細(xì)胞工程學(xué)復(fù)習(xí)題

《細(xì)胞工程學(xué)》復(fù)習(xí)一、名詞解釋（20分，10題，每小題2分）（2個(gè)左右英文）二、填空（20分，40空，每空0.5分）三、選擇題（10分，10題，每小題1分）四、簡(jiǎn)答題（30分，6題）五、問(wèn)答題（20分，2-3題）一、名詞解釋。（植物：）細(xì)胞工程：細(xì)胞工程學(xué)(cellengineering,cytochnology):應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)辦法，在細(xì)胞水平上研究改造生物遺傳特性，以獲得新的有用性狀的細(xì)胞系或生物體的有關(guān)理論和技術(shù)辦法的學(xué)科?！舅且陨锛?xì)胞、組織或器官為研究對(duì)象，運(yùn)用工程學(xué)原理，按照預(yù)定目的，變化生物性狀，生產(chǎn)生物產(chǎn)品，為人類(lèi)生產(chǎn)或生活服務(wù)的科學(xué)?！考?xì)胞全能性(totipotency)：是指每一種活細(xì)胞都含有產(chǎn)生一種完整個(gè)體的全套基因，在適宜的條件下，細(xì)胞含有發(fā)育成完整個(gè)體的潛在能力。細(xì)胞脫分化(dedifferentiation)：培養(yǎng)條件下使一種已分化的細(xì)胞回復(fù)到原始無(wú)分化狀態(tài)或分生細(xì)胞狀態(tài)的過(guò)程就是細(xì)胞脫分化。（或：當(dāng)繼代培養(yǎng)時(shí)，將原培養(yǎng)物切割或不切割轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基中的材料稱為外植體。）外植體(explant)：是指用于離體培養(yǎng)的活的植物組織、器官等材料。【從植物體上分離下來(lái)的，用于初代離體培養(yǎng)的材料?！浚ㄓ鷤M織(callus)：脫分化后的細(xì)胞，往往通過(guò)細(xì)胞分裂形成一團(tuán)無(wú)特定構(gòu)造和功效的松散的薄壁細(xì)胞團(tuán)，稱為愈傷組織。或：在許多狀況下，幼胚在離體培養(yǎng)中首先發(fā)生細(xì)胞增殖，形成愈傷組織。普通來(lái)講由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種胚性愈傷組織很容易分化形成植株。）胚狀體：離體培養(yǎng)下沒(méi)有通過(guò)受精過(guò)程，但通過(guò)了胚胎發(fā)育過(guò)程所形成的胚的類(lèi)似物（不管培養(yǎng)的細(xì)胞是體細(xì)胞還是生殖細(xì)胞），統(tǒng)稱為體細(xì)胞胚或胚狀體（不定胚、無(wú)性胚）體細(xì)胞胚：是指在植物組織培養(yǎng)中來(lái)源于一種非合子細(xì)胞，經(jīng)胚胎發(fā)育所形成的胚狀構(gòu)造。（見(jiàn)胚狀體）體細(xì)胞無(wú)性系變異（somaclonalvariation）：由任何形式的細(xì)胞培養(yǎng)所產(chǎn)生的植株統(tǒng)稱為體細(xì)胞無(wú)性系（somaclones）。這些植株所體現(xiàn)出來(lái)的變異稱之為體細(xì)胞無(wú)性系變異。間接篩選：是借助與突變體表型有某種有關(guān)特性作指標(biāo)進(jìn)行篩選的辦法。（直接篩選：是指運(yùn)用在選擇條件下細(xì)胞突變體可優(yōu)先生長(zhǎng)的特點(diǎn)進(jìn)行的篩選。）體細(xì)胞雜交：體細(xì)胞雜交，即原生質(zhì)體融合（protoplastfusion），指在人工控制條件下，不通過(guò)有性過(guò)程，兩種體細(xì)胞原生質(zhì)體互相融合產(chǎn)生雜種的辦法。誘發(fā)融合（inducedfusion）：指應(yīng)用某種誘變劑造成原生質(zhì)體融合的辦法。（四種融合形式：異核體或異核細(xì)胞，雜種原生質(zhì)體或合子細(xì)胞，同核體，非對(duì)稱雜種過(guò)細(xì)胞質(zhì)雜種。）【附詞：細(xì)胞融合類(lèi)型：（1）同核體（homokaryon）：同源原生質(zhì)體的融合體。自體融合。（2）異核體（heterokaryon）：非同源原生質(zhì)體的融合體。普通是親源關(guān)系較近的細(xì)胞，這種親和雜種細(xì)胞含有雙親全部細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)，其發(fā)育成個(gè)體的也是可能的。如煙草屬種間的細(xì)胞雜種。（3）多核體（polykaryon）：含有雙親不同比例核物質(zhì)的融合體。普通是親源關(guān)系較遠(yuǎn)的細(xì)胞間融合，融合體以一種細(xì)胞的核物質(zhì)為主，只加入另一細(xì)胞少量遺傳物質(zhì)。例：胡蘿卜與羊角芹形成部分親和的雜種細(xì)胞。（4）異胞質(zhì)體（heterocybrid）：胞質(zhì)體×有核的原生質(zhì)體→異胞質(zhì)體細(xì)胞雜種（含本種的細(xì)胞核，及異種的細(xì)胞質(zhì)）。矮牽牛×爬山虎。核：爬山虎，質(zhì)：雙親（即有爬山虎、又有矮牽牛）。（5）嵌合細(xì)胞雜種：不同種的雙親原生質(zhì)體、發(fā)生膜融合和胞質(zhì)融合后，尚未發(fā)生核融合，雙親的細(xì)胞核各自發(fā)生核分裂，接著形成細(xì)胞壁，最后形成嵌合體植物?！浚ㄗ园l(fā)融合（spontaneousfusion）：當(dāng)細(xì)胞壁被溶解后，胞間連絲發(fā)生膨大，相鄰細(xì)胞原生質(zhì)和細(xì)胞器通過(guò)膨大的胞間連絲融合形成同核體，實(shí)現(xiàn)原生質(zhì)體的自發(fā)融合，這種融合僅限于同一物種內(nèi)。）非對(duì)稱融合（symmetricfusion）：運(yùn)用物理或化學(xué)辦法使某親本的核或細(xì)胞質(zhì)失活后再進(jìn)行融合。（對(duì)稱融合（asymmetricfusion）：即兩個(gè)完整的細(xì)胞原生質(zhì)體融合。（自體融合、異體融合））異核體：（見(jiàn)誘發(fā)融合）花藥培養(yǎng)（Antherculture）：指將成熟或未成熟的花藥從母體植株上取下，放在無(wú)菌的條件下，使其進(jìn)一步生長(zhǎng)、發(fā)育成單倍體細(xì)胞或植株的技術(shù)。（花藥培養(yǎng)，屬于器官培養(yǎng)范疇。）【指離體培養(yǎng)花粉和花藥，使小孢子變化原有的配子體發(fā)育途徑，轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，形成花粉胚或花粉愈傷組織，最后形成花粉植株，并從中鑒定出單倍體植株，使之二倍化的細(xì)胞工程技術(shù)?！浚ɑǚ叟囵B(yǎng)也稱為小孢子培養(yǎng)(microsporeculture)，屬于細(xì)胞培養(yǎng)的范疇。）條件培養(yǎng)基（conditionedmedium）：在培養(yǎng)過(guò)程中，有些細(xì)胞可能會(huì)分泌活性物質(zhì)到培養(yǎng)液中，這種培養(yǎng)過(guò)某種細(xì)胞后來(lái)，含有細(xì)胞分泌物的培養(yǎng)液稱為條件培養(yǎng)基。（或：生長(zhǎng)過(guò)愈傷組織或懸浮細(xì)胞的液體培養(yǎng)基。）（條件培養(yǎng)基即預(yù)先培養(yǎng)過(guò)適宜花藥的培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)實(shí)質(zhì)上是一種花粉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)辦法，與普通細(xì)胞懸浮培養(yǎng)辦法的不同之處在于，在液體培養(yǎng)基中加入了一定濃度的條件培養(yǎng)基，條件培養(yǎng)基普通是花藥提取液。）看護(hù)培養(yǎng)（nurseculture）：在固體培養(yǎng)基上置入一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織，再在愈傷組織上放一種小片濾紙，待濾紙濕潤(rùn)后將細(xì)胞接種于濾紙上，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)出微小細(xì)胞團(tuán)后，將其直接轉(zhuǎn)至瓊脂培養(yǎng)基上讓其快速生長(zhǎng)。（是用一塊活躍生長(zhǎng)的愈傷組織來(lái)增進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞持續(xù)分裂增殖的辦法。）微室培養(yǎng)（micro-chamberculture）：是在人工制造的無(wú)菌小室中，將一滴懸浮細(xì)胞液培養(yǎng)在少量培養(yǎng)基上，使其分裂增殖形成細(xì)胞團(tuán)的辦法，又稱微室懸滴培養(yǎng)。它是為進(jìn)行單細(xì)胞活體持續(xù)觀察而建立的單細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，運(yùn)用這種技術(shù)可對(duì)單細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞分裂的全過(guò)程、胞質(zhì)環(huán)流的規(guī)律等進(jìn)行活體持續(xù)觀察。這一辦法同樣也可用于原生質(zhì)體培養(yǎng)，用于觀察細(xì)胞壁的再生與細(xì)胞分裂過(guò)程。微室培養(yǎng)是細(xì)胞學(xué)研究的優(yōu)良實(shí)驗(yàn)體系。植板率：每個(gè)平板形成的細(xì)胞團(tuán)數(shù)和每個(gè)平板上接種的細(xì)胞團(tuán)數(shù)比值?！局舶迓剩菏悄荛L(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的單細(xì)胞在接種單細(xì)胞中所占的比例，或：長(zhǎng)出細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞占接種細(xì)胞總數(shù)的比例?！颗咛ヅ囵B(yǎng)（embryoculture）：從卵殼內(nèi)或種子中摘出分離的動(dòng)、植物胚胎在適宜的實(shí)驗(yàn)條件下使之生長(zhǎng)發(fā)育的技術(shù)。