水稻細(xì)菌性條斑病菌的pcr檢測(cè)

水稻細(xì)菌性條斑病菌的pcr檢測(cè)

水稻細(xì)菌帶的特征是由水稻科或硫加收引起的。在亞洲和國(guó)內(nèi)，由水稻生產(chǎn)引起的細(xì)菌水稻條件生殖，給水稻生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重影響。它的危害僅次于水稻的白葉枯萎。該病原菌可隨種子調(diào)運(yùn)而傳播,很多國(guó)家和地區(qū)已將其列為檢疫性細(xì)菌,并限制從疫區(qū)進(jìn)口水稻種子。目前已經(jīng)建立多種檢測(cè)手段對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌實(shí)施檢測(cè)。經(jīng)典的產(chǎn)地檢驗(yàn)、育苗生長(zhǎng)觀(guān)察法、選擇性分離、噬菌體檢測(cè)、致病性測(cè)定、免疫分離和血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)仍是各國(guó)現(xiàn)階段普遍采用和認(rèn)可的檢測(cè)技術(shù);PCR技術(shù)以其快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn),成為研究的熱點(diǎn),在各個(gè)領(lǐng)域包括植物檢疫方面得到廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展。已經(jīng)有PCR技術(shù)應(yīng)用于水稻細(xì)菌性條斑病菌的檢測(cè),但除了TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)之外,目前研制的其它PCR技術(shù)不能將其和水稻白葉枯病菌很好地區(qū)分開(kāi)。本文設(shè)計(jì)并合成檢測(cè)水稻細(xì)菌性條斑病菌的專(zhuān)化性引物,對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病菌及帶菌種子實(shí)施了專(zhuān)化性的檢測(cè)。1材料和方法1.1試驗(yàn)中的菌株和種子樣品供試細(xì)菌性條斑病菌、水稻白葉枯病菌菌株和其它參試菌株見(jiàn)表1。帶菌的水稻種子采自江蘇省泗洪縣自然病田和江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院人工接種試驗(yàn)田。1.2菌體的制備將供試菌株移于營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)斜面上,NA平板上劃線(xiàn)培養(yǎng)48h后,挑取單菌落在LB培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)(28℃、180r·min-1)24h。取培養(yǎng)菌液1.5mL,6000g離心5min,收集菌體。菌體用1mL0.01mol·L-1的PBS緩沖液(pH7.4)懸浮,再離心洗滌3次后,用1.5mLPBS緩沖液懸浮。所得菌液96℃處理5min后,冷凍保存?zhèn)溆?。振蕩培養(yǎng)的菌液同時(shí)用系列稀釋法測(cè)定菌液濃度。1.3電子轉(zhuǎn)移蛋白及跨膜蛋白基因的合成根據(jù)GenBank上登錄的水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的電子轉(zhuǎn)移黃蛋白α亞基和跨膜蛋白基因(AY319937、AY319941),經(jīng)序列比較,設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,由TaKaRa(大連)公司合成。1.4血清白蛋白、tween-20l-1l-1l-1l-1l-1l-1l-1313.4.4、8.2.4.4重組菌4.2.4和5u1.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4重組菌液8.2.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.4.反應(yīng)體積50μL:10×buffer5μL、25mmol·L-1MgCl23μL、25mmol·L-1dNTP1μL、20mg·mL-1牛血清白蛋白(BSA)2.2μL、1%Tween-200.6μL、20μmol·L-1引物各1μL、5U·μL-1Taq酶0.2μL、菌液4μL,滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50μL,混勻離心后加滅菌石蠟油1滴(約20μL)。1.5循環(huán)循環(huán)的選擇PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃5min;94℃30s,62℃1min,72℃1min,35個(gè)循環(huán);72℃10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳(80V、1h)后,溴化乙錠染色(20～30min),凝膠成像系統(tǒng)紫外光下觀(guān)察結(jié)果。1.6pcr檢測(cè)檢測(cè)取健康稻種和病種各50g,分別脫殼后,100mL無(wú)菌水4℃浸泡2h,浸泡液10000r·min-1離心10min,棄上清,重復(fù)2次,沉淀用無(wú)菌水定容至2mL,用建立的PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。