8個(gè)兔品種微衛(wèi)星遺傳多樣性分析

8個(gè)兔品種微衛(wèi)星遺傳多樣性分析

微衛(wèi)星是近年來發(fā)展起來的新型dna分子標(biāo)記。這些dna序列是由少量氨基酸（通常1.6）組成的多個(gè)序列重復(fù)的。被認(rèn)為是遺傳因素之一。自聯(lián)合國糧農(nóng)組織將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具以來,各國學(xué)者也開始利用微衛(wèi)星對部分家兔的遺傳多樣性進(jìn)行了分析。Caon等利用微衛(wèi)星標(biāo)記分析了歐洲當(dāng)?shù)厝馀Ｆ贩N的遺傳多樣性。JoonghoShin等研究了人類表皮生長因子受體(EGFR)基因3’端非編碼區(qū)1個(gè)A堿基的缺失突變,引起該區(qū)微衛(wèi)星的不穩(wěn)定,提高了該基因mRNA的穩(wěn)定性,引起EGFR基因過度表達(dá),導(dǎo)致人類腫瘤的發(fā)生。李慧芳等利用微衛(wèi)星DNA多態(tài)性分析了中國地方鴨品種的分子遺傳多樣性。黃生強(qiáng)等利用微衛(wèi)星標(biāo)記預(yù)測了豬部分經(jīng)濟(jì)性狀的雜種優(yōu)勢。然而,在微衛(wèi)星分子標(biāo)記廣泛使用的同時(shí),在分子標(biāo)記檢測中通常會因?yàn)楦鞣N原因而導(dǎo)致其結(jié)果存在一定比例的誤差,比如樣品質(zhì)量、Marker大小、引物與模板DNA分子間的互補(bǔ)以及人為因素等等。筆者選取18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記,為減少等位基因判讀的錯(cuò)誤,采用PCR擴(kuò)增結(jié)合熒光標(biāo)記全自動(dòng)電泳檢測技術(shù)檢測微衛(wèi)星長度多態(tài)性,以期準(zhǔn)確揭示這8個(gè)兔品種的遺傳多樣性,為家兔種質(zhì)資源的有效保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。1熒光標(biāo)記pcr擴(kuò)增隨機(jī)采取具備品種特征的皖系長毛兔209只、比利時(shí)兔105只、美系獺兔104只、九疑山兔72只、新西蘭白兔52只、閩西南黑兔48只、蘇系長毛兔48只和福建黃兔48只,耳緣靜脈抽取3ml血樣,肝素鈉抗凝,于-20℃下冷凍保存,備用。家兔血液基因組DNA的提取方法,參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(第3版)并稍加改進(jìn)。從28對微衛(wèi)星引物中篩選了多態(tài)性較好的18對引物。對每對引物上游引物5’端分別用FAM、HEX或TAMRA3種熒光染料進(jìn)行標(biāo)記,引物避光保存。根據(jù)微衛(wèi)星擴(kuò)增片段大小的范圍和引物熒光標(biāo)記顏色的差異,對篩選出的18對引物進(jìn)行組合試驗(yàn),依據(jù)是每3種顏色熒光為一組,該組內(nèi)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段的大小相差50bp以上,這樣的組合共有6個(gè)。所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司(Sangon)合成。18對熒光標(biāo)記微衛(wèi)星引物組合情況以及PCR反應(yīng)條件如表1所示。PCR反應(yīng)體系(20μl):10×PCR(不含Mg2+)Buffer2μl,25mmol/LMgCl20.8～1.5μl,2.5mmol/LdNTP1μl,10μmol/L上下游引物各1μl,TaqDNA聚合酶1.0U,100ng/μlDNA模板1μl,ddH2O補(bǔ)齊20μl。加樣過程在冰浴中進(jìn)行,由于熒光引物見光分解,故所有操作均要在避光條件下進(jìn)行,分裝管事先用錫箔紙包好,PCR擴(kuò)增在96孔板中進(jìn)行。PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性5min,94℃變性45s,52～64℃退火45s,72℃延伸45s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min,4℃避光保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先在2.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測,然后送交上海INVETROGEN公司使用ABI-3730XLDNAAnalyzer全自動(dòng)測序儀進(jìn)行檢測。利用Microsatellite-Toolkit軟件計(jì)算各微衛(wèi)星座位的等位基因頻率、多態(tài)信息含量、期望雜合度,通過Dispan軟件計(jì)算各品種間的標(biāo)準(zhǔn)遺傳距離(Ds),并采用PHYLIP軟件對所研究的群體進(jìn)行聚類分析。2品種間遺傳距離聚類分析利用GeneMapper4.0軟件確定各個(gè)基因座位等位基因的大小,所有等位基因的大小介于90～356bp,圖1為其中2對引物的毛細(xì)管凝膠電泳結(jié)果。8個(gè)兔品種18個(gè)微衛(wèi)星座位上的多態(tài)信息含量(PIC)和基因期望雜合度(H)見表2。由表2可知,18個(gè)微衛(wèi)星座位反映的8個(gè)兔品種多態(tài)信息含量(PIC)介于0.0625～0.8740,各個(gè)微衛(wèi)星座位的多態(tài)信息含量(PIC)在不同兔品種間的變異程度有較大差異:美系獺兔在D6Utr4位點(diǎn)PIC含量最高,為0.8740;而蘇系長毛兔在19L1G5位點(diǎn)PIC含量最低,為0.0625。18個(gè)微衛(wèi)星座位反映的8個(gè)兔品種平均基因期望雜合度(H)也存在較大差異:在6L1F10位點(diǎn)上,新西蘭白兔H值為0.6426,而閩西南黑兔H值僅為0.2807,同一位點(diǎn)不同品種間相差較大。另外,平均基因期望雜合度(H)比平均雜合度明顯較高,表明品種內(nèi)可能存在一定程度的近交。8個(gè)兔品種平均多態(tài)信息含量由低到高的次序與平均基因期望雜合度的次序基本一致,依次為:蘇系長毛兔(SX)、閩西南黑兔(MB)、皖系長毛兔(WX)、九疑山兔(JM)、新西蘭白兔(NZ)、比利時(shí)兔(BR)、美系獺兔(RR)和福建黃兔(FY)。根據(jù)Nei’s法計(jì)算DS遺傳距離(表3),可以看出8個(gè)兔品種之間的遺傳距離為0.0936～0.3506。通過群體間遺傳距離分析得到的聚類圖能夠更直觀地表現(xiàn)群體間關(guān)系。系統(tǒng)進(jìn)化樹把8個(gè)家兔品種體分為3大類:蘇系長毛兔、皖系長毛兔、美系獺兔、九疑山兔和閩西南黑兔聚為第1類群,新西蘭白兔和福建黃兔聚為第2類群,比利時(shí)兔為第3類群(圖2)。3不同品種兔的遺傳多樣性多態(tài)信息含量(PIC)是衡量基因片段多態(tài)性較好的指標(biāo)。該研究中的18個(gè)微衛(wèi)星座位反映的8個(gè)家兔品種平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.4185～0.5488,與黃鄧萍等的研究結(jié)果不一致,可能是由于所采用的家兔品種、微衛(wèi)星引物對數(shù)以及試驗(yàn)方法等不同所造成的。在8個(gè)家兔品種中,福建黃兔的平均多態(tài)信息含量最高,為0.5488,屬于高度多態(tài);蘇系長毛兔的平均多態(tài)信息含量最低,為0.4185,屬于中度多態(tài)。該試驗(yàn)結(jié)果表明,在這8個(gè)家兔品種中福建黃兔可提供的遺傳信息比其他7個(gè)兔品種相對要高,這很可能與其所處的地理位置和培育歷史有關(guān)。福建黃兔是由福州地區(qū)農(nóng)民長期自繁自養(yǎng)形成的,后來因受到外來大型品種兔的沖擊,僅在邊遠(yuǎn)山區(qū)存在少量純種,最終由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所通過群體繼代選育得以保存下來的地方品種。