小麥葉銹菌pcr檢測體系的建立

小麥葉銹菌pcr檢測體系的建立

由小麥葉銹菌（purcsimatatima）引起的小麥葉銹病是世界干旱的主要原因，也是影響我國小麥安全生產(chǎn)的重要因素。由于小麥葉銹菌生理小種結(jié)構(gòu)復(fù)雜,主要毒性類型及毒性頻率不斷變化,生產(chǎn)上小麥品種的抗銹性喪失嚴(yán)重。因此,鑒定分析小麥葉銹菌生理小種(毒性類型)組成、系統(tǒng)監(jiān)測病菌群體的消長動態(tài),對于指導(dǎo)病害測報、抗病育種和品種布局具有重要意義。長期以來,小麥銹病的預(yù)測預(yù)報主要基于定期、大規(guī)模的田間病情調(diào)查和室內(nèi)病菌小種的活體分離、培養(yǎng)和鑒定。不僅耗時費工,而且其結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度也在很大程度上取決于調(diào)查測報人員的技術(shù)水平和經(jīng)驗,難以滿足快速、高通量診斷檢測的實際需求。葉銹病和條銹病的苗期癥狀區(qū)別不甚明顯,一些基層植物保護(hù)人員常常將二者混淆,不能準(zhǔn)確區(qū)分。在小麥葉銹菌的潛育階段,寄主的發(fā)病癥狀不易觀察,難以界定初侵染的時期和規(guī)模。因此,有必要利用現(xiàn)代生物技術(shù),研發(fā)簡單易行、靈敏準(zhǔn)確的小麥葉銹菌快速診斷和檢測手段。與傳統(tǒng)方法相比,DNA/RNA探針技術(shù)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)具有強(qiáng)專化性、高靈敏度以及程序化試驗操作等特點,現(xiàn)已被廣泛用于絲核菌Rhizoctoniasolani、R.oryzae、R.oryzae-sativae,炭疽菌Colletotrichumacutatum,多黏菌Polymyxabetae,黑粉菌Tilletiaindic、T.walkeri、Ustilagohordei,鐮刀菌Fusariumoxysporum、F.culmorum、F.graminearum、F.avenaceum,葉枯菌Stagonosporanodorum、Septoriatritici等多種植物病原真菌的鑒定檢測。近年來,隨著基因芯片和實時PCR技術(shù)的發(fā)展,基于特定基因序列開發(fā)的特異PCR引物或探針,已被越來越多地用在病原菌的生物學(xué)、群體結(jié)構(gòu)、流行動態(tài)、基因漂移等研究中。對病害診斷、病原菌鑒定而言,靶標(biāo)序列的獲得通常源自保守基因的序列比較或染色體組的隨機(jī)探查。真菌的β-微管蛋白基因(β-tubulingenes)序列比較保守,相對容易獲得基因全長序列或設(shè)計序列?；砸?在真菌檢測的應(yīng)用上僅次于RibosomalDNAs(rDNAs)。本研究以β-微管蛋白基因的保守區(qū)段為引物,以小麥葉銹菌、條銹菌等病原菌的基因組DNA為模板,進(jìn)行PCR比較擴(kuò)增,以期獲得小麥葉銹菌種的?；訮CR檢測引物及SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregion)標(biāo)記,用于病害的診斷、檢測和測報調(diào)查。1材料和方法1.1小麥病原菌真菌的繁殖供試真菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所小麥病害組提供。其中小麥葉銹菌夏孢子的繁殖在感病品種鄭州5389上進(jìn)行;小麥條銹菌、稈銹菌的夏孢子以及小麥白粉菌的菌絲、分生孢子均在銘賢169上繁殖;其它小麥病原真菌在鋪墊賽璐玢膜的PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。備用菌種在4℃冰箱內(nèi)暫存,或真空封存后于液氮內(nèi)長期保存。1.2小麥葉片和營養(yǎng)體病原菌dna的提取采用Villarue7b0al等的方法,略作改良。小麥3種銹菌和白粉菌gDNA分別提取自潛育期的感病小麥葉片和病原菌夏孢子或分生孢子,其它小麥病原真菌的gDNA則來源于營養(yǎng)體菌絲。感病小麥葉片或營養(yǎng)體菌絲直接用液氮冷凍研磨至粉狀,銹菌、白粉菌孢子則采用玻璃珠震蕩法破壁,其余DNA提取操作同常規(guī)。