2結(jié)果與分析2.1差異設(shè)計(jì)1對(duì)專(zhuān)化性引物的篩選將AY319937和AY319941利用GenBank通過(guò)序列分析比較,根據(jù)其位點(diǎn)差異設(shè)計(jì)1對(duì)專(zhuān)化性引物。XoocF:5′-ATATTGGGCTGGTGGGTGA-TC-3′和XoocR:5′-TTGGTACGCGATGCCCTTTGCGACGG-3′。利用這對(duì)引物,理論上可以從水稻細(xì)菌性條斑病菌中擴(kuò)增出1條338bp的片段。2.2稻條斑病菌的pcr檢測(cè)利用設(shè)計(jì)的引物和建立的PCR體系對(duì)供試的水稻條斑病菌、水稻白葉枯病菌和其它供試菌株進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果顯示:只能從供試的條斑病菌中擴(kuò)增出1條約350bp的條帶,白葉枯病菌和其它所有供試菌株均無(wú)擴(kuò)增信號(hào),說(shuō)明設(shè)計(jì)的引物和建立的PCR能夠?qū)；詸z測(cè)水稻條斑病菌,結(jié)果見(jiàn)圖1。由于參試菌株較多,除條斑病菌和白葉枯病菌外,圖1中只顯示了部分其它菌株的檢測(cè)情況,詳見(jiàn)圖注。2.3靈敏度測(cè)定結(jié)果將已知濃度的菌懸液按10倍倍比稀釋,制備5×107～5×10-1cfu·mL-1菌懸液,進(jìn)行靈敏度測(cè)定,當(dāng)菌懸液濃度為5×103cfu·mL-1時(shí),仍可以檢測(cè)到信號(hào),即該方法可以檢測(cè)到20個(gè)菌體,結(jié)果見(jiàn)圖2。2.4稻種抗菌劑多態(tài)性對(duì)1份健康稻種浸出液、3份自然發(fā)病和3份人工接種發(fā)病植株的稻種浸出液進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示,建立的PCR體系分別從2份自然發(fā)病和2份人工接種發(fā)病植株的稻種(當(dāng)年采集)浸出液中擴(kuò)增出條斑病菌的1條特異性條帶;對(duì)健康稻種浸出液沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào),另外2份病種(前一年采集)也未擴(kuò)增出信號(hào),結(jié)果見(jiàn)圖3。3白葉枯病菌和條斑病菌的pcr檢測(cè)與鑒定目前已有許多種檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于水稻白葉枯和細(xì)菌性條斑病害的檢驗(yàn)檢疫。傳統(tǒng)的產(chǎn)地檢驗(yàn)、育苗生長(zhǎng)觀(guān)察法和相關(guān)檢測(cè)技術(shù)由于靈敏度低和耗時(shí)長(zhǎng),已經(jīng)不能適應(yīng)新形勢(shì)下的植物檢疫;而對(duì)于選擇性分離,至今仍沒(méi)有分離水稻種子上條斑病菌理想的選擇性培養(yǎng)基;利用噬菌體技術(shù)檢測(cè)雖然具有簡(jiǎn)單快速的優(yōu)點(diǎn),但是由于噬菌體的專(zhuān)化性,容易造成假陰性以致漏檢;致病性測(cè)定法也具有季節(jié)條件的限制;血清學(xué)方法雖然靈敏、快速,但受限于抗血清的質(zhì)量和專(zhuān)化性,容易造成假陽(yáng)性。隨著分子檢測(cè)技術(shù)的興起,PCR技術(shù)以其特異、靈敏、快速和簡(jiǎn)便等突出優(yōu)點(diǎn)在植物檢疫方面得到了廣泛應(yīng)用與迅猛發(fā)展。目前已發(fā)展了多種不同的PCR檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于水稻白葉枯病菌和條斑病菌的檢測(cè)與鑒定。如TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法,通過(guò)所設(shè)計(jì)的2個(gè)特異性探針對(duì)水稻白葉枯病菌與水稻細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè),能分別特異性檢測(cè)到這2種病原菌。此方法雖然快速、準(zhǔn)確、靈敏,但是技術(shù)條件高,設(shè)備昂貴,普及推廣受到很大限制。已有文獻(xiàn)報(bào)道,通過(guò)專(zhuān)化性引物來(lái)檢測(cè)白葉枯病菌和條斑病菌,但是由于這2種病菌是水稻黃單胞菌的不同致病變種,在分子遺傳學(xué)上非常近似,研制的PCR檢測(cè)技術(shù)存在交叉反應(yīng),很難把白葉枯病菌和條斑病菌完全區(qū)分開(kāi)來(lái)。水稻細(xì)菌性條斑病和白葉枯病可以在同一植株甚至同一葉片上發(fā)生,因此,稻種上可能會(huì)同時(shí)帶有這2種病菌,需要準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)技術(shù)對(duì)這2種病菌進(jìn)行檢測(cè)和區(qū)分。本研究也試圖通過(guò)16S、23SrDNA和ITS序列比對(duì)來(lái)設(shè)計(jì)引物,但都沒(méi)有找到足夠的差異位點(diǎn),最終從GenBank上發(fā)現(xiàn)了水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌的電子轉(zhuǎn)移黃蛋