（是指使胚或具胚器官（如子房、胚珠等）在離體無(wú)菌條件下發(fā)育成幼苗的技術(shù)。廣義胚胎培養(yǎng)研究還涉及胚珠培養(yǎng)和試管受精等技術(shù)。）早熟萌發(fā)(earlymaturesprouting)∕precociousgermination：幼胚在培養(yǎng)中越過(guò)正常胚發(fā)育階段，在未達(dá)成生理和形態(tài)成熟時(shí)快速萌發(fā)長(zhǎng)成幼苗，這一現(xiàn)象稱早熟萌發(fā)。（或：幼胚接種后，離體胚不繼續(xù)胚性生長(zhǎng)，而是在培養(yǎng)基上快速萌發(fā)成幼苗，普通稱之為早熟萌發(fā)。）離體授粉(invitropollination)：在無(wú)菌條件下，培養(yǎng)未授粉的子房或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)進(jìn)入胚珠，完畢受精作用。因全過(guò)程，即從花粉萌發(fā)到精卵細(xì)胞融合受精形成種子，直到種子萌發(fā)產(chǎn)生幼苗，均在試管內(nèi)完畢，也稱為離體受精或植物生殖工程。人工種子（Artificialseed）：是指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體或不定芽包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功效的人工胚乳和人工中皮中所形成的能發(fā)芽出苗的顆粒體。人工種子亦稱體細(xì)胞種子。早期的人工種子概念是：體細(xì)胞胚通過(guò)人工種皮包被后而形成的體細(xì)胞種子。任何一種經(jīng)人工種皮包被或裸露的，含有形成完整植株能力的繁殖體均可稱之為人工種子。離體無(wú)性繁殖(propagationinvitro)：植物離體無(wú)性繁殖簡(jiǎn)稱離體繁殖（invitropropagation）、微型繁殖（micropropagation）或快速繁殖（rapidclonepropagation），是指運(yùn)用組織培養(yǎng)辦法進(jìn)行植物離體培養(yǎng)，在短時(shí)間內(nèi)獲得大量遺傳性一致個(gè)體的辦法。（離體無(wú)性繁殖是在人工控制的無(wú)菌條件下，使植物在人工培養(yǎng)基上繁殖的技術(shù)。）植物脫毒：就是運(yùn)用物理辦法、化學(xué)辦法、生物辦法等辦法，脫除植物所感染的病毒，在超凈無(wú)菌的條件下培養(yǎng)不帶病菌的植株，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，快速繁育和生產(chǎn)出無(wú)病毒的種苗、種薯、應(yīng)運(yùn)于大田生產(chǎn)?！居扇斯び梦锢?、化學(xué)和生物辦法將植物體組織器官病原體消除，以使這些組織器官生成完整植株。】（動(dòng)物：）【附詞：細(xì)胞系(cellline)：原代培養(yǎng)物經(jīng)初次傳代成功后即成細(xì)胞系。有限細(xì)胞系(finitecellline)：如果細(xì)胞系不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，它由原代培養(yǎng)中的許多細(xì)胞系列構(gòu)成。持續(xù)細(xì)胞系(continuouscellline)：如細(xì)胞系可持續(xù)傳代，即已建成的細(xì)胞系(establistedcellline)。細(xì)胞系的轉(zhuǎn)化：細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生與原代細(xì)胞形態(tài)、抗原、增殖或其它特性的可遺傳的變化。體外惡性轉(zhuǎn)化(invitromalignanttransformation)：細(xì)胞在體外培養(yǎng)過(guò)程中獲得了致瘤性，當(dāng)把這種細(xì)胞接種于適宜的動(dòng)物，能夠產(chǎn)生腫瘤?！吭囵B(yǎng)(primaryculture)：動(dòng)物細(xì)胞離體培養(yǎng)起始物，我們稱之為原代培養(yǎng)。是指從機(jī)體獲得材料開(kāi)始，在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)至第一代傳代前的這一過(guò)程。傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)的過(guò)程也就是細(xì)胞系建立的過(guò)程。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底之后，無(wú)論與否稀釋，將細(xì)胞從一種容器轉(zhuǎn)移到另一種容器中的培養(yǎng)稱為傳代培養(yǎng)，簡(jiǎn)稱傳代。永久細(xì)胞系：（見(jiàn)附詞）通過(guò)30~50次傳代，只有少數(shù)細(xì)胞系發(fā)生了轉(zhuǎn)化，獲得永久性，能夠度過(guò)這一死亡“危機(jī)”，從而在體外永久存活下來(lái)，成為持續(xù)性細(xì)胞系（continuouscellline），或稱已建立的細(xì)胞系（establishedcellline），或稱永生性細(xì)胞系（immortalcellline）。【大多數(shù)細(xì)胞系在有限的代數(shù)內(nèi)以不變的形式增殖，當(dāng)超出有限世代后，在體外永久存活下來(lái)發(fā)育成永久細(xì)胞系或稱持續(xù)細(xì)胞系?！坑邢藜?xì)胞系(finitecellline)：（見(jiàn)附）經(jīng)傳代培養(yǎng)后即成為有限細(xì)胞系。有限細(xì)胞系：多數(shù)二倍體細(xì)胞系，最多在體外生存一年左右，傳代30~50次，就衰老死亡了，這種傳代次數(shù)有限的細(xì)胞系稱為有限細(xì)胞系。【經(jīng)繼代培養(yǎng)后細(xì)胞系即使培養(yǎng)條件均能滿足細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)，它們也只能在有限的時(shí)間內(nèi)生存，通過(guò)運(yùn)動(dòng)世代后細(xì)胞將逐步死亡。】。體外轉(zhuǎn)化(invitrotransformation)：有限細(xì)胞系轉(zhuǎn)換成永久細(xì)胞系的過(guò)分期稱為轉(zhuǎn)換期(crisis)，其轉(zhuǎn)換過(guò)程在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中稱為體外轉(zhuǎn)化。玻璃化凍存：玻璃化是指液體轉(zhuǎn)變?yōu)榉蔷B(tài)（玻璃態(tài)）的固化過(guò)程。玻璃態(tài)固體分子之間的空間排列和液態(tài)相比無(wú)明顯變化。玻璃化研究的核心是：1.尋找容易實(shí)現(xiàn)玻璃化并且對(duì)細(xì)胞損害較少的溶液。2.設(shè)法提高冷凍速度。（加緊降溫速度，使細(xì)胞內(nèi)水凍結(jié)冰晶體積非常小，出現(xiàn)玻璃狀的凍結(jié)現(xiàn)象，從而也可使細(xì)胞免受傷害，達(dá)成細(xì)胞凍存的目的。）（非玻璃化凍存：采用緩慢降溫和快速?gòu)?fù)蘇的辦法以及在凍存液中加入冷凍保存劑，盡量減少細(xì)胞的冰晶損傷和溶質(zhì)損傷，提高復(fù)蘇后細(xì)胞的活力。）貼壁培養(yǎng)（adherentculture）(anchorage-dependentculture)：貼壁培養(yǎng)是讓細(xì)胞貼附于適宜基質(zhì)上進(jìn)行增殖培養(yǎng)的辦法，它合用于一切貼壁依賴性細(xì)胞以及兼性貼壁細(xì)胞。懸浮培養(yǎng)(suspensionculture)：細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長(zhǎng)與增殖的培養(yǎng)技術(shù)。它合用于非貼壁依賴性細(xì)胞，也可用于兼性貼壁細(xì)胞。其操作辦法與植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)相似?！臼羌?xì)胞培養(yǎng)的基本辦法，是將單個(gè)游離細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。】細(xì)胞同時(shí)化：在普通培養(yǎng)條件下，群體中的細(xì)胞處在不同的細(xì)胞周期時(shí)相之中。為了研究某一時(shí)相細(xì)胞的代謝、增殖、基因體現(xiàn)或凋亡，常需采用某些辦法使細(xì)胞處在細(xì)胞周期的同一時(shí)相，這就是細(xì)胞同時(shí)化技術(shù)。選用DNA合成克制劑可逆地克制S期細(xì)胞DNA合成而不影響其它細(xì)胞周期運(yùn)轉(zhuǎn)，最后可將細(xì)胞群體阻斷在G1／S期交界處；某些克制微管聚合的藥品，因克制有絲分裂裝置的形成和功效行使，可將細(xì)胞阻斷在有絲分裂中期，即使細(xì)胞同時(shí)于M期。ES細(xì)胞（胚胎干細(xì)胞）（embryonicstemcell，ES）：干細(xì)胞（stemcell）是一類(lèi)含有自我復(fù)制能力（self-renewing）的多潛能細(xì)胞，它能夠分化成多個(gè)功效細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞又稱為多能干細(xì)胞（pluripotentstemcell，PSC），是胚胎或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外克制分化培養(yǎng)后，篩選出的含有發(fā)育全能性的細(xì)胞，是已知的分化潛能最廣的一類(lèi)干細(xì)胞。細(xì)胞雜交（cellhybridization）：指用人工辦法把不同類(lèi)型的兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并成一種細(xì)胞的技術(shù)。所得到的融合細(xì)胞叫雜交細(xì)胞。（細(xì)胞融合（cellfusion）：通過(guò)培養(yǎng)和誘導(dǎo)，將兩個(gè)或兩個(gè)以上細(xì)胞合并成一種雙核或多細(xì)胞的技術(shù)。）重組細(xì)胞(reconstitutedcell)：胞質(zhì)體和核體融合起來(lái)形成重組細(xì)胞。