以適量RNase消化RNA后,采用紫外分光光度法測定gDNA的質(zhì)量與濃度。1.3pcr擴(kuò)增及測序PCR分析均在MJResearch,Inc.的PTC-220型PCR儀上進(jìn)行。引物BAF6(f):5′-ACCCACAACCGCCAACATGCGTGA-3′和BAF2(r):5′-CGTACCGGGCT-CGAGATCGACGAG-3′源自小麥葉枯菌Septorianodorum的β-微管蛋白基因的保守序列(EMBLS-56922)。小麥葉銹菌和條銹菌gDNA的PCR比較擴(kuò)增體系為25μL,其中包括10×PCRBuffer(Mg2+Plus)2.5μL,dNTPMixture(各2.5mmol/L)2.0μL,BAF6(f)(10μmol/L)1.5μL,BAF2(r)(10μmol/L)1.5μL,模板DNA(20ng/μL)1.0μL,TaKaRaTaq(5U/μL)0.5μL,ddH2O16.0μL。PCR反應(yīng)條件為:94℃5min,1個循環(huán);94℃30s,50℃30s,72℃90s,35個循環(huán);72℃5min1個循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5的瓊脂糖凝膠、0.5×TBE電泳緩沖液電泳分離,以ULTRA-URLETPRODUCTS凝膠成像系統(tǒng)記錄分析電泳譜型。在紫外燈下快速切取小麥葉銹菌的特異性PCR條帶,以深圳依諾金生物有限公司CatcherSpinGEK-050凝膠回收試劑盒回收純化,交北京奧科生物技術(shù)公司雙向測序。測序結(jié)果以NCBI的BasicLocalAlignmentSearchTool進(jìn)行序列拼接,得到特異性PCR片段的序列全長;繼而以BLASTN程序與GenBank、EMBL、DDBJ、PDB中的序列進(jìn)行同源性比對。1.4pcr檢測scar標(biāo)記檢測靈敏度的確定根據(jù)PCR比較擴(kuò)增獲得的特異性片段的全長序列,以Primer3.0軟件在線設(shè)計SCAR特異性引物,交北京賽百盛基因技術(shù)有限公司化學(xué)合成。通過進(jìn)一步優(yōu)化PCR反應(yīng)體系及循環(huán)條件,獲得小麥葉銹菌特異性的SCAR標(biāo)記。梯度稀釋葉銹菌模板DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,確定該SCAR標(biāo)記的檢測靈敏度。以小麥主要病原真菌即小麥條銹菌Pucciniastritiformis、稈銹菌Pucciniagraminis、赤霉菌Fusariumgraminearum、白粉菌Erysiphegraminis、紋枯菌Rhizoctoniacerealis、葉枯菌Alternariatriticina、根腐菌Cochliobolussativus、光腥黑粉菌Tilletiafoetida(Wallr.)Liro、矮腥黑粉菌TilletiacontroversaKühn為對照,檢測2005—2007年度采集的55個小麥葉銹菌標(biāo)樣,以確定該SCAR標(biāo)記在小麥葉銹菌檢測上的特異性。1.5噴滑石粉接種菌量以小麥葉銹菌菌株(070430)室內(nèi)苗期接種鄭州5389,接種菌量為5mg/盆,對照處理噴滑石粉。接種后,每24h取樣小麥葉片,以無菌水清洗葉面后,液氮速凍,儲存于-80℃,用于小麥銹病顯癥前葉銹菌的檢測。2結(jié)果與分析2.1特異性dna片段的鑒定用引物BAF6(f)和BAF2(r)組合對小麥葉銹菌和條銹菌的gDNA進(jìn)行PCR比較擴(kuò)增。結(jié)果表明,小麥葉銹菌具有長度為268bp的特異性DNA片段(圖1)。回收、純化該片段,雙向測序后進(jìn)行BLAST(bl2seq)拼接分析,獲得該特異性PCR片段的全長序列(GenBankaccessionEU084038)(圖2)。在線運行BLASTN程序表明,除兩端引物BAF6(f)和BAF2(r)外,該特異性PCR片段與GenBank、EMBL、DDBJ和PDB中的序列沒有同源性。2.2ssr標(biāo)記檢測根據(jù)小麥葉銹菌特異性DNA片段序列,以Primer3.0軟件在線設(shè)計葉銹菌的特異性擴(kuò)增引物,由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司化學(xué)合成。