抗褐化劑對(duì)牡丹愈傷組織的影響

抗褐化劑對(duì)牡丹愈傷組織的影響

云南牡丹是中國(guó)西南部的一種特殊植物。這是牡丹科最南期的一個(gè)牡丹科。對(duì)牡丹科植物的起源、發(fā)育和地理分布的研究具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值。滇牡丹擁有包括白色、純黃色、綠色、紅色、紫色等珍貴花色基因資源,因此有可能通過(guò)雜交育種技術(shù),培育具自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的黃色、紅色及其它色系的牡丹新品種,豐富中國(guó)牡丹品種群的花色。然而,滇牡丹傳統(tǒng)的繁殖方法效率低、育種周期長(zhǎng),一直是生產(chǎn)和育種發(fā)展面臨的重大問(wèn)題。組培快繁是促進(jìn)滇牡丹植株再生的一個(gè)重要方式。但滇牡丹為木本植物,次生代謝旺盛,組織培養(yǎng)過(guò)程中褐化現(xiàn)象嚴(yán)重,80%以上的莖尖都會(huì)產(chǎn)生褐色物質(zhì)。近年來(lái),何松林等、張俊琦等、李萍等、吳丹、周秀梅等對(duì)牡丹組培研究均取得了不同程度的進(jìn)展,但滇牡丹的愈傷褐化問(wèn)題仍是急需解決的問(wèn)題之一。有人報(bào)道了在牡丹葉片和葉柄離體培養(yǎng)中的褐化控制問(wèn)題和組培苗在繼代培養(yǎng)中的褐化控制情況。在種胚間接誘導(dǎo)體胚繼代培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織也會(huì)發(fā)生嚴(yán)重褐化,從而使體胚誘導(dǎo)難以進(jìn)行,但針對(duì)這方面的褐化控制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。水解乳蛋白常用于配制植物組織培養(yǎng)基和某些細(xì)菌培養(yǎng)基,經(jīng)本實(shí)驗(yàn)小組前期研究表明水解乳蛋白在滇牡丹組培中具較好的抗褐化作用,而這方面的研究也尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以繼代培養(yǎng)中滇牡丹愈傷組織的褐化控制為目的,同時(shí)研究探討5種抗褐化劑(PVP、VC、結(jié)冷膠、AgNO3、水解乳蛋白(LH))對(duì)滇牡丹愈傷組織生長(zhǎng)的影響,以期找到既能控制褐化,又不影響生長(zhǎng)的方法,從而較好解決滇牡丹組培中的褐化問(wèn)題,并對(duì)其它牡丹種組織培養(yǎng)的褐化控制提供一定借鑒。1材料和方法1.1材料表面實(shí)驗(yàn)原始材料為滇牡丹成熟飽滿種子種胚,于2009年9月在澄江梁王山采集。1.2方法1.2.1種胚的消毒處理(1)外植體的預(yù)處理及接種方法取采集的滇牡丹種子先用洗衣粉水浸泡20min,再用流水沖洗1h后,在超凈工作臺(tái)上用75%的乙醇進(jìn)行表面消毒30s,用無(wú)菌水沖洗3次,然后用0.1%的HgCl2溶液處理8min,最后用無(wú)菌水沖洗5次。切開胚乳,取出種胚,接種于培養(yǎng)基A中培養(yǎng)待用。(2)培養(yǎng)基A:MS+6-BA2.0+2.4-D1.0+VC0.1g/L+AC2.0g/L,瓊脂7.0g/L,pH=7.0。培養(yǎng)條件:暗培養(yǎng),溫度:25℃。1.2.2培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件本實(shí)驗(yàn)選用前人研究中認(rèn)為抗褐化效果好的基本培養(yǎng)基,通過(guò)選用不同抗褐化劑探討其對(duì)褐化的抑制及對(duì)滇牡丹愈傷生長(zhǎng)量的影響,以期找到既能控制褐化又不影響愈傷生長(zhǎng)量的方法,從而較好的解決褐化現(xiàn)象。(1)轉(zhuǎn)接方法選取質(zhì)量好的愈傷組織進(jìn)行轉(zhuǎn)接,每處理接種10塊愈傷組織,重復(fù)3次。