（細(xì)胞重組（cellreconstruction）：將細(xì)胞融合技術(shù)與細(xì)胞核質(zhì)分離技術(shù)結(jié)合，即在融合介質(zhì)誘導(dǎo)下，使胞質(zhì)體與完整細(xì)胞合并，重新構(gòu)成胞質(zhì)雜種細(xì)胞的過(guò)程。涉及核移植和染色體轉(zhuǎn)移等。）在離心過(guò)程中，細(xì)胞核及其外面包圍的少量細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜由細(xì)胞中央部位向外突出，直至脫離細(xì)胞而成為核體。剩余的無(wú)核部分稱為胞質(zhì)體。胞質(zhì)體（cytoplast）：又叫無(wú)核細(xì)胞（anucleatecell），由完整細(xì)胞的絕大部分細(xì)胞質(zhì)構(gòu)成，外面包有細(xì)胞膜。（胞質(zhì)體：不含細(xì)胞核而僅含有部分細(xì)胞質(zhì)的原生質(zhì)體。）核體（karyoplast）：又叫小型細(xì)胞（minicell），含有完整細(xì)胞核，外面包圍著少量細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。（核質(zhì)體：由原生質(zhì)膜和薄層細(xì)胞質(zhì)包圍細(xì)胞核形成的小原生質(zhì)體。也稱為微小原生質(zhì)體(miniprotoplast)。）微細(xì)胞：動(dòng)物細(xì)胞經(jīng)秋水仙素（colchicine）解決后，細(xì)胞核可分裂成若干個(gè)分別含有幾條甚至一條染色體的微核（micronucleus），再經(jīng)CB（細(xì)胞松弛素B）解決和離心作用，微核便從細(xì)胞質(zhì)中分離出來(lái)，形成外面包有細(xì)胞膜和少量細(xì)胞質(zhì)的微細(xì)胞。雜交瘤技術(shù)（hybridomatechnology）：也叫單克隆抗體技術(shù)（monoclonalantibodytechnology）。（百度：即淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，又稱單克隆抗體技術(shù)。它是在體細(xì)胞融合技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的?？死眨↘ohler）和米爾斯坦（Milstein）（1975）證明，骨髓瘤細(xì)胞與免疫的動(dòng)物脾細(xì)胞融合，形成能分泌針對(duì)該抗原的均質(zhì)的高特異性的抗體——單克隆抗體，這種技術(shù)通稱為雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)的基礎(chǔ)是細(xì)胞融合技術(shù)。骨髓瘤細(xì)胞在體外能夠持續(xù)傳代，而脾細(xì)胞是終末細(xì)胞，不能在體外繁殖。如將小鼠的骨髓瘤細(xì)胞與分泌某種抗體或因子的淋巴細(xì)胞融合，則融合細(xì)胞既含有腫瘤細(xì)胞無(wú)限繁殖的特性，又含有淋巴細(xì)胞能分泌特異性抗體或因子的能力，同時(shí)也克服了免疫淋巴細(xì)胞不能在體外繁殖的缺點(diǎn)，融合的細(xì)胞稱為淋巴細(xì)胞雜交瘤。）（單克隆抗體：一種漿細(xì)胞只產(chǎn)生一種類(lèi)型的免疫球蛋白分子。從一種單克隆細(xì)胞產(chǎn)生的抗體分子，即稱為單克隆抗體，其含有獨(dú)特的均一構(gòu)造。）（雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體的重要環(huán)節(jié)涉及：（1）抗原制備；（2）免疫動(dòng)物；（3）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；（4）細(xì)胞融合；（5）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；（6）雜交瘤細(xì)胞的篩選；（7）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；（8）單克隆抗體的檢定；（9）分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；（10）單克隆抗體的大量制備。）（雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)：既含有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力，又能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外長(zhǎng)久快速無(wú)限增殖的細(xì)胞。（或：雜交瘤細(xì)胞是在制備單克隆抗體過(guò)程中，用骨髓瘤細(xì)胞和B細(xì)胞融合而成的細(xì)胞。））互補(bǔ)選擇：是指運(yùn)用兩個(gè)親本含有不同遺傳和生理特性，在特定培養(yǎng)條件下，只有發(fā)生互補(bǔ)作用的雜種細(xì)胞才干生長(zhǎng)的選擇辦法。接觸克制(contactinhibition)：當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，形成持續(xù)性細(xì)胞單層后，細(xì)胞就不再分裂而停止增殖，這種現(xiàn)象叫接觸克制。（或：當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐步匯合成片形成持續(xù)性細(xì)胞單層后，即每個(gè)細(xì)胞與其周邊的細(xì)胞互相接觸時(shí)，細(xì)胞擴(kuò)展運(yùn)動(dòng)停止，細(xì)胞就不再分裂而停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱之為接觸克制。）（密度克制（densityinhibition）：當(dāng)細(xì)胞的數(shù)量達(dá)成一定量后，細(xì)胞的增殖受到克制，生長(zhǎng)速度減緩，出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)的密度克制現(xiàn)象。（或：當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，達(dá)成一定密度時(shí)，營(yíng)養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分下降，有毒代謝產(chǎn)物積累，細(xì)胞就停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱之為密度克制現(xiàn)象。））胚胎分割（embryosplitting）：用顯微術(shù)將未著床的早期胚胎一分為二，一分為四或更多次地分割，然后分別移植給受體，妊娠產(chǎn)生多個(gè)遺傳性狀相似的后裔的克隆辦法。（胚胎分割（多細(xì)胞復(fù)制）：將未著床的早期胚胎經(jīng)顯微手術(shù)后，分割成多等份，給每個(gè)受體內(nèi)植入一塊分割物而妊娠產(chǎn)仔的辦法，一種胚胎克隆多個(gè)遺傳性能完全同樣的后裔個(gè)體。）克?。╟lone）：通過(guò)無(wú)性繁殖的手段，從一種動(dòng)物細(xì)胞獲得遺傳背景相似的細(xì)胞群或個(gè)體群的過(guò)程?？寺』海ò俣龋和ㄟ^(guò)人為選擇，獲得在遺傳上純一的后裔的技術(shù)或過(guò)程。專指普通DNA在與載體DNA分子重組后，重組DNA分子由載體導(dǎo)入寄主細(xì)胞內(nèi)，依賴載體的復(fù)制能力在寄主細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成一種無(wú)性繁殖系的過(guò)程。）二、問(wèn)答題。1.植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室的基本構(gòu)成與規(guī)定。答：基本實(shí)驗(yàn)室：準(zhǔn)備室：進(jìn)行一切與實(shí)驗(yàn)有關(guān)的準(zhǔn)備工作，進(jìn)行藥品的保存、配備、消毒、分裝等。器具的洗滌、干燥、消毒，生理生化指標(biāo)的測(cè)定等。規(guī)定寬敞明亮，通風(fēng)條件好。分為洗滌區(qū)、滅菌區(qū)、貯藏區(qū)和培養(yǎng)基配制區(qū)。接種室：進(jìn)行無(wú)菌操作，材料的接種。規(guī)定封閉性好，干燥清潔，能較長(zhǎng)時(shí)間保持無(wú)菌。為了保持清潔，接種室應(yīng)避免空氣對(duì)流。外設(shè)緩沖間—放置拖鞋，工作服，工作帽等。分為緩沖準(zhǔn)備區(qū)、接種區(qū)。培養(yǎng)室：對(duì)離體植物材料進(jìn)行控制無(wú)菌培養(yǎng)。其首要規(guī)定是要能控制光照和溫度，另首先為避免微生物感染，培養(yǎng)室應(yīng)保持干燥和清潔?？筛鶕?jù)培養(yǎng)規(guī)模，分為若干個(gè)培養(yǎng)室。細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室：進(jìn)行培養(yǎng)材料的組織學(xué).細(xì)胞學(xué).觀察攝影等。規(guī)定清潔、明亮、干燥，使多個(gè)光學(xué)儀器不受潮濕和灰塵污染。生化分析室：在以培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)物為重要目的的實(shí)驗(yàn)室中，應(yīng)建立對(duì)應(yīng)的分析化基本設(shè)備配備驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室，方便于對(duì)培養(yǎng)物的有效成分隨時(shí)進(jìn)行取樣檢查。2.（植物細(xì)胞）培養(yǎng)基的構(gòu)成成分有哪幾類(lèi)，在離體培養(yǎng)基中的功效是什么？答：培養(yǎng)基基本成分：水：水既是培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的溶劑，又是培養(yǎng)基的重要構(gòu)成部分，它占培養(yǎng)基成分的95％。原生質(zhì)體培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)以及分生組織培養(yǎng)普通應(yīng)使用雙蒸水或超純水。