的量、質(zhì)點(diǎn)的大小、形狀；外界：電場(chǎng)強(qiáng)度、溶液的pH值、溶液的離子強(qiáng)度、電滲現(xiàn)象。血糖的定量測(cè)定GOD-PAP法原理：即氧化酶-過氧化物酶法測(cè)定血糖依據(jù)的酶反應(yīng)為：葡萄糖+O2+H2O→葡萄糖酸+H2O22H2O2+4-氨基安替吡啉+酚→醌亞胺+4H2O醌亞胺在A480nm~A550nm波長(zhǎng)有最大吸收，所產(chǎn)生顏色的深淺與血清中葡萄糖的量成正比。在同樣條件下，測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的光吸收值，即可求出樣品中葡萄糖的含量。葡萄糖濃度計(jì)算公式：脂肪酸的Β-氧化脂肪酸β-氧化所生成的乙酰輔酶A在人及哺乳動(dòng)物肝外組織中，大部分可迅速通過三羧酸循環(huán)氧化成二氧