流式細(xì)胞術(shù)在精子分離研究中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)在精子分離研究中的應(yīng)用

流式細(xì)胞術(shù)（rcm）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的一種快速細(xì)胞分析技術(shù)。概括說(shuō)來(lái),FCM就是對(duì)處在快速直線(xiàn)流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)的快速定量分析和分選的技術(shù)。它能高速分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,并能同時(shí)測(cè)量細(xì)胞的物理或化學(xué)性質(zhì)。它集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流式理論于一體,被譽(yù)為實(shí)驗(yàn)室里的“CT”。如今,它正成功的運(yùn)用于動(dòng)物的精子分離。性別控制是一個(gè)古老而年輕的話(huà)題,也是一項(xiàng)復(fù)雜的生物繁殖技術(shù),從古到今無(wú)數(shù)人對(duì)其進(jìn)行過(guò)探索。性別控制可以根據(jù)需要生產(chǎn)不同性別的動(dòng)物后代:奶牛場(chǎng)多產(chǎn)母牛,配套系種豬場(chǎng)里母系多產(chǎn)母豬等;還可用于挽救瀕危物種(擴(kuò)群)等。通過(guò)體外精子分離,使用已知性染色體類(lèi)型的精子(X或Y)與卵子受精而產(chǎn)生“預(yù)知”性別后代的方法,其中的流式細(xì)胞檢索儀分離精子法為目前動(dòng)物性別控制最有效的途徑,已經(jīng)在畜牧業(yè)中使用并產(chǎn)生了效益。本文簡(jiǎn)要介紹FCM的基本原理,并對(duì)其在精子分離研究中的應(yīng)用作一綜述。1細(xì)胞分類(lèi)與細(xì)胞亞群的區(qū)分流式細(xì)胞儀的基本結(jié)構(gòu)包括5部分:①流動(dòng)室及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng);②激光光源及光束形成系統(tǒng);③光學(xué)系統(tǒng);④信號(hào)檢測(cè)、存儲(chǔ)、顯示、分析系統(tǒng);⑤細(xì)胞分類(lèi)純化系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)需將待測(cè)細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,以保證細(xì)胞逐個(gè)地通過(guò)受檢,然后用穩(wěn)定地流動(dòng),依次經(jīng)過(guò)噴嘴,恒定通過(guò)激光束的焦斑區(qū),被功率恒定的激光束激發(fā)而產(chǎn)生散射光和激發(fā)熒光。散射光包括前向角散射光(FSC)和側(cè)向角散射光(SSC)。FSC反映了被測(cè)細(xì)胞的大小,細(xì)胞直徑越大,FSC信號(hào)越強(qiáng)。SSC提供了細(xì)胞表面狀況、胞內(nèi)精細(xì)結(jié)構(gòu)和胞質(zhì)顆粒性質(zhì)的信息,SSC信號(hào)越強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)顆粒越多。散射光和熒光是FCM中區(qū)分不同細(xì)胞類(lèi)型的依據(jù)。根據(jù)FSC、SSC兩個(gè)參數(shù),可將細(xì)胞初步分群。又因不同類(lèi)型的細(xì)胞結(jié)合的熒光染料的質(zhì)和量不同,其激發(fā)熒光波長(zhǎng)也不同,故經(jīng)熒光染料處理后,可在物理參量相似的細(xì)胞群中再進(jìn)一步區(qū)分細(xì)胞亞群(亞型)。在此基礎(chǔ)上還可以根據(jù)有關(guān)參數(shù)把所需細(xì)胞亞群從整個(gè)樣品中分選出來(lái)。流式細(xì)胞儀還可以對(duì)分析中的目的細(xì)胞進(jìn)行分選提取,它是通過(guò)分離含有單細(xì)胞的液滴而實(shí)現(xiàn)的。在流動(dòng)室的噴嘴上安裝有超高頻的壓電晶體,可以產(chǎn)生高頻振蕩,使液流斷裂為均勻的液滴,待測(cè)細(xì)胞就包含在液滴之中。將這些液滴充上正或負(fù)電荷,當(dāng)帶電液滴通過(guò)電場(chǎng),在電場(chǎng)的作用下發(fā)生偏轉(zhuǎn),然后落入相應(yīng)的收集器之中,從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞分選。