如果是大批量的快速繁殖培養(yǎng)，則可使用普通蒸餾水或純凈水以減少生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效益。無(wú)機(jī)鹽類(lèi)大量元素：培養(yǎng)基的使用量普通在每升幾十至幾千毫克。涉及C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。微量元素：微量元素的用量普通低于10-5～10-7g分子濃度。有Fe、Cu、Zn、B、Mo、Mn、Co。糖：是碳源和能源，多運(yùn)用蔗糖。維生素：B1是必需的，B6、煙酸等，原生質(zhì)培養(yǎng)含有大多數(shù)基本維生素。氨基酸：細(xì)胞原生質(zhì)培養(yǎng)特別需要，水解酪蛋白。激素：細(xì)胞分裂素--BA（6－芐基酰嘌呤）、KT（激動(dòng)素，糠基酰嘌呤）、ZT（玉米素）、2iP（異戊烯酰嘌呤，生長(zhǎng)素--2.4-D，IAA，NAA，赤霉素：GA3，乙烯及乙烯克制。瓊脂、卡拉膠：固體培養(yǎng)?；钚蕴浚罕苊馔庵搀w變褐。附加復(fù)合成分：椰子汁、酵母提取液。3.植物離體培養(yǎng)的環(huán)境條件及對(duì)培養(yǎng)的影響。答：光照：組織培養(yǎng)普通在散射光線下進(jìn)行。有些植物組織在暗處生長(zhǎng)較好，而另某些植物組織在光亮處生長(zhǎng)較好，但由愈傷組織分化成器官時(shí)，則每日必須要有一定時(shí)間的光照才干形成芽和根（光照時(shí)間影響植株再生狀態(tài)）。溫度：在大多數(shù)狀況下，適溫有助于細(xì)胞分裂，即能夠提高細(xì)胞分裂速率，而適宜提高溫度則有助于細(xì)胞伸長(zhǎng)，在一定范疇內(nèi)減少培養(yǎng)溫度則使細(xì)胞分裂和生長(zhǎng)速度均減緩，并且使細(xì)胞的質(zhì)量增加。對(duì)大多數(shù)植物組織20～28℃即可滿足生長(zhǎng)所需，其中26～27滲入壓：滲入壓對(duì)植物組織的生長(zhǎng)和分化很有關(guān)系。在培養(yǎng)基中添加食鹽、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物質(zhì)能夠調(diào)節(jié)滲入壓。普通1～2個(gè)大氣壓可增進(jìn)植物組織生長(zhǎng)，2個(gè)大氣壓以上時(shí)，出現(xiàn)生長(zhǎng)障礙，6個(gè)大氣壓時(shí)植物組織即無(wú)法生存。通氣：懸浮培養(yǎng)中細(xì)胞的旺盛生長(zhǎng)必須有良好的通氣條件。小量懸浮培養(yǎng)時(shí)巨常轉(zhuǎn)動(dòng)或振蕩，可起通氣和攪拌作用。大量培養(yǎng)中可采用專門(mén)的通氣和攪拌裝置。PH：普通使用的pH值范疇是5.5～6.5。PH在4.0下列或7.0以上培養(yǎng)物就不能正常生長(zhǎng)。4.（植物）離體（培養(yǎng)）條件下，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素在細(xì)胞分化中的作用。答：激素是離體培養(yǎng)條件下調(diào)控細(xì)胞脫分化和再分化的重要因素，生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素是兩類(lèi)重要的調(diào)控培養(yǎng)條件下細(xì)胞生長(zhǎng)和分化的植物激素。在眾多植物離體培養(yǎng)中證明，細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)素對(duì)于細(xì)胞生長(zhǎng)和分化含有同等重要的協(xié)同作用，它們的數(shù)量與比值的不同配合，對(duì)細(xì)胞分化起著重要調(diào)節(jié)作用。在離體條件下，如果用生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素解決的次序不同，其作用也不同。如果先用生長(zhǎng)素解決，后用細(xì)胞分裂素解決，則有助于細(xì)胞分裂而不利于細(xì)胞分化；反之，則有助于細(xì)胞分化。如果兩者同時(shí)解決，則可促使分化頻率的提高。生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素高，有助于根分化；生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素低，有助于芽分化。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才干再生正常個(gè)體。5.器官發(fā)生的影響因素及調(diào)控機(jī)理。答：植物的離體器官發(fā)生是指培養(yǎng)條件下的組織或細(xì)胞團(tuán)(愈傷組織)分化形成不定根(adventitiousroots)、不定芽(adventitiousshoots)等器官的過(guò)程。器官發(fā)生方式：先芽后根，先根后芽，根芽同時(shí)發(fā)生。器官發(fā)生過(guò)程：通過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生：愈傷組織形成→生長(zhǎng)中心形成→器官原基及器官形成。不通過(guò)愈傷組織的器官發(fā)生：在有些狀況下，外植體不通過(guò)典型的愈傷組織即可形成器官原基，這一途徑有兩種狀況：一是外植體中已存在器官原基，進(jìn)一步培養(yǎng)即形成對(duì)應(yīng)組織器官進(jìn)而再生植株，如莖尖、根尖分生組織培養(yǎng)。另一種狀況是外植體某些部位的細(xì)胞在重新分裂后，直接形成分生細(xì)胞團(tuán)，然后由分生細(xì)胞團(tuán)形成器官原基。（1）起始材料對(duì)器官分化的影響：總體上說(shuō)，被子植物比裸子植物容易培養(yǎng)。在被子植物中又以茄科、秋海棠科、景天科、苦苣苔科以及十字花科植物培養(yǎng)成功的報(bào)道最多。草本植物比木本植物容易培養(yǎng)。普通狀況下，自然繁殖以無(wú)性繁殖為主的植物在培養(yǎng)條件下也有較強(qiáng)的器官分化的能力。同種植物不同品種（基因型）的培養(yǎng)效果含有較大差別已是不爭(zhēng)的事實(shí)。基因型對(duì)于培養(yǎng)反映的差別，器官分化能力的差別不不大于愈傷組織誘導(dǎo)的差別。外植體對(duì)誘導(dǎo)反映及其再生能力的影響還體現(xiàn)在生理狀態(tài)上。來(lái)源于生長(zhǎng)活躍或生長(zhǎng)潛力大的組織、器官的細(xì)胞更有助于培養(yǎng)。對(duì)于數(shù)年生植物而言，以幼嫩組織為材料無(wú)論是誘導(dǎo)還是分化均較容易。一、二年生無(wú)性繁殖植物的取材則可塑性較大，但仍以自然繁殖器官為外植體更易成。外植體選用合理與否，不僅影響培養(yǎng)的難易，并且有時(shí)甚至影響分化的程度和器官類(lèi)型。（2）激素對(duì)器官發(fā)生的影響：離體培養(yǎng)下的器官分化在大多數(shù)狀況下是通過(guò)外源提供適宜的植物激素而實(shí)現(xiàn)的。在眾多的植物激素中，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素是兩類(lèi)重要的植物激素，在離體器官分化調(diào)控中占有主導(dǎo)地位。GA3，Eth，ABA在器官分化中也含有一定調(diào)控作用。生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素高，有助于根分化；生長(zhǎng)素/細(xì)胞分裂素低，有助于芽分化。生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素必須協(xié)調(diào)使用才干再生正常個(gè)體。（3）光照對(duì)器官分化的影響：光照是離體培養(yǎng)中比較復(fù)雜的調(diào)節(jié)因子，光照時(shí)間、光照強(qiáng)度以及光質(zhì)對(duì)器官分化都有影響。持續(xù)的光照有助于培養(yǎng)細(xì)胞維管組織的形成，而一定的晝夜光照周期則有助于極性建立和形態(tài)發(fā)生。培養(yǎng)條件下，光照的作用更大程度上是調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化狀態(tài)，而不是合成光合產(chǎn)物。光照對(duì)器官發(fā)生的調(diào)節(jié)可能與調(diào)節(jié)培養(yǎng)物的內(nèi)源激素平衡有關(guān)，光照還可能影響生長(zhǎng)素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸，從而引發(fā)器官分化。光質(zhì)對(duì)器官分化的影響可能與光受體精確調(diào)節(jié)系統(tǒng)有關(guān)。（4）基因調(diào)控對(duì)器官分化的影響：Banno等()從擬南芥根培養(yǎng)再生芽的體系中克隆了一種增強(qiáng)芽再生能力的基因ESR1，將該基因與35S啟動(dòng)子連接轉(zhuǎn)化擬南芥，在有細(xì)胞分裂素存在的狀況下轉(zhuǎn)基因外植體能夠明顯提高不定芽的分化率。生長(zhǎng)素不能誘導(dǎo)該基因體現(xiàn)，也不能提高不定芽分化頻率。6.影響體細(xì)胞胚形成的因素及調(diào)控。答：體細(xì)胞胚從外植體上直接發(fā)生；通過(guò)愈傷組織的體細(xì)胞胚形成；通過(guò)懸浮細(xì)胞的體細(xì)胞胚形成。（1）激素的調(diào)控作用：2,4-D是應(yīng)用最為廣泛的生長(zhǎng)素。2,4-D的應(yīng)用有規(guī)律性的變化，首先是在較高濃度下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的形成，然后在減少2,4-D的濃度下產(chǎn)生早期胚胎，普通在球形胚形成后，除去生長(zhǎng)素有助于體細(xì)胞胚的繼續(xù)發(fā)育。細(xì)胞分裂素對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)育的影響研究報(bào)道較少，但幾乎全部的有關(guān)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的培養(yǎng)基配方中，都有細(xì)胞分裂素的配合使用。