蘇系長毛兔的遺傳多樣性在這8個(gè)家兔品種中最低,這可能由于該研究中采集的該品種的樣本數(shù)偏少,產(chǎn)生了遺傳漂變;另外也可能與樣本來源兔場的選育程度有關(guān)。該研究的蘇系長毛兔樣本取自江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘇系長毛兔小群保種群體,該小群保種體系經(jīng)過較多世代的封閉選育,加之群體數(shù)量較小,群體基因型漸漸趨于一致,遺傳多態(tài)信息含量有可能降低。在同一個(gè)微衛(wèi)星座位不同兔品種間的多態(tài)信息含量差異較大。在Sol08位點(diǎn)上,比利時(shí)兔PIC含量最低,為0.4226;而美系獺兔PIC含量最高,為0.7166,差異非常明顯。同一兔品種不同微衛(wèi)星座位上多態(tài)信息含量存在差異。例如,福建黃兔在Sol33位點(diǎn)PIC為0.2599,呈低度多態(tài)性;而在Sat7位點(diǎn)PIC為0.6982,呈高度多態(tài)性。這可能是由于選取的等位基因在各個(gè)群體中的分布不均所致,也可能是由于該兔品種在長期的選育過程中不同微衛(wèi)星座位所受選擇壓的差異所造成的。該研究結(jié)果表明,該8個(gè)家兔品種的遺傳多樣性較為豐富?；螂s合度,也稱為基因多樣度,平均基因雜合度的大小近似地反映出遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低。18個(gè)微衛(wèi)星座位反映的8個(gè)家兔品種平均基因雜合度(H)為0.4758～0.6036,說明這8個(gè)家兔品種具有較高的遺傳多樣性。該研究中我國地方家兔品種福建黃兔平均基因雜合度為0.6036,略低于謝喜平等報(bào)道的福建黃兔平均基因雜合度(0.6766),其原因可能是各自所采用樣品數(shù)、微衛(wèi)星標(biāo)記以及PCR檢測方法等方面的不同所造成的。微衛(wèi)星大部分屬于非結(jié)構(gòu)基因序列,它的變異幾乎不受選擇的影響,從而在進(jìn)化過程中其變異就可在群體內(nèi)大量積累。遺傳距離反映了研究群體的系統(tǒng)進(jìn)化,用以描述群體的遺傳結(jié)構(gòu)和品種間的差異。一般認(rèn)為,群體分化時(shí)間越短,遺傳距離越小。群體間遺傳距離是遺傳變異的尺度。該研究結(jié)果表明,蘇系長毛兔與皖系長毛兔,九疑山兔與閩西南黑兔先聚成一小類,再與美系獺兔聚成第1類群;新西蘭白兔與福建黃兔聚成第2類群;比利時(shí)兔獨(dú)自成為第3類群。該結(jié)果與這些兔品種的經(jīng)濟(jì)類型和地理分布等存在一定程度上的關(guān)聯(lián)。蘇系長毛兔、皖系長毛兔為毛用兔,美系獺兔為皮用兔品種,這3種兔品種聚為一小類,與孫紅梅等利用微衛(wèi)星分析所得結(jié)果一致。3個(gè)兔品種都屬于皮用或毛用兔品種,在品種的選育過程中這3個(gè)家兔品種均主要以選擇被毛品種為重點(diǎn),另一方面為了提高生產(chǎn)性能,大量引進(jìn)了外來兔品種,蘇系長毛兔和皖系長毛兔均含有德系長毛兔的血統(tǒng),導(dǎo)致了它們在檢測結(jié)果上的相似性,從而產(chǎn)生此聚類結(jié)果;九疑山兔與閩西南黑兔都是由我國山地農(nóng)民長期自養(yǎng)自繁而形成的地方品種。從地理位置上來看,二者都是起源于南方山陵地區(qū),氣候地理?xiàng)l件相似,而且在體型上都為中小型兔品種,將二者歸為一類,與中國地方家兔品種的地理分布相吻合,表現(xiàn)出明顯的生態(tài)區(qū)域性;新西蘭白兔與福建黃兔聚為一類,究其原因:(1)新西蘭白兔為肉用兔品種,福建黃兔近年來的選育重點(diǎn)亦為肉用;(2)福建黃兔在20世紀(jì)曾受到大型外來兔品種的沖擊,后來經(jīng)選育得以保存,因此新西蘭白兔與福建黃兔在遺傳距離上較為接近;比利時(shí)兔單獨(dú)形成一大類,比利時(shí)兔是英國