(2)抗褐化劑選用將愈傷轉(zhuǎn)接到含有不同抗褐化劑的B0培養(yǎng)基中。(A1-A3):PVP500mg/L、1000mg/L、2000mg/L;(B1-B3):VC50mg/L、100mg/L、200mg/L;(C1-C3):分別用結(jié)冷膠2.0g/L、2.5g/L、3.5g/L代替瓊脂;(D1-D3):AgNO36mg/L、8mg/L、10mg/L;(E1-E3):水解乳蛋白(LH)300mg/L、500mg/L、700mg/L。B0:1/2改良WPM+NAA0.5mg/L+6-BA2.0mg/L,瓊脂7.0g/L,pH=7.0。培養(yǎng)條件:光照時(shí)間12h/d,25℃。(3)褐化測(cè)定指標(biāo)根據(jù)褐化顏色程度將愈傷組織進(jìn)行分級(jí):褐色無(wú)或淺、中、較深、深4級(jí),分別用0、1、2、3表示,以褐化指數(shù)量化褐化情況。褐化指數(shù)計(jì)算公式:(4)滇牡丹愈傷生長(zhǎng)量測(cè)定方法每20d統(tǒng)計(jì)一次生長(zhǎng)量,方法是先用電子天平稱出培養(yǎng)基的質(zhì)量,然后將愈傷組織轉(zhuǎn)接進(jìn)去,再稱出培養(yǎng)基和愈傷組織的總質(zhì)量,兩者差值為愈傷組織的質(zhì)量。培養(yǎng)20d后再稱培養(yǎng)基和愈傷組織的總質(zhì)量,愈傷轉(zhuǎn)出后再稱培養(yǎng)基質(zhì)量,兩次差值為愈傷組織質(zhì)量,最終兩個(gè)愈傷組織質(zhì)量差值為20d內(nèi)愈傷增長(zhǎng)量。再次轉(zhuǎn)接時(shí)重復(fù)上述操作。2結(jié)果與分析2.1不同處理對(duì)褐化過(guò)程的影響在轉(zhuǎn)接后第一天即可發(fā)現(xiàn)在愈傷的傷口部位出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。其中添加PVP處理的愈傷褐化現(xiàn)象大部分?jǐn)U散至培養(yǎng)基中,致使愈傷周圍培養(yǎng)基變褐;添加結(jié)冷膠處理僅有當(dāng)愈傷褐化達(dá)4級(jí)時(shí)才擴(kuò)散至周圍培養(yǎng)基使之變褐,其他3種激素處理愈傷褐化現(xiàn)象基本不會(huì)擴(kuò)散至其周圍培養(yǎng)基。從圖1、圖2可知,各處理均出現(xiàn)不同程度的褐化現(xiàn)象,但均比對(duì)照褐化程度小。且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)褐化程度在逐步加深,褐化主要發(fā)生在培養(yǎng)的前10d,之后培養(yǎng)褐化加深程度明顯減緩,與前人在牡丹組培苗褐化研究中的結(jié)果不同。由圖1可知,第一次繼代時(shí)在培養(yǎng)的前10d各系列的褐化指數(shù)均小于50%,之后均有不同程度的增加但程度小于前10d。PVP處理在不同的時(shí)期各濃度的抗褐化性不同,并未呈某一規(guī)律;VC處理中100mg/L的抗褐化性較好;結(jié)冷膠的處理抗褐化效果整體較好,其中添加3.5g/L結(jié)冷膠時(shí)抗褐化效果最好;AgNO3和LH的抗褐化規(guī)律較為一致,在培養(yǎng)的前10dAgNO310mg/L及LH500mg/L在各處理組中抗褐化效果好,而在后10d的培養(yǎng)中則是AgNO36mg/L及LH700mg/L在各組處理中抗褐化效果好。由圖2可知,在第二次繼代培養(yǎng)中,各處理的褐化加深速度減緩,各抗褐化劑處理的抗褐化效果差異更為明顯,其中結(jié)冷膠的抗褐化效果最好,且所試驗(yàn)的三濃度的抗褐化效果變化不大;其次為L(zhǎng)H,從整體看300、500mg/L濃度抗褐化效果相差不大,而當(dāng)濃度增加到700mg/L時(shí)抗褐化效果相對(duì)較差。