細(xì)胞分裂素在增進(jìn)細(xì)胞分裂，維持細(xì)胞活躍生長(zhǎng)中含有重要生理功效，而完畢體細(xì)胞胚胎發(fā)育細(xì)胞分裂是基本前體，當(dāng)胚胎構(gòu)造建立后，細(xì)胞分裂素對(duì)于維持分生組織正常發(fā)育含有重要作用。（2）培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件的影響：培培養(yǎng)基中的氮源亦會(huì)明顯影響離體條件下的胚胎發(fā)生，某些氨基酸能夠替代還原態(tài)氮的作用。某些體細(xì)胞胚規(guī)模生產(chǎn)模式的實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，球形胚形成后，如果減少培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽濃度，能夠明顯增進(jìn)體細(xì)胞胚的進(jìn)一步發(fā)育。某些實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，體細(xì)胞胚發(fā)育后期減少蔗糖濃度，也有助于胚的繼續(xù)發(fā)育和提高體細(xì)胞胚的成苗率。（3）基因型的影響。7.從細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制上理解，體細(xì)胞無(wú)性系變異的機(jī)制。答：體細(xì)胞變異的細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)：DNA核內(nèi)重復(fù)復(fù)制：DNA重復(fù)復(fù)制但不發(fā)生細(xì)胞分裂，其成果是染色體組數(shù)增加，形成同源多倍體。如果這種DNA重復(fù)復(fù)制多次發(fā)生，細(xì)胞內(nèi)DNA含量就會(huì)不停上升。染色體斷裂與重組：染色體構(gòu)造變異是體細(xì)胞變異的另一重要類(lèi)型。染色體斷裂與重組是離體培養(yǎng)中染色體構(gòu)造變異的重要因素之一，也是體細(xì)胞變異中經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn)象，其細(xì)胞學(xué)特性是分裂中期出現(xiàn)斷裂的染色體片段、落后染色體以及染色體橋，其成果是在體細(xì)胞中出現(xiàn)染色體易位、缺失、倒位等多個(gè)類(lèi)型的構(gòu)造變異。產(chǎn)生染色體構(gòu)造變異的再生植株普通生長(zhǎng)不正常，生活力低下，很難長(zhǎng)久生存，因此以保存種質(zhì)資源為目的的離體培養(yǎng)應(yīng)盡量避免這種變異發(fā)生，以免造成基因資源流失。非正常有絲分裂：離體培養(yǎng)中，染色體除了整倍性變異外，還可觀察到大量的非整倍性變異，這種愈傷組織往往分化能力低下，再生植株大多生長(zhǎng)不正常，有性繁殖遺傳穩(wěn)定差。紡錘體形成異常使得有絲分裂不正常是其因素之一。核裂經(jīng)常造成雙核與多核細(xì)胞的出現(xiàn)。體細(xì)胞變異的分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)：基因水平上的變異從根本上講就是DNA水平上的堿基突變或修飾狀態(tài)的變化。堿基突變：堿基突變是指DNA序列中堿基的變化。突變堿基的DNA序列處在構(gòu)造基因的位置或調(diào)控序列的位置時(shí)，即可造成遺傳狀態(tài)的變化。堿基突變是產(chǎn)生體細(xì)胞變異的重要途徑之一。對(duì)于單基因控制的遺傳性狀，大多數(shù)堿基突變能夠穩(wěn)定遺傳并且符合孟德?tīng)栠z傳分離規(guī)律，植物的許多性狀特別是經(jīng)濟(jì)性狀均由多基因控制，對(duì)于多基因控制性狀的堿基突變可能由于技術(shù)上的復(fù)雜性，現(xiàn)在還沒(méi)有有關(guān)多基因控制性狀的堿基突變報(bào)道。DNA序列的選擇性擴(kuò)增與丟失——DNA序列的擴(kuò)增與丟失也是體細(xì)胞無(wú)性系變異的因素之一。轉(zhuǎn)座子活化：上個(gè)世紀(jì)80年代，Larkin和Scowcroft首先提出，轉(zhuǎn)座因子的活化可能是體細(xì)胞無(wú)性系變異的因素之一。DNA甲基化：DNA甲基化在基因體現(xiàn)調(diào)控中含有重要作用。DNA甲基化和去甲基化，不僅能通過(guò)調(diào)控基因的體現(xiàn)與關(guān)閉來(lái)控制生物的發(fā)育，同時(shí)也能夠通過(guò)DNA甲基化途徑來(lái)適應(yīng)環(huán)境對(duì)生物體的壓力。8.體細(xì)胞無(wú)性系變異的誘導(dǎo)和選擇辦法。答：（1）誘變起始材料的選擇：選擇起始材料需考慮下列幾方面的問(wèn)題:其一，目的性狀的可行性。體細(xì)胞突變性狀是個(gè)別的，因此選擇綜合性狀良好的植物品種材料，通過(guò)誘變變化個(gè)別不良性狀是體細(xì)胞突變系選擇的目的。其二，必需充足考慮實(shí)驗(yàn)植物的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)水平。其三，適宜的細(xì)胞類(lèi)型亦是體細(xì)胞突變系篩選效率的重要條件。如原生質(zhì)體、單細(xì)胞、小孢子等有較高的誘變頻率。（2）誘變辦法：物理誘變：X射線、γ射線、快中子、紫外線等。以組織器官為誘導(dǎo)材料，能夠選擇輻射強(qiáng)度較大的γ射線、快中子等進(jìn)行輻射。以細(xì)胞或原生質(zhì)體，則能夠選擇X射線、紫外線等。特別是以原生質(zhì)體為誘導(dǎo)材料時(shí)，能夠使用紫外線照射，由于慣用紫外線的波長(zhǎng)為270nm，與DNA吸取波長(zhǎng)260nm相近，而原生質(zhì)體由于沒(méi)有細(xì)胞壁的屏障，對(duì)紫外線的敏感性較強(qiáng)，從而能夠達(dá)成較好的誘變效果。化學(xué)誘變：慣用的化學(xué)誘變劑重要有：烷化劑（硫酸二乙酯DES、乙基磺酸乙酯EES、甲基黃酸乙酯EMS、環(huán)氧乙烷EO、乙烯亞胺EI），這類(lèi)誘變劑有一種或多個(gè)活化烷基，可與DNA分子中的堿基或磷酸基結(jié)合，變化DNA的構(gòu)造而引發(fā)突變；堿基類(lèi)似物（5－溴尿嘧啶是胸腺嘧啶類(lèi)似物、2－氨基嘌呤是腺嘌呤類(lèi)似物），在細(xì)胞內(nèi)核酸復(fù)制時(shí)，這些類(lèi)似物能夠摻入到新合成的DNA分子中引發(fā)錯(cuò)配；移碼誘變劑，如ICR化合物和吖啶類(lèi)似物等。另外亞硝酸、羥胺等某些抗菌素等亦可引發(fā)突變產(chǎn)生。轉(zhuǎn)座子插入：誘變轉(zhuǎn)座子插入誘變是近年來(lái)運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展起來(lái)的新的體細(xì)胞變異誘導(dǎo)辦法。轉(zhuǎn)座子既可直接將外源基因帶入細(xì)胞內(nèi)獲得新性狀，又能夠獨(dú)立插入通過(guò)其轉(zhuǎn)座功效誘導(dǎo)變異。（3）突變體的選擇：直接選擇：其辦法是用一種含有特定物質(zhì)的選擇培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基上只有突變細(xì)胞能夠生長(zhǎng)，非突變細(xì)胞不能生長(zhǎng)，從而直接篩選出突變體。如抗除草劑、抗鹽堿突變體的篩選，均可直接在培養(yǎng)基中加入一定濃度的除草劑或增加滲入壓的物質(zhì)?，F(xiàn)在采用這一途徑，已從多個(gè)植物中篩選出可運(yùn)用的體細(xì)胞變異體。間接選擇：間接選擇法是一種借助于與突變體現(xiàn)型有關(guān)的性狀作為選擇指標(biāo)的篩選辦法。P54：2，42.細(xì)胞工程研究的消毒滅菌方式【填空】有哪幾個(gè)？如何進(jìn)行培養(yǎng)材料的消毒滅菌？答：a.物理消毒滅菌：干熱、濕熱、過(guò)濾、射線等；化學(xué)消毒滅菌：消毒劑、抗生素等。（1）干熱消毒滅菌法；（2）濕熱消毒滅菌法；（3）過(guò)濾除菌法；（4）射線消毒滅菌法；（5）酒精燈消毒滅菌法；（6）消毒劑消毒法；（7）抗生素抑菌法。b.培養(yǎng)材料的消毒滅菌：采用自然界的實(shí)驗(yàn)材料，攜帶微生物及雜質(zhì)，接種前須進(jìn)行表面消毒滅菌，對(duì)內(nèi)部已受微生物侵染的材料應(yīng)予以裁減。采來(lái)的實(shí)驗(yàn)材料先用流水沖洗10～20min或更長(zhǎng)時(shí)間，然后在一定濃度藥劑中浸泡解決（須在超凈工作臺(tái)上操作），進(jìn)行表面消毒滅菌。所用的藥劑種類(lèi)、濃度、到解決時(shí)間隨植物種類(lèi)和取用的器官部位的不同而異，慣用消毒劑的滅菌效果見(jiàn)表3-2。消毒劑對(duì)植物組織是有毒的，應(yīng)對(duì)的選擇其濃度和解決時(shí)間，減少它對(duì)組織的傷害。通過(guò)滅菌的培養(yǎng)材料，需用無(wú)菌水洗4～5次，瀝去水分待用。4.血清在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中所起的作用是什么？如何判斷無(wú)血清培養(yǎng)基與否適合動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖？答：a.（1）提供對(duì)維持細(xì)胞指數(shù)生長(zhǎng)的激素和氮源；（2）提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素、脂類(lèi)、金屬和其它激素等，能結(jié)合或調(diào)節(jié)它們所結(jié)合的物質(zhì)活力；（3）有些狀況下，結(jié)合蛋白能與有毒金屬和熱原結(jié)合，起到解毒作用；（4）起增進(jìn)細(xì)胞在培養(yǎng)基質(zhì)上附著和鋪開(kāi)的作用；是細(xì)胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子的來(lái)源；（5）起酸堿度緩沖劑的作用；（6）提供蛋白酶克制劑，使細(xì)胞傳代時(shí)使用的胰蛋白酶失活，保護(hù)細(xì)胞不受損傷。b.判斷無(wú)血清培養(yǎng)基與否適合動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，重要看其中有無(wú)替代血清成分的明確的補(bǔ)充成分，能夠有四類(lèi)：激素和生長(zhǎng)因子，結(jié)合蛋白，貼壁和擴(kuò)展因子，微量因素和低分子質(zhì)量的營(yíng)養(yǎng)成分。