流式細(xì)胞儀的分選速度從以往的5000個(gè)/s提高到現(xiàn)在的25000個(gè)/s。2x、y精子分離在畜牧業(yè)生產(chǎn)中,有選擇地繁殖出具有預(yù)知性別的畜禽后代,將能使產(chǎn)肉、產(chǎn)奶、產(chǎn)毛等與性別相關(guān)生產(chǎn)性能的經(jīng)濟(jì)效益在畜群后代中獲得大大提高,加快畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。傳統(tǒng)的精子分離方法不但準(zhǔn)確率低,而且分離速度太慢,不能滿(mǎn)足現(xiàn)代畜牧業(yè)上大規(guī)模優(yōu)良畜種的推廣和改良的需要。而流式細(xì)胞儀在分離精子中的應(yīng)用,解決了這個(gè)問(wèn)題。在哺乳動(dòng)物中,決定動(dòng)物性別的關(guān)鍵是其所攜帶不同的性染色體。正常雙倍體黃?？偣灿?0條染色體,其中公牛為58條常染色體,1條X染色體,1條Y染色體;而母牛為58條常染色體,2條X染色體。當(dāng)經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂形成單倍體的配子后,X精子攜帶X染色體,它與卵子受精后產(chǎn)生雌性后代;Y精子攜帶Y染色體,它與卵子受精后產(chǎn)生雄性后代。在哺乳動(dòng)物(家畜)中,通常X精子的DNA含量比Y精子多3.0%~4.5%。Hoechst33342是一種相對(duì)安全的活細(xì)胞熒光染料,分子式為C27H28N6O·3HC1,分子質(zhì)量為561.9u。它能穿透活細(xì)胞的脂質(zhì)膜,以非嵌入(Non-intercalate)方式特異地結(jié)合到DNA雙鏈小溝的腺嘌呤和胸腺嘧啶密集區(qū)域,即主要通過(guò)氫鍵、范德華力和電場(chǎng)相互作用力與DNA結(jié)合。精子上的Hoechst33342在激光的照射下能定量地激發(fā)出熒光。該染料的特殊性在于不僅能滲透進(jìn)入活精子膜,而且在適當(dāng)濃度時(shí)對(duì)精子活力、受精后的胚胎和動(dòng)物后代的發(fā)育都沒(méi)有造成顯著影響。分離精子時(shí)Hoechst33342的染色方法:通常先將精子稀釋到1.5個(gè)億/mL,加入Hoechst33342至40μg/mL,在35℃水浴中染色60min。染色后精子通過(guò)流式細(xì)胞儀時(shí),在細(xì)微的進(jìn)樣管液流中排成單列,高速射出噴嘴后逐個(gè)與激光交截。精子上的熒光染料Hoechst33342被氫離子紫外激光(約350nm)激發(fā),產(chǎn)生藍(lán)色激發(fā)光(約460nm)。由于X精子所含有DNA比Y精子多,結(jié)合上比較多的Hoechst33342,所激發(fā)出的熒光就比Y精子強(qiáng)。流式細(xì)胞儀根據(jù)熒光強(qiáng)度的差別分辨出哪個(gè)是X精子,哪個(gè)是Y精子。同時(shí),由于噴嘴產(chǎn)生高頻率震動(dòng),高速?lài)娚涑龅囊毫餍纬闪税瑔蝹€(gè)X精子或者Y精子的微小液滴。當(dāng)液滴被充上正電荷或者負(fù)電荷后在電場(chǎng)力的引導(dǎo)下分別落入不同的收集容器中,X精子就得以分離。覃能斌、袁野、王洪章等利用流式細(xì)胞儀分離荷斯坦奶牛精子的效果特別好,X精子分離準(zhǔn)確率在90%以上。X、Y精子之間的DNA含量差異是流式細(xì)胞檢索儀進(jìn)行X、Y精子分離的理論基礎(chǔ)。許多研究表明,哺乳動(dòng)物的X染色體比Y染色體大,所含的DNA也比Y多:人的X精子染色體DNA含量大約比Y精子的多2.8%~3.0%,牛、豬、馬、羊、犬、兔X精子染色體DNA含量分別比相應(yīng)的Y精子多3.8%、3.6%、4.1%、4.2%、3.9%、3.0%。分離精子的基本流程為:經(jīng)過(guò)處理的精子與熒光染料(Hoechst33342)在一定條件下共同孵育染色,讓這種活細(xì)胞染料與精子DNA的AT富含區(qū)域結(jié)合。X、Y精子在DNA含量上的差異使其結(jié)合的熒光染料量也有差異,當(dāng)他們被激光照射時(shí),所釋放出的熒光信號(hào)強(qiáng)弱也有差異(X精子較強(qiáng))。此信號(hào)通過(guò)儀器、計(jì)算機(jī)系統(tǒng)擴(kuò)增和識(shí)別。當(dāng)含有精子的液體離開(kāi)激光系統(tǒng)時(shí),變成含精子的微液滴并被沖上正(X精子)或負(fù)(Y精子)電荷,并借助于偏斜板(電場(chǎng))把X或Y精子分別引導(dǎo)到2個(gè)收集管中,分辨不清的精子被拋棄。準(zhǔn)確分辨X和Y精子的關(guān)鍵在于正確定位、染色等。