2.2對(duì)愈傷生長(zhǎng)量的影響由表1可知,PVP處理中第一次繼代中三種濃度處理之間不存在顯著差異,第二次繼代500mg/L處理生長(zhǎng)量與其他兩種濃度處理存在顯著差異,生長(zhǎng)量低于其他兩種濃度的;VC處理生長(zhǎng)量隨濃度的增加而升高,僅在第一次繼代中50mg/L與200mg/L處理存在顯著差異,其余均不存在顯著差異;結(jié)冷膠、AgNO3、LH處理對(duì)愈傷生長(zhǎng)量影響作用基本一致,各濃度間均不存在顯著差異。第一次繼代生長(zhǎng)量較大的7個(gè)處理為:AgNO38mg/L>VC200mg/L>PVP1000mg/L>AgNO310mg/L>LH500mg/L>結(jié)冷膠3.5g/L>LH700mg/L;第二次繼代生長(zhǎng)量較大的為7個(gè)處理為:AgNO38mg/L>AgNO310mg/L>結(jié)冷膠3.5g/L>LH700mg/L>LH500mg/L>結(jié)冷膠2.0g/L>結(jié)冷膠2.5g/L。3分析與討論3.1第二次繼代過(guò)程中抗褐化效果及應(yīng)用情況本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各抗褐化劑對(duì)愈傷褐化的控制處于一種動(dòng)態(tài)的變化,第一次繼代完成時(shí)抗褐化效果較好的七個(gè)處理為:結(jié)冷膠3.5g/L、結(jié)冷膠2.0g/L、結(jié)冷膠2.5g/L、LH700mg/L、AgNO36mg/L、AgNO38mg/L、LH500mg/L;第二次繼代完成時(shí)抗褐化效果較好的七個(gè)處理為:結(jié)冷膠2.5g/L結(jié)冷膠2.0g/L、結(jié)冷膠3.5g/L、LH700mg/LLH500mg/L、LH300mg/L、AgNO38mg/L。結(jié)冷膠在整個(gè)繼代培養(yǎng)過(guò)程中均表現(xiàn)了較好的抗褐化性,3.5g/L的結(jié)冷膠處理最為適宜;其次為L(zhǎng)H和AgNO3在整個(gè)繼代過(guò)程中也表現(xiàn)了一定的抗褐化性,PVP和VC抗褐化性相對(duì)較差。張俊琦等在牡丹組織培養(yǎng)中褐化的發(fā)生原因與防止方法的研究中表明PVP和結(jié)冷膠能有效的緩解褐化,VC則加劇了組培培養(yǎng)物的褐化程度,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有一定的出入,可能是由于材料不同而導(dǎo)致這一現(xiàn)象的發(fā)生。3.2化劑對(duì)組培苗生長(zhǎng)的影響抗褐化劑對(duì)愈傷組織生長(zhǎng)量具明顯促進(jìn)作用的處理是添加AgNO3組,這與抗褐化劑對(duì)組培苗的生長(zhǎng)影響一致。結(jié)冷膠和LH在第一次繼代過(guò)程中并未表現(xiàn)明顯的促進(jìn)作用,但第二次繼代時(shí)則表現(xiàn)了較明顯的促進(jìn)作用;而PVP和VC愈傷生長(zhǎng)量的影響相反,說(shuō)明結(jié)冷膠和LH的累積作用在一定程度上促進(jìn)了愈傷生長(zhǎng)量的增加。3.3抗褐化劑的應(yīng)用在組培過(guò)程中抗褐化劑的添加是組培褐化控制中最常見(jiàn)的方法,而最理想的抗褐化劑是其在能控制褐化的同時(shí)又不能影響愈傷的正常生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明結(jié)冷膠3.5g/L處理在整個(gè)繼代培養(yǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出較佳的抗褐化性且愈傷生長(zhǎng)量相對(duì)也較高;其次為AgNO38mg/L、AgNO310mg/L、LH500mg/L處理具較好的抗褐化性同時(shí)其愈傷生長(zhǎng)量也較高。而抗褐化劑是通過(guò)某種機(jī)制直接影響愈傷生長(zhǎng)量還是通過(guò)影響愈傷的褐化從而間接影響生長(zhǎng)量則需做進(jìn)一步的研究探索。LH是用乳蛋白經(jīng)胰酶消化而成,含豐富的人體必需氨基酸,有機(jī)氮對(duì)很多