（通過(guò)觀察細(xì)胞的大小，檢查培養(yǎng)基里的產(chǎn)物，能夠判斷。）P90：4，6，8、4.植物離體無(wú)性繁殖有什么意義？離體無(wú)性繁殖依器官發(fā)生方式不同可分為哪幾個(gè)繁殖類(lèi)型？答：意義：（1）繁殖速度快，經(jīng)濟(jì)效益高；（2）占用空間小，不受季節(jié)限制，便于工廠化育苗；（3）有助于繁殖多個(gè)珍稀、瀕危苗木和突變體，為育種服務(wù)。（能夠有效地保持優(yōu)良品種的特性；快速繁殖新品種，使優(yōu)良品種快速應(yīng)用；生產(chǎn)無(wú)病毒種苗，避免品種退化；節(jié)省耕地，提高農(nóng)產(chǎn)品的商品率；便于運(yùn)輸。）類(lèi)型（方式）：不定芽型，器官型，器官發(fā)生型，胚狀體發(fā)生型，原球莖型。6.植物脫病毒的辦法有哪些？為什么說(shuō)莖尖培養(yǎng)脫病毒的辦法最有效？如何檢測(cè)脫病毒植物？答：a.物理辦法：高溫解決（即熱解決或溫?zé)岑煼ǎ?，低溫解決（冷療法）?；瘜W(xué)辦法；生物辦法：莖尖培養(yǎng)，微體嫁接法，珠心組織培養(yǎng)法，愈傷組織脫毒。b.莖尖幾乎不含病毒，采用旺盛分裂的莖尖組織培養(yǎng)，就有可能去除病毒。此法能與快速離體繁殖相結(jié)合，周期短，效率高。c.直接測(cè)定法，批示植物法，抗血清鑒定法，電鏡檢查法，分子檢測(cè)法。8.運(yùn)用細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物有什么意義？答：（1）次生物質(zhì)的生產(chǎn)是在可控條件下進(jìn)行的，因此能夠通過(guò)變化培養(yǎng)條件和篩選新細(xì)胞系得到超出整株植物產(chǎn)量的代謝產(chǎn)物。不僅能夠節(jié)省資源，并且能夠減少所占用的耕地面積；（2）培養(yǎng)細(xì)胞是在無(wú)菌條件下生長(zhǎng)的，因此能夠排除病菌和蟲(chóng)害的侵?jǐn)_；（3）能夠進(jìn)行特定的生物轉(zhuǎn)化反映；（4）能夠探索新的合成路線和獲得新的有用物質(zhì)。P116：2，3，62.植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)有哪些重要環(huán)節(jié)？答：a.分離辦法：（1）機(jī)械分離法：借助于利器或機(jī)械磨損等方法使細(xì)胞壁破損，促使原生質(zhì)體釋放；（2）酶解分離法：將材料放入能降解細(xì)胞壁的混合等滲酶液中保溫一定時(shí)間，使細(xì)胞壁被降解，獲得有活力的原生質(zhì)體。原生質(zhì)體的分離環(huán)節(jié)見(jiàn)課本P99，P97。b.原生質(zhì)體培養(yǎng)涉及：原生質(zhì)體分離、純化、培養(yǎng)體細(xì)胞壁再生、細(xì)胞團(tuán)形成、器官形成、植株再生等環(huán)節(jié)。原生質(zhì)體在適宜培養(yǎng)基和適宜培養(yǎng)條件下經(jīng)培養(yǎng)2～4d可再生細(xì)胞壁，并很快進(jìn)行細(xì)胞分裂，30～60d出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞團(tuán)，后來(lái)再繼續(xù)分裂增殖，幾個(gè)月后形成愈傷組織或胚狀體，最后形成完整小植株。培養(yǎng)辦法：固體薄層培養(yǎng)法，液體淺層培養(yǎng)法，雙層培養(yǎng)法。3.植物體細(xì)胞融合能夠分為哪幾類(lèi)？它們?cè)谥参镉N中有何意義？答：a.（1）化學(xué)融合：運(yùn)用化學(xué)融合劑，促使原生質(zhì)體互相靠近、粘連融合的辦法。（2）電融合：運(yùn)用變化電場(chǎng)來(lái)誘導(dǎo)原生質(zhì)體彼此連接成串，再施以瞬間脈沖使質(zhì)膜發(fā)生可逆性電擊穿，促使原生質(zhì)體融合的辦法。b.理論上，任何細(xì)胞都有可能通過(guò)體細(xì)胞雜交而成為新的生物資源。這對(duì)于種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)和運(yùn)用品有深遠(yuǎn)的意義。融合過(guò)程不存在有性雜交過(guò)程中的種性隔離機(jī)制的限制，為遠(yuǎn)源物種間的遺傳物質(zhì)交換提供了有效途徑。體細(xì)胞雜交產(chǎn)生的雜種細(xì)胞含有來(lái)自雙親的核外遺傳系統(tǒng)，在雜種的分裂和增殖過(guò)程中雙親的葉綠體、線粒體DNA也可發(fā)生重組，從而產(chǎn)生新的核外遺傳系統(tǒng)。（分為自發(fā)融合和誘發(fā)融合。自發(fā)融合是無(wú)意義的。）6.體細(xì)胞雜種的鑒定辦法有哪幾個(gè)？舉例闡明。答：形態(tài)學(xué)鑒定，細(xì)胞學(xué)鑒定，同功酶鑒定，DNA分子標(biāo)記鑒定。（舉例見(jiàn)課本P112）P131：2，3，82.植物花藥和花粉培養(yǎng)普通涉及哪些環(huán)節(jié)？答：培養(yǎng)材料的選用與制備，植株再生，單倍體植株鑒定和染色體加倍。（花藥培養(yǎng)基本程序：外植體選擇→外植體（花蕾）預(yù)解決→外植體消毒→剝?nèi)』ㄋ帯臃N→誘導(dǎo)培養(yǎng)→分化培養(yǎng)。）3.為什么要對(duì)花藥和花粉培養(yǎng)材料進(jìn)行選擇？如何選擇？答：花藥和花粉培養(yǎng)與其它植物組織培養(yǎng)工作相比，對(duì)供試材料的規(guī)定更加嚴(yán)格，選用適宜材料，做適宜的解決，制備出適宜的初代外植體是獲得成功的第一種重要環(huán)節(jié)?；蛐?、小孢子發(fā)育時(shí)期及生理狀態(tài)等對(duì)花藥和花粉培養(yǎng)效果含有極大影響，因而是材料選擇所要考慮的重要因素?；蛐瓦x擇、花粉發(fā)育時(shí)期的選擇、生理狀態(tài)的選擇。（見(jiàn)課本P119）8.為什么花藥和花粉植株是倍性混合群體？答：a.花藥和花粉植株的倍性與植物的種類(lèi)、接種材料的類(lèi)型、接種花粉的發(fā)育時(shí)期、培養(yǎng)基中的激素種類(lèi)和濃度、花粉植株的發(fā)生方式及愈傷組織繼代培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短等因素有關(guān)。b.花藥植株倍性混雜的因素是體細(xì)胞組織的干擾和生殖細(xì)胞的自發(fā)加倍。（1）體細(xì)胞組織的干擾?；ㄋ帢?gòu)造涉及藥壁、藥隔、藥囊、花粉，花粉又與花絲相連。藥壁、藥隔、花絲都是體細(xì)胞組織，在離體培養(yǎng)條件下也能再生出植株，并且在諸多狀況下比花粉更易誘導(dǎo)生成再生植株，由這些體細(xì)胞再生出的植株普通都是二倍體；（2）生殖細(xì)胞的的自發(fā)加倍，即核內(nèi)有絲分裂不正常，形成不完全的細(xì)胞壁，造成核分裂與細(xì)胞壁形成不同時(shí)而發(fā)生核融合現(xiàn)象，這種再生植株便是二倍體或多倍體。9.如何對(duì)花藥和花粉植株進(jìn)行倍性鑒定？答：辦法：形態(tài)鑒定，結(jié)實(shí)性鑒定，染色體數(shù)目鑒定，遺傳標(biāo)記鑒定（生化標(biāo)記鑒定，分子標(biāo)記鑒定）。（見(jiàn)課本P129）P147：1，4，51.植物胚胎培養(yǎng)包含哪些內(nèi)容？它有哪些方面的應(yīng)用價(jià)值？答：a.植物胚胎培養(yǎng)涉及：幼胚培養(yǎng)，成熟胚培養(yǎng)，胚珠培養(yǎng)，子房培養(yǎng)，胚乳培養(yǎng)，試管受精等內(nèi)容。b.（1）克服遠(yuǎn)緣雜交的不育性，獲稀有雜種植物；（2）打破種子休眠，提早結(jié)實(shí)，縮短育種年限；（3）使生活力低下或無(wú)生活力的種子萌發(fā)；（4）使柑橘類(lèi)植物合子胚正常發(fā)育；（5）測(cè)定種子生活力；（6）獲三倍體或單倍體植株；（7）快速繁殖特殊植物；（8）用于理論研究。4.簡(jiǎn)述離體授粉受精的概念、意義和辦法。答：a.離體授粉指在無(wú)菌條件下，培養(yǎng)未受精子房或胚珠和花粉，使花粉萌發(fā)進(jìn)入胚珠，完畢受精作用。因全過(guò)程，即從花粉萌發(fā)到精卵細(xì)胞融合受精形成種子，直到種子萌發(fā)產(chǎn)生幼苗，均在試管內(nèi)完畢，也稱為離體受精或植物生殖工程。b.該技術(shù)在育種實(shí)踐上可克服自交不親和性和遠(yuǎn)緣雜交障礙。另外，采用遠(yuǎn)緣花粉授粉可誘導(dǎo)單性生殖產(chǎn)生單倍體植物。試管受精技術(shù)也為外源特異基因的有性轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)遺傳變異開(kāi)辟了一條新途徑。c.（1）收集花粉；（2）剝?nèi)∽臃亢团咧椋唬?）離體受精辦法（子房試管授粉：直接引入法，注射法；胚珠試管授粉：哺育法，靠近法）。5.什么是人工種子？它有哪些優(yōu)越性與局限性？答：a.人工種子指植物離體培養(yǎng)中產(chǎn)生的胚狀體或不定芽包裹在含有養(yǎng)分和保護(hù)功效的人工胚乳和人工中皮中所形成的能發(fā)芽出苗的顆粒體。b.優(yōu)越性：人工種子的意義：（1）人工種子構(gòu)造完整，體積小，便于貯藏與運(yùn)輸，可直接播種，易于機(jī)械化操作；（2）不受季節(jié)限制，不受環(huán)境制約，胚狀體數(shù)量多、繁殖快、有助于工廠化生產(chǎn)；（3）有助于繁殖生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、自交不親和、貴重稀有的某些植物，也可大量繁殖無(wú)病毒材料；（4）可在人工種子中加入抗生素、菌肥、農(nóng)藥等成分，提高種子活力和品質(zhì)；（5）體細(xì)胞胚由無(wú)性繁殖體系產(chǎn)生，能夠固定雜種優(yōu)勢(shì)。局限性：人工種子存在種皮的缺點(diǎn)，有菌條件下發(fā)芽率低，貯藏難，生產(chǎn)成本高，制作流程復(fù)雜等問(wèn)題。P157：2，3，42.植物離體保存的種類(lèi)有哪些？你對(duì)多個(gè)保存類(lèi)型是如何評(píng)價(jià)的？答：低溫保存，超低溫保存，生長(zhǎng)克制劑保存。