海拉細(xì)胞與自噬

壹背景知識(shí)貳實(shí)驗(yàn)?zāi)康娜?shí)驗(yàn)過(guò)程肆實(shí)驗(yàn)結(jié)果伍實(shí)驗(yàn)討論第1頁(yè)/共16頁(yè)壹背景知識(shí)是一種人工培養(yǎng)，具有無(wú)限增殖能力的細(xì)胞。

海拉細(xì)胞1951年由蓋伊等從人子宮頸癌組織分離出來(lái)的株細(xì)胞。HeLa是原患者假名海倫·萊恩的縮寫(xiě)。第2頁(yè)/共16頁(yè)可以連續(xù)傳代；細(xì)胞株不會(huì)衰老致死，

并可以無(wú)限分裂下去；跟其他癌細(xì)胞相比，增

殖異常迅速；

感染性極強(qiáng)。特點(diǎn)第3頁(yè)/共16頁(yè)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)如何進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)?培養(yǎng)時(shí)又需要提供哪些必要條件呢？

從動(dòng)物機(jī)體中取出相關(guān)組織，將它們分散成單個(gè)細(xì)胞，然后放在適宜的培養(yǎng)基中，讓這些細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。概念第4頁(yè)/共16頁(yè)過(guò)程胚胎或幼齡動(dòng)物的組織器官細(xì)胞懸液10代細(xì)胞50代細(xì)胞剪碎胰蛋白酶洗滌、稀釋、分離原代培養(yǎng)用胰蛋白酶分散細(xì)胞，說(shuō)明細(xì)胞間的物質(zhì)主要是蛋白質(zhì)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的PH為7.2—7.4，此環(huán)境下胃蛋白酶（2.0）沒(méi)有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性較高。比老齡動(dòng)物的組織細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，有絲分裂旺盛。分化程度越低，增殖能力越強(qiáng)，越容易培養(yǎng)。動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)不能最終培養(yǎng)成生物體細(xì)胞增殖緩慢，核型可能變化動(dòng)物組織細(xì)胞間隙中含有一定量的彈性纖維等蛋白質(zhì)，將細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)起來(lái)形成具有一定彈性和韌性的組織和器官。貼壁生長(zhǎng)接觸抑制10代以內(nèi)，保持正常二倍體核型傳代培養(yǎng)第5頁(yè)/共16頁(yè)貳實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯咳狈ρ搴桶被岬呐囵B(yǎng)基中的海拉細(xì)胞與自噬的關(guān)系。第6頁(yè)/共16頁(yè)叁實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)驗(yàn)材料：培養(yǎng)基（10%胎牛血清，0.005M的小蘇打，0.015MTRICINE緩沖液，100單位毫升的青霉素100mg/ml的鏈霉素）；實(shí)驗(yàn)儀器：塑料Falcon玻璃管（25平方厘米和75平方厘米）第7頁(yè)/共16頁(yè)實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞制備細(xì)胞包埋細(xì)胞固定光鏡定位和超薄切片第8頁(yè)/共16頁(yè)保持細(xì)胞的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，一直進(jìn)行五次傳代培養(yǎng)，每次當(dāng)細(xì)胞貼壁時(shí)快速更換培養(yǎng)基，得到大量的海拉細(xì)胞。細(xì)胞制備細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組：用缺乏氨基酸，血清的培養(yǎng)基潤(rùn)洗玻璃管兩次，然后每60分鐘，抽出培養(yǎng)基，立即用新鮮的培養(yǎng)基替換。對(duì)照組：培養(yǎng)基中包含10%胎牛血清以及所有必需氨基酸的組分，在最后三次被以相同方式固定的傳代培養(yǎng)后不再用新鮮培養(yǎng)基潤(rùn)洗、喂養(yǎng)。第9頁(yè)/共16頁(yè)細(xì)胞固定實(shí)驗(yàn)組：在缺陷培養(yǎng)基中培養(yǎng)1,3,6,12,以及24個(gè)小時(shí)之后，多層單層培養(yǎng)在室溫下塑料瓶中被固定為30分鐘。對(duì)照組：巴比妥乙酸鹽緩沖液中在pH4.7梯度乙醇溶液中脫水前用0.5％醋酸雙氧鈾染色細(xì)胞的固定單層細(xì)胞。細(xì)胞包埋在三次環(huán)氧丙烷洗滌之后，細(xì)胞將會(huì)被環(huán)氧樹(shù)脂812浸透，經(jīng)過(guò)分離，被放置到填充有環(huán)氧樹(shù)脂（杜邦）的BEEM膠囊里去。光鏡定位和超薄切片已分離的細(xì)胞層聚合塊進(jìn)行單層細(xì)胞原位超薄切片，用醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，觀察酸性磷酸酶反應(yīng)的產(chǎn)物。第10頁(yè)/共16頁(yè)伍實(shí)驗(yàn)討論在缺乏血清和氨基酸培養(yǎng)的海拉細(xì)胞中，觀察到自噬液泡的數(shù)量在以驚人的速度增加。這個(gè)細(xì)胞自噬模型可以用來(lái)進(jìn)一步研究控制自噬的機(jī)制：海拉細(xì)胞顯然能夠通過(guò)消化自己的細(xì)胞質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)剝奪。一種觀點(diǎn)：第11頁(yè)/共16頁(yè)另一種觀點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，自噬泡以相同的速度形成，但由于實(shí)驗(yàn)組中缺乏氨基酸和血清，導(dǎo)致次級(jí)溶酶體中的酸性水解酶活性降低。故自噬溶酶體內(nèi)的內(nèi)源性物質(zhì)被溶酶體的酶消化分解的速度減慢，自噬小泡將持續(xù)更長(zhǎng)時(shí)間，所以造成了一種自噬小泡增多的假象。存在假說(shuō)：海拉細(xì)胞的自噬可以提供氨基酸來(lái)合成必需的酶和ATP的底物。因此，這個(gè)自噬將代表著一種細(xì)胞生存機(jī)制。第12頁(yè)/共16頁(yè)細(xì)胞凋亡：是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。核染色質(zhì)的存在是區(qū)分細(xì)胞凋亡和自噬作用最有益的標(biāo)準(zhǔn);第13頁(yè)/共16頁(yè)異噬：細(xì)胞外物質(zhì)（如作為營(yíng)養(yǎng)成分的大分子顆粒物質(zhì)、細(xì)菌、病毒等）經(jīng)吞噬作用或吞飲作用進(jìn)入細(xì)胞，形成吞噬體或吞飲泡。這些異物吞噬液泡很容易區(qū)分,因?yàn)樗麄儽容^大,都沒(méi)有常見(jiàn)于