檢索主要依靠頭部染料結(jié)合后熒光信號(hào)的強(qiáng)弱來(lái)判斷。哺乳動(dòng)物精子頭部多為短槳行,激光從不同角度照射所激發(fā)的熒光強(qiáng)度差異很大(槳的扁平面向著檢測(cè)器時(shí)熒光低,邊緣向著檢測(cè)器時(shí)高),很容易掩蓋X、Y精子DNA差異帶來(lái)的微弱的熒光強(qiáng)度差異。當(dāng)精液通過(guò)檢索系統(tǒng)時(shí),定位正確的精子被準(zhǔn)確分離,不正確的分辨不清而丟棄。通過(guò)改進(jìn)噴嘴(噴嘴內(nèi)部的錐型構(gòu)造使定位更好,可對(duì)精子產(chǎn)生液壓直到精子排到激光前)、改進(jìn)電場(chǎng)等系統(tǒng)設(shè)計(jì),結(jié)合系統(tǒng)壓力的調(diào)整,可提高單精子液滴的產(chǎn)生率、精子分離率和分離精子的產(chǎn)量。研究認(rèn)為,在精子定位理想,50Psi壓力下每秒可形成80000個(gè)液滴,每秒可分離性別活精子各10000個(gè)(每小時(shí)3.6×107個(gè)),較初期的儀器效率提高極大,要再突破則需要從分離程序上做大的變動(dòng),短時(shí)間內(nèi)難以辦到;壓力太高、速度太快會(huì)影響分離后精子的活力(很少使用40Psi以上壓力)。目前,流式細(xì)胞檢索儀精子性別分離速度一般可達(dá)到每小時(shí)1.5×107個(gè),分離精子的產(chǎn)量能夠滿(mǎn)足牛的人工授精需要,對(duì)豬等(每次需要10億以上輸精量)動(dòng)物則需要相關(guān)技術(shù)配合。不同動(dòng)物精子的染色液、染色時(shí)間等都有差異,而且常在熒光染色后,用食物染料屏蔽細(xì)胞膜有損傷精子(死、弱者)的熒光,以便分離過(guò)程中除去。研究表明,精子DNA含量差異大的物種更好分離,如牛精子比人、豬的好分離。使用流式細(xì)胞檢索儀分離精子時(shí),在處理、分離及以后的保存、使用階段,精子細(xì)胞都可能受到許多因素的損害:高度稀釋、核染色、機(jī)械壓力(通過(guò)檢索儀時(shí))、激光、離心、冷凍等,采用合適的染色液、鞘液、收集液、保存液和保存方式等都有益。如公豬用Test-蛋黃、公牛用XYTalp加蛋黃等稀釋劑預(yù)置于收集管底部(常加入2%~20%蛋黃,某些品種加入10%精漿)可減輕損害,有利于提高分離后精子的活力和膜的完整性。在采精到分離這段時(shí)間,環(huán)境溫度下保存純精液優(yōu)于用稀釋液稀釋等。各種動(dòng)物精子分離及處理、保存等要求差異很大。到目前為止,尚未發(fā)現(xiàn)流式細(xì)胞檢索儀分離精子對(duì)DNA等有明顯影響:Catt等未見(jiàn)高濃度H33342和紫外線(xiàn)對(duì)DNA的內(nèi)源性缺口有影響;Seidel等認(rèn)為染色與未染色精子在通過(guò)檢索儀后在運(yùn)動(dòng)性和DNA完整性方面無(wú)差異,使流式細(xì)胞檢索儀進(jìn)行精子性別分離后產(chǎn)下的后代沒(méi)有明顯的表型或基因型變化;Johnson研究表明,豬、牛、兔的精子分離后代可以正常繁殖下一代。但一些試驗(yàn)報(bào)道,使用性別分離精子比非分離者授精后懷孕率低,其原因還不很清楚。3流式細(xì)胞術(shù)液相芯片綜上所述,FCM在動(dòng)物生產(chǎn)研究中的應(yīng)用極其廣泛,還可用來(lái)評(píng)價(jià)各種因素對(duì)精子發(fā)生、形態(tài)和功能的損傷,以及各種體外處理技術(shù)和低溫貯藏對(duì)精子結(jié)構(gòu)的影響。FCM的優(yōu)點(diǎn)是可以快速地同時(shí)測(cè)定多個(gè)指標(biāo),準(zhǔn)確反映精子功能,但FCM用于精液分析,很多還處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。FCM要作為常規(guī)檢測(cè)手段,需要同熒光顯微鏡結(jié)合使用,與傳統(tǒng)方法相互驗(yàn)證,積累更多更可靠的數(shù)據(jù),最終確證各方法的可靠性和權(quán)威性,并使各方法標(biāo)準(zhǔn)化。近年來(lái),新型多功能流式細(xì)胞儀的開(kāi)發(fā),如將生物芯片技術(shù)和FCM有機(jī)結(jié)合在一起,把不同生物探針(核酸、蛋白等)標(biāo)記在各種有熒光的微球上,以熒光標(biāo)記微球作為反應(yīng)載體在液相系統(tǒng)中完成生物學(xué)反應(yīng),即為流式細(xì)胞術(shù)液相芯片技術(shù)。它組成由微球體+探針+目的分子+報(bào)告分子的一種簡(jiǎn)單反應(yīng)模式?？梢栽谕灰合嘀型瑫r(shí)檢測(cè)多個(gè)目的分子,如對(duì)血液中多種白細(xì)胞介素