（見(jiàn)課本P157）3.植物超低溫保存的原理是什么？如何進(jìn)行離體材料的超低溫保存？答：見(jiàn)P151超低溫保存原理。（在冰凍過(guò)程中避免了細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，并且在解凍過(guò)程中避免細(xì)胞內(nèi)水分的次生結(jié)冰而達(dá)成植物材料保存的目的。）a.低溫冰凍過(guò)程中，如果生物細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，細(xì)胞構(gòu)造就遭到不可逆的破壞，造成細(xì)胞和組織死亡。植物材料在超低溫條件下之因此能夠長(zhǎng)久保存并能在離開(kāi)保存環(huán)境后正常進(jìn)行細(xì)胞分裂和分化就是在冰凍過(guò)程中避免了細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，并且在解凍過(guò)程中避免細(xì)胞內(nèi)水分的次生結(jié)冰而達(dá)成植物材料保存目的。植物細(xì)胞含水量比動(dòng)物細(xì)胞高，冰凍保存難度大，如果直接將保存材料投放到液氮中，細(xì)胞和組織由于細(xì)胞內(nèi)水分結(jié)冰，引發(fā)組織和細(xì)胞死亡。可見(jiàn)，超低溫保存的植物材必須借助于冷凍防護(hù)劑。冷凍防護(hù)劑屬于分子質(zhì)量低的中性物質(zhì)，如甘油、脯氨酸、二甲基亞砜（DMSO）等，在水溶液中能強(qiáng)烈地結(jié)合水分子，水合作用的成果使溶液的黏稠度增加。當(dāng)溫度下降時(shí)，溶液冰點(diǎn)下降，水固化程度削弱，對(duì)減少培養(yǎng)基、植物組織、細(xì)胞的冰點(diǎn)起重要作用。特別是DMSO的發(fā)現(xiàn)，使植物種質(zhì)在超低溫環(huán)境中得以保存，由于它極易滲入細(xì)胞內(nèi)部，避免細(xì)胞冰凍或融凍時(shí)引發(fā)過(guò)分脫水而遭到破壞，保護(hù)細(xì)胞。另外，冷凍保護(hù)劑的使用能夠提高培養(yǎng)基滲入壓，造成細(xì)胞輕微質(zhì)壁分離，提高組織和細(xì)胞的抗寒力。b.超低溫保存的基本程序：預(yù)解決、冷凍解決、冷凍貯存、解凍和再培養(yǎng)。4.影響植物超低溫保存效果的因素有哪些？如何使離體材料獲得比較滿意的保存效果？答：a.影響因素：預(yù)解決辦法、冷凍辦法、解凍辦法對(duì)植物材料冷凍保存效果產(chǎn)生重要影響，尚有某些其它因素，如：植物材料的性質(zhì)，冷凍防護(hù)劑。b.綜合考慮實(shí)驗(yàn)規(guī)定、經(jīng)濟(jì)條件等多個(gè)因素選擇適宜的實(shí)驗(yàn)辦法，特別要注意的是不同性質(zhì)的保存材料應(yīng)選擇對(duì)應(yīng)的保存方法，如胚狀體材料以幼齡球形胚為佳、幼苗和成長(zhǎng)植株以莖尖組織為佳；冷凍防護(hù)劑在一段時(shí)間內(nèi)逐步加入。P207：1，6，7，91.試述動(dòng)物細(xì)胞原代和傳代培養(yǎng)辦法。答：a.原代培養(yǎng)辦法：（1）組織塊接種培養(yǎng)法：無(wú)菌條件下，從有機(jī)體內(nèi)取出組織，用平衡鹽溶液漂洗多次，洗去血污，并剔除多出成分；剪成1mm3大小的組織小塊；均勻接種于培養(yǎng)瓶底部，采用薄層培養(yǎng)法或翻轉(zhuǎn)干涸法使組織小塊貼壁。（2）酶解培養(yǎng)法：無(wú)菌條件下，從有機(jī)體內(nèi)取出組織，用平衡鹽溶液漂洗多次，洗去血污，并剔除多出成分；剪成1mm3大小的組織小塊；用胰蛋白酶或膠原酶溶液消化；將制備成的單細(xì)胞懸液，接種到培養(yǎng)基中培養(yǎng)；數(shù)天后，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，并鋪滿培養(yǎng)瓶底部，形成細(xì)胞單層。（3）魚(yú)類(lèi)細(xì)胞組織塊原代培養(yǎng)。（4）哺乳動(dòng)物和鳥(niǎo)類(lèi)的原代培養(yǎng)。【原代培養(yǎng)：（1）組織塊接種培養(yǎng)：直接切割分離的組織塊，在一定程度上保持了原有的組織構(gòu)造，對(duì)于早期體外培養(yǎng)的環(huán)境適應(yīng)性比直接分離成單細(xì)胞要強(qiáng)，因此，短期組織塊培養(yǎng)成為動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的材料來(lái)源之一。（2）單層細(xì)胞培養(yǎng)：更換培養(yǎng)基容易，便于觀察不同條件對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，從而靈活調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件；培養(yǎng)后期容易使用灌注技術(shù)改善營(yíng)養(yǎng)條件；細(xì)胞貼附于基底質(zhì)上，更容易體現(xiàn)產(chǎn)物。（3）懸浮細(xì)胞培養(yǎng)：合用細(xì)胞含有非貼壁特性的細(xì)胞，如血細(xì)胞、腹水細(xì)胞等，或者通過(guò)機(jī)械攪拌和振蕩能夠較好地維持懸浮狀態(tài)的細(xì)胞?！縝.傳代培養(yǎng)辦法：（1）貼壁培養(yǎng)：原代培養(yǎng)物或傳代細(xì)胞形成細(xì)胞單層后，倒掉舊培養(yǎng)液；用PBS或PE洗細(xì)胞單層1～2次，以洗去死細(xì)胞和殘存的培養(yǎng)液；加入適量的0.25%的胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞單層，制備單細(xì)胞懸液；取1/2懸液接種于另一培養(yǎng)瓶，分別補(bǔ)加培養(yǎng)液后，于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。（2）懸浮培養(yǎng)：非貼壁依賴性細(xì)胞，如血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等，可用此法進(jìn)行培養(yǎng)。但動(dòng)物細(xì)胞無(wú)細(xì)胞壁保護(hù)，不能耐受激烈的攪拌和通氣，因此動(dòng)物細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)與微生物發(fā)酵又大不相似。實(shí)驗(yàn)室懸浮培養(yǎng)可在配有磁力攪拌的三角燒瓶?jī)?nèi)進(jìn)行，或?qū)⑷瞧繜旁趽u床上進(jìn)行。傳代時(shí)，只需離心去掉舊培養(yǎng)液，換上新培養(yǎng)液即可。6.體外培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線有何特點(diǎn)？細(xì)胞系的演化過(guò)程是如何的？如何理解體外培養(yǎng)細(xì)胞的去分化現(xiàn)象？答：a.生長(zhǎng)曲線普通分為潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)久、平臺(tái)期和衰退期四個(gè)時(shí)期。（1）潛伏期：細(xì)胞有生長(zhǎng)活動(dòng)而無(wú)細(xì)胞分裂，是細(xì)胞分裂前的準(zhǔn)備時(shí)期。首先細(xì)胞逐步適應(yīng)新的環(huán)境，另首先，細(xì)胞不停積累分裂增殖所需要的某些物質(zhì)，使之達(dá)成一定的濃度，方便使細(xì)胞能夠跨入分裂期。（2）指數(shù)生長(zhǎng)久：細(xì)胞數(shù)目成倍增加，細(xì)胞活力最佳，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究普通選擇此期細(xì)胞。（3）平臺(tái)期：接觸克制即當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底，形成持續(xù)性細(xì)胞單層后，細(xì)胞就不再分裂而停止增殖。在平臺(tái)期，即使細(xì)胞仍能存活一段時(shí)間，但如果不及時(shí)傳代，就會(huì)影響細(xì)胞活力。（4）衰退期：平臺(tái)期后，由于沒(méi)有及時(shí)傳代，培養(yǎng)液中得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)耗盡，代謝廢物累積，pH減少，使細(xì)胞發(fā)生中毒性變化，甚至脫落死亡。b.細(xì)胞系的演化是指細(xì)胞系從原代培養(yǎng)開(kāi)始直至衰老死亡的整個(gè)生命歷程。可分為三個(gè)階段：原代培養(yǎng)階段，有限細(xì)胞系階段和持續(xù)培養(yǎng)系或衰老死亡階段。c.終末分化細(xì)胞失去分裂增殖能力，獲得特異分化性質(zhì)，執(zhí)行特定分化功效，如肌肉細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、表皮細(xì)胞等。在體內(nèi)生長(zhǎng)環(huán)境下，這些分化細(xì)胞的分化狀態(tài)是穩(wěn)定的、不可逆的。但是這些終末分化細(xì)胞在體外人工環(huán)境下，往往能夠獲得分裂增殖的能力，有些細(xì)胞還會(huì)失去其特異分化性質(zhì)，如肝細(xì)胞失去精氨酸酶活性，不能貯存糖原，不能分泌血清蛋白，甚至通過(guò)誘導(dǎo)也不能再現(xiàn)，這種現(xiàn)象稱為體外培養(yǎng)細(xì)胞的去分化。去分化的因素可能是由于缺少適宜的誘導(dǎo)環(huán)境，使細(xì)胞不能體現(xiàn)分化特性，加上細(xì)胞對(duì)體外環(huán)境的不適應(yīng)而發(fā)生了變化。7.對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)檢查重要有哪幾方面內(nèi)容？如何判斷和排除微生物污染、病毒污染、化學(xué)污染和交叉污染？（P194）答：a.檢查：培養(yǎng)液pH，細(xì)胞健康狀況，微生物污染及其排除（細(xì)菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染），細(xì)胞交叉污染，化學(xué)物質(zhì)污染。b.細(xì)菌污染較輕的，培養(yǎng)液仍清亮，但細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢；污染嚴(yán)重時(shí)，培養(yǎng)液變渾濁。排除污染辦法：向培養(yǎng)液中加入5～10倍慣用劑量的抗生素，沖擊細(xì)胞24～48h，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入正常培養(yǎng)液。真菌（霉菌）污染肉眼可見(jiàn)到白色，黃色或黑色的菌落，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)到絲狀、樹(shù)枝狀或瘤狀的菌絲，縱橫交錯(cuò)，穿行于細(xì)胞之間。支原體污染需采用專一性的辦法鑒別，如DNA熒光染色法、支原體培養(yǎng)法、免疫學(xué)辦法、PCR等。排除污染辦法：抗生素解決，特異性抗血清解決，高熱解決，巨噬細(xì)胞和抗生素聯(lián)合解決，鼠的傳代解決。病毒污染細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）如蝕斑，可作為早期檢測(cè)病毒污染的批示特性。細(xì)胞交叉污染：實(shí)驗(yàn)器材如吸管最佳用一次即更換，絕不能用帶有細(xì)胞的吸管吸公共培養(yǎng)液?；瘜W(xué)物質(zhì)污染：只要培養(yǎng)器皿洗滌干凈，培養(yǎng)用液來(lái)源可靠，很容易避免。9.為什么要對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行凍存？試述細(xì)胞的非玻璃化凍存和玻璃化凍存的原理和辦法。答：a.之因此要低溫凍存動(dòng)物細(xì)胞，是由于體外長(zhǎng)久傳代培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞耗時(shí)費(fèi)力費(fèi)材料，且容易受微生物污染，并且傳代過(guò)程中細(xì)胞的遺傳性狀也可能會(huì)發(fā)生變化。低溫條件下，細(xì)胞的一切代謝活動(dòng)都停止或極其緩慢，從而避免細(xì)胞遺傳形狀的變化和衰老。b.非玻璃化凍存：原理：冰晶損傷和溶質(zhì)損傷，緩慢冷凍和快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞以及冷凍保護(hù)劑的作用。辦法：相對(duì)緩慢降溫，快速融凍（冷凍環(huán)節(jié)，復(fù)蘇環(huán)節(jié)）。（見(jiàn)課本P197）玻璃化凍存：原理：辦法：冷凍環(huán)節(jié)，復(fù)蘇環(huán)節(jié)。（見(jiàn)課本P199）P222：4，64.試述細(xì)胞融合的原理以及雜交細(xì)胞的篩選辦法。答：a.細(xì)胞融合的基本過(guò)程：（1）細(xì)胞在誘融劑或正弦電場(chǎng)作用下凝集、彼此靠近；（2）兩個(gè)相鄰細(xì)胞間的質(zhì)膜互相融合，隨即兩個(gè)親本細(xì)胞質(zhì)膜上的受體、糖蛋白、糖脂等質(zhì)膜成分也在融合后的質(zhì)膜上重新分布；（3）細(xì)胞質(zhì)發(fā)生融合；（4）細(xì)胞核融合，形成單核融合細(xì)胞。b.雜交細(xì)胞的篩選辦法：非選擇性篩選：用機(jī)械辦法把單個(gè)雜交細(xì)胞挑選出來(lái)，讓其分裂繁殖，培養(yǎng)出細(xì)胞克隆。也稱單細(xì)胞克隆。選擇性篩選：根據(jù)細(xì)胞對(duì)藥品的抗性、營(yíng)養(yǎng)規(guī)定或溫度敏感性等的不同，選擇適宜的培養(yǎng)條件，將雜交細(xì)胞分離出來(lái)?？煞譃榭顾幮院Y選系統(tǒng)、營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型篩選系統(tǒng)、溫度敏感型篩選系統(tǒng)。【a.原理：（1）病毒誘導(dǎo)融合：有許多個(gè)類(lèi)的病毒能介導(dǎo)細(xì)胞融合，最慣用的是滅活的仙臺(tái)病毒（HVJ），為RNA病毒。病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合的過(guò)程有：首先是細(xì)胞表面吸附許多病毒粒子，接著細(xì)胞發(fā)生凝集，幾分鐘至幾十分鐘后，病毒粒子從細(xì)胞表面消失，而就在這個(gè)部位鄰接的細(xì)胞的細(xì)胞膜融合，胞漿互相交流，最后形成融合細(xì)胞。（2）化學(xué)融合劑誘導(dǎo)融合：化學(xué)融合劑重要有高級(jí)脂肪酸衍生物、脂質(zhì)體、鈣離子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白質(zhì)和多肽，其中最慣用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于細(xì)胞融合最少有兩方面的作用：①可促使細(xì)胞凝結(jié)；②破壞互相接觸處的細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，從而使互相接觸的細(xì)胞膜之間發(fā)生融合，進(jìn)而細(xì)胞質(zhì)溝通，形成一種打的雙核或多核融合細(xì)胞。（3）電融合：是指細(xì)胞在電場(chǎng)中極化成偶極子，并沿著電力線排列成串，然后用高強(qiáng)度、短時(shí)程的電脈沖擊穿細(xì)胞膜而造成細(xì)胞融合。】6.試述雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體的原理和技術(shù)過(guò)程。答：a.正常的B淋巴細(xì)胞不能在體外條件下長(zhǎng)久生存，因而不能在體外持續(xù)產(chǎn)生抗體。而骨髓瘤細(xì)胞能夠在體外快速生長(zhǎng)但不能分泌抗體。將骨髓瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進(jìn)行融合，獲得雜交瘤細(xì)胞，既能在體外長(zhǎng)久生存又能分泌抗體?！驹恚弘s交瘤技術(shù)的基本原理是用分泌抗體但不能長(zhǎng)久培養(yǎng)的B細(xì)胞與能在體外長(zhǎng)久培養(yǎng)并可低溫保存的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行雜交。篩選得到的雜交瘤細(xì)胞應(yīng)當(dāng)是既能分泌抗體又有瘤細(xì)胞的特性，可長(zhǎng)久傳代培養(yǎng)，又可在液氮中保存的細(xì)胞。把這些細(xì)胞單克隆化，用單克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體的生產(chǎn)?！縝.技術(shù)過(guò)程：（1）親本細(xì)胞的準(zhǔn)備：=1\*GB3①致敏B淋巴細(xì)胞的準(zhǔn)備：免疫用的目的抗原是多個(gè)病毒、細(xì)菌、癌細(xì)胞等。采用小鼠腹腔或皮下注射，每隔3～4d注射一次，持續(xù)3～4周后，檢查抗體滴度效價(jià)。若符合規(guī)定，再由尾靜脈作最后一次加強(qiáng)免疫，4～5d后，取脾臟分離B淋巴細(xì)胞備用。=2\*GB3②骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備：骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)盡量與B淋巴細(xì)胞來(lái)源相似的種系，并且必須含有代謝缺點(diǎn)特性（HGPRT-或TK-）。另外，還要優(yōu)化骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)條件，使其克隆形成率達(dá)成80%以上。（2）細(xì)胞融合：按一定比例（多為5:1）將B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞混合，并加入PEG誘溶劑誘導(dǎo)細(xì)胞融合。（3）雜交瘤細(xì)胞的篩選：融合后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到HAT培養(yǎng)液中，培養(yǎng)1～2周后，只有雜交瘤細(xì)胞存活并形成細(xì)胞集落。（4）可分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞的篩選：以雜交瘤細(xì)胞生長(zhǎng)孔內(nèi)的上清液為一抗，以放射性核素、酶或熒光素標(biāo)記的兔/羊抗鼠IgG為二抗，運(yùn)用放射性核素測(cè)定、底物顯色或在熒光顯微鏡下觀察熒光顆粒，判斷上清液中與否含有對(duì)應(yīng)的抗體。（5）雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)：有限稀釋法是將稀釋到一定密度的細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板中，盡量使每個(gè)孔只有一種細(xì)胞生長(zhǎng)。軟瓊脂培養(yǎng)法運(yùn)用軟瓊脂半固態(tài)性質(zhì)，使單個(gè)的雜交瘤細(xì)胞在相對(duì)固定的位置上增殖形成細(xì)胞克隆。（6）單克隆抗體的生產(chǎn)和純化：一種是體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞，收集上清液，通過(guò)離子交換、凝膠過(guò)濾等辦法純化得到單克隆抗體。另一種是將雜交瘤細(xì)胞接種到同系小鼠的腹腔中生長(zhǎng)，然后抽取腹水，通過(guò)離子交換、凝膠過(guò)濾等辦法純化得到單克隆抗體?！荆?）抗原制備；（2）免疫動(dòng)物；（3）免疫脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的制備；（4）細(xì)胞融合；（5）雜交瘤細(xì)胞的選擇培養(yǎng)；（6）雜交瘤細(xì)胞的篩選；（7）雜交瘤細(xì)胞的克隆化；（8）單克隆抗體的檢定；（9）分泌單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系的建立；（10）單克隆抗體的大量制備?！縋243：2，82.胚胎移植的生理學(xué)基礎(chǔ)是什么？答：供體與受體的同時(shí)化，胚胎的游離狀態(tài)，胚胎與受體的關(guān)系及胚胎移植中的免疫問(wèn)題。（見(jiàn)課本P224）8.某生產(chǎn)單位有純種母羊100只，欲進(jìn)行胚胎移植工作快速擴(kuò)大繁殖。請(qǐng)