其引物名稱和序列為:BAFBY(f1):5′-CCTCCGATGTAGGCTGGAT-3′;BAFBY(f2):5′-CCGATGTAGGCTGGATCGTA-3′;BAFBY(r):5′-CTCATCAGGTAGCCCATCGT-3′。試驗中對檢測PCR的各項參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化:10×PCRBuffer2.5μL,MgCl2(25mmol/L)1.5μL,dNTPMixture(各2.5mmol/L)2.0μL,BAFBY(f1)/BAFBY(f2)(10μmol/L)1.5μL,BAFBY(r)(10μmol/L)1.5μL,模板DNA(20ng/μL)1.0μL,TaKaRaTaq(5U/μL)0.5μL,ddH2O14.5μL;PCR反應(yīng)條件為:94℃5min,1個循環(huán);94℃30s,60℃30s,72℃40s,35個循環(huán);72℃5min1個循環(huán)。用上述引物對葉銹菌菌株進(jìn)行擴(kuò)增結(jié)果表明:以引物組合BAFBY(f1)與BAFBY(r)擴(kuò)增,可得到長度為151bp的小麥條銹菌SCAR標(biāo)記;以引物組合BAFBY(f2)與BAFBY(r)擴(kuò)增,可得到長度為148bp的小麥葉銹菌SCAR標(biāo)記(圖3)。2.3小麥葉銹菌scr標(biāo)記檢測梯度稀釋葉銹菌模板DNA濃度為1.00pg/μL、2.50pg/μL、5.00pg/μL、10.00pg/μL、100.00pg/μL、1.00ng/μL、10.00ng/μL和100.00ng/μL,選用特異性引物BAFBY(f1)/BAFBY(r)進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明,從5.00pg/μL～100.00ng/μL的模板DNA中均檢測到長度為151bp的SCAR標(biāo)記,且模板DNA濃度越大,擴(kuò)增出的產(chǎn)物量越高(圖4)。以小麥主要病原菌(條銹、稈銹、赤霉、白粉、紋枯、葉枯、根腐、光腥、矮腥病菌)為對照,對供試的55個小麥葉銹菌菌株進(jìn)行回檢。結(jié)果表明,該SCAR標(biāo)記對小麥葉銹菌的檢測具有高度的?；?在所有參檢的小麥葉銹菌標(biāo)樣中均呈現(xiàn)陽性擴(kuò)增;而在對照的15個小麥條銹菌菌株、2個小麥稈銹菌株及其它小麥病原真菌中則沒有擴(kuò)增到該標(biāo)記(圖5)。2.4材料取樣方法以小麥葉銹菌菌株070430在室內(nèi)苗期接種鄭州5389,接種后每24h取樣。結(jié)果表明,引物組合BAFBY(f1)/BAFBY(r)及引物組合BAFBY(f2)/BAFBY(r)都可以在顯癥前的小麥葉片中成功地檢測到相應(yīng)的小麥葉銹菌SCAR標(biāo)記(圖6)。3小麥葉銹菌scr標(biāo)記的pcr檢測隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,PCR擴(kuò)增、核酸雜交、基因芯片、實時PCR等技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物病理學(xué)研究的各個領(lǐng)域,使病原物的鑒定檢測、病害發(fā)生流行動態(tài)監(jiān)測以及病原物毒性、適應(yīng)性或寄主品種抗性水平的評價更加簡單、迅捷。本研究以真菌β-微管蛋白基因的保守序列為引物,進(jìn)行小麥銹菌gDNA的PCR比較分析,發(fā)現(xiàn)小麥葉銹菌的特異性PCR片段,并設(shè)計了2對?；砸?成功獲得小麥葉銹菌的特異性SCAR標(biāo)記,其檢測的靈敏度可達(dá)5.00pg/μL模板DNA濃度水平。在檢測來自我國不同麥區(qū)的55個小麥葉銹菌標(biāo)樣中,該標(biāo)記均穩(wěn)定顯現(xiàn),而在小麥條銹、稈銹及其它麥類病原真菌上則沒有“污染性”擴(kuò)增,說明研發(fā)的小麥葉銹菌種的特異性SCAR標(biāo)記具有較高的可靠性。在此研究基礎(chǔ)上,可進(jìn)一步制備出小麥葉銹菌種的分子診斷、檢測試劑盒,供我國縣級以上植保植檢部門推廣應(yīng)用。小麥葉銹菌成功侵